本發(fā)明屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種侏儒蛤的雌核發(fā)育誘導方法。
背景技術(shù)：
人工誘導雌核發(fā)育有利于快速建立純系，因此對于遺傳育種及基礎(chǔ)生物學的研究具有重要意義。在海產(chǎn)經(jīng)濟貝類方面，該領(lǐng)域的研究相對滯后，目前僅在近十種海洋經(jīng)濟貝類中進行了人工誘導雌核發(fā)育的研究。這些研究主要是通過使用各種輻射或化學方法滅活精子，從而誘導卵子的雌核發(fā)育。研究中常用的同源精子滅活法難以排除外源精子基因組的干擾，所以近年來有學者嘗試采用異源精子誘導來消除這種干擾，如在櫛孔扇貝和盤鮑等貝類中的研究。然而，異源精子誘導依賴于物種的特異性，且受多種環(huán)境因素的影響，如精卵的不同成熟度等，另外卵子的激動也往往不同步，而且如果滅活不充分的話，其實仍有精子污染的問題，因此限制了其在雌核發(fā)育中的應用。
與傳統(tǒng)的同源或異源精子誘導法相比，電刺激誘導法在整個過程中不需要精子的參與，能徹底排除外源精子基因組的干擾，是理想的誘導方法。該方法已在兔、豬、鼠和牛等哺乳動物中被廣泛應用并取得了很大的成功。其機制是采用電刺激的方式，使卵母細胞膜上形成可逆微孔，緩沖液中的鈣離子順細胞內(nèi)外的濃度梯度而進入卵胞質(zhì)，引發(fā)鈣庫釋放鈣離子或者胞質(zhì)鈣離子的迅速轉(zhuǎn)移，從而模擬正常受精時鈣離子規(guī)律性的波動現(xiàn)象啟動卵子發(fā)育。但迄今為止，該方法在海洋生物雌核發(fā)育研究中，尚無報道。本研究首次嘗試采用電刺激法誘導侏儒蛤雌核發(fā)育，對其誘導參數(shù)及雌核發(fā)育過程中的細胞學機制進行初步探索，旨在建立電刺激誘導侏儒蛤雌核發(fā)育的技術(shù)方法。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
針對上述問題，本發(fā)明旨在建立電刺激誘導侏儒蛤雌核發(fā)育的技術(shù)方法。
一種侏儒蛤的雌核發(fā)育誘導方法，采用電刺激法，電刺激前先將卵子移入電刺激緩沖液中平衡2min,調(diào)好電脈沖儀參數(shù)，用吸管吸取1ml卵子放入電擊杯中，即可進行電刺激處理；
所述電刺激緩沖液為甘露醇緩沖液，具體成分為：0.05mmol/lcacl2，0.1mmol/lmgcl2，0.5mmol/lhepes，1%bsa，0.25mmol/l甘露醇；
所述電脈沖儀參數(shù)為場強1.8kv/cm，電容5μf，2次電脈沖。
所述電刺激時的卵子密度為10×104個/ml。
電刺激后卵子及胚胎的培養(yǎng)方法為：經(jīng)電刺激后的卵子被放入直徑15cm培養(yǎng)皿中，用高溫蒸煮的過濾海水培養(yǎng)，水溫保持20℃，培養(yǎng)密度為每個培養(yǎng)皿中每升約2×105個卵子；培養(yǎng)初期每半小時輕輕攪動海水一次，以后每3~4h攪動一次，以促進其孵化。
電刺激處理后2小時統(tǒng)計各組的卵裂率，24小時統(tǒng)計胚胎存活率；
卵裂率或雌核發(fā)育誘導率=發(fā)生卵裂和排放極體的卵數(shù)/觀察總卵數(shù)×100%；
胚胎存活率=上浮的原腸胚數(shù)量/發(fā)生卵裂的總卵數(shù)×100%。
本發(fā)明的方法簡單有效，經(jīng)電刺激誘導后，侏儒蛤的卵裂率可達到28%以上，胚胎存活率可達到98%以上。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。
親本的暫養(yǎng)與精卵的收集
侏儒蛤取回后洗刷干凈，暫養(yǎng)于14℃循環(huán)海水中，雌雄個體分開暫養(yǎng)。投喂餌料。暫養(yǎng)期間每天升溫1℃，至16~17℃恒溫待產(chǎn)。采用陰干升溫法催產(chǎn)獲得卵子，具體操作如下：挑選性腺飽滿的成熟雌貝，洗刷干凈后陰干50min，然后將其放入水桶中，在20℃海水中催產(chǎn)。待卵子產(chǎn)出后，先用300目篩絹過濾卵子，然后用500目的篩絹過濾收集卵子，稀釋后顯微鏡下觀察定量卵子的密度。根據(jù)實驗需要調(diào)整卵子的密度。采用同樣的方法催產(chǎn)雄貝，獲得精子，精卵受精時，調(diào)節(jié)好精卵的比例。
侏儒蛤卵子的電刺激處理
卵子雌核發(fā)育的誘導：采用電刺激法，電刺激前先將卵子移入電刺激緩沖液中平衡2min,調(diào)好電脈沖儀參數(shù)，用吸管吸取1ml卵子放入電擊杯中，即可進行電刺激處理。
所述電刺激緩沖液為甘露醇緩沖液，具體成分為：0.05mmol/lcacl2，0.1mmol/lmgcl2，0.5mmol/lhepes，1%bsa，0.25mmol/l甘露醇。
所述電脈沖儀參數(shù)為場強1.8kv/cm，電容5μf，2次電脈沖。
所述電刺激時的卵子密度為10×104個/ml。
電刺激后卵子及胚胎的培養(yǎng)
經(jīng)電刺激后的卵子被放入直徑15cm培養(yǎng)皿中，用高溫蒸煮的過濾海水培養(yǎng)，水溫保持20℃，培養(yǎng)密度為每個培養(yǎng)皿中每升約2×105個卵子；培養(yǎng)初期每半小時輕輕攪動海水一次，以后每3~4h攪動一次，以促進其孵化。
電刺激處理后2小時統(tǒng)計各組的卵裂率，24小時統(tǒng)計胚胎存活率。
卵裂率或雌核發(fā)育誘導率=發(fā)生卵裂和排放極體的卵數(shù)/觀察總卵數(shù)×100%
胚胎存活率=上浮的原腸胚數(shù)量/發(fā)生卵裂的總卵數(shù)×100%
經(jīng)統(tǒng)計，上述電刺激誘導后，侏儒蛤的卵裂率為28.19%，胚胎存活率為98.52%。