本申請主張2014年4月8日申請的第61/976,918號美國臨時申請和2014年9月8日申請的第62/047,570號美國臨時申請的權(quán)益，所述兩個申請的全文以引用的方式并入本文中。

關(guān)于聯(lián)邦政府資助研究的聲明

本發(fā)明是在美國政府支持下依據(jù)國家衛(wèi)生研究院(NIH)授權(quán)號R21 GM103459而進(jìn)行。

背景技術(shù)：

基于二元是或否響應(yīng)的計數(shù)而進(jìn)行測量的數(shù)字檢定由于其穩(wěn)健性、敏感性和準(zhǔn)確性而在生物學(xué)中越來越重要。模擬測量常常需要使用現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行校準(zhǔn)，而數(shù)字測量不需要校準(zhǔn)，且相比于模擬方法具有更快、更易于實施、更準(zhǔn)確且更穩(wěn)健的潛力。

數(shù)字檢定的重要應(yīng)用是樣本中的DNA或RNA的準(zhǔn)確檢測和測量。用以檢測樣本中的DNA的最常用的方法是聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，其中在由DNA聚合酶催化的溫度敏感反應(yīng)中擴增DNA。在PCR中，通常由熱循環(huán)裝置使樣本在范圍為從約60℃到約95℃的兩個或三個溫度之間循環(huán)。使用PCR來擴增DNA已極大地推進(jìn)了從基礎(chǔ)生物學(xué)到臨床診斷學(xué)和法醫(yī)學(xué)的廣泛范圍的學(xué)科。常常用于診斷學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究中的一種特定形式的PCR是定量PCR(qPCR)，其不僅檢測DNA在樣本中的存在，而且提供DNA濃度的準(zhǔn)確量度。

用于進(jìn)行qPCR的最常用的方法是實時PCR，其中從擴增過程的時間演化來推斷樣本的絕對濃度，其在熱循環(huán)過程期間使用特定地辨識擴增產(chǎn)物的熒光探測劑(例如，分子信標(biāo)或Taqman探測劑)予以反復(fù)地監(jiān)測。

實時PCR易遭受各種誤差，包含非想要的引物二聚體的形成，其中引物分子由于它們的序列中的互補伸展而彼此附接。結(jié)果，產(chǎn)生了副產(chǎn)物，所述副產(chǎn)物與目標(biāo)元素爭用可用的PCR試劑，因此潛在地抑制目標(biāo)序列的擴增且干擾準(zhǔn)確的量化。目標(biāo)的量化還需要每個循環(huán)的擴增效率的精確知識，且因為增長是呈指數(shù)，所以擴增效率中的微小不確定性(例如，低于閾值檢測水平)將在確定目標(biāo)副本數(shù)目方面引起非常大的誤差。當(dāng)核酸的初始濃度低時或當(dāng)熒光檢測不足夠敏感時，此誤差可變得非常大。因此，盡管實時PCR具有從復(fù)雜樣本識別和量化目標(biāo)DNA的能力，但實時PCR不能夠可靠地且精確地量化低樣本濃度，而例如在病原體檢測或臨床診斷學(xué)中需要可靠地且精確地量化低樣本濃度。

可使用數(shù)字PCR(dPCR)潛在地克服實時PCR準(zhǔn)確地量化低副本數(shù)目DNA的限制。在dPCR中，將含有樣本的體積劃分為較小體積的陣列，使得基于Poisson統(tǒng)計，所述體積中的至少一些體積不含有目標(biāo)DNA，而其余體積可含有一或多個目標(biāo)分子。隨后在較小體積的陣列中同時地實行DNA擴增，從而引起僅在擴增之前含有一或多個目標(biāo)分子的那些體積中增加熒光(或其他信號)?？赏ㄟ^知曉所述體積以及與井的總數(shù)目相比較具有增加的信號的井(即，含有經(jīng)擴增DNA的井)的數(shù)目來容易地且準(zhǔn)確地確定DNA副本數(shù)目。

大多數(shù)現(xiàn)有數(shù)字檢定依賴于從不變大小的體積(例如，單分散小滴乳劑)獲得的二元響應(yīng)的計數(shù)。雖然微流體系統(tǒng)的進(jìn)步已使能夠產(chǎn)生單分散小滴乳劑，但這些系統(tǒng)在技術(shù)上困難，從而與常規(guī)的模擬方法相比較引起針對終端用戶的時間和成本增加。

在給出例如實時PCR等模擬檢定中固有的限制以及現(xiàn)有數(shù)字檢定的技術(shù)困難的情況下，顯然需要提供用于執(zhí)行數(shù)字檢定的改進(jìn)式方法和設(shè)備。本文中所描述的本發(fā)明解決此需要和其他需要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本公開提供用于執(zhí)行數(shù)字檢定的方法、系統(tǒng)、組合物和套件。本公開部分地涉及驚人發(fā)現(xiàn)的數(shù)字檢定，其可在含有多分散小滴的系統(tǒng)中執(zhí)行而不會引入過度的實驗誤差。

在各種方面中，本發(fā)明的方法、系統(tǒng)、組合物和套件可用于執(zhí)行涉及核苷酸樣本的擴增的數(shù)字PCR檢定。

在各種方面中，本公開提供用于執(zhí)行數(shù)字檢定的方法，其包括：產(chǎn)生多個多分散小滴，其中所述小滴中的至少一些小滴包括樣本；擴增所述樣本；使用可檢測劑標(biāo)記所述樣本；獲得小滴的圖像棧；從所述圖像棧確定所述小滴的體積；從所述圖像棧確定所述可檢測劑在所述小滴中的存在或不存在；以及基于所述可檢測劑在多個小滴中的所述存在或不存在而確定所述多個小滴中的所述樣本的濃度。

在一些方面中，本公開提供用于執(zhí)行數(shù)字檢定的方法，其包括：產(chǎn)生多個多分散小滴，其中所述小滴中的至少一些小滴包括樣本；擴增所述樣本；使用可檢測劑標(biāo)記所述樣本；使所述多個多分散小滴流動穿過流式細(xì)胞儀通道；隨著小滴流動穿過所述流式細(xì)胞儀通道而確定所述小滴的體積；確定所述可檢測劑在所述小滴中的存在或不存在；以及基于所述可檢測劑在多個小滴中的所述存在或不存在而確定所述多個小滴中的所述樣本的濃度。

在各種方面中，本公開提供用于執(zhí)行數(shù)字檢定的組合物和套件，其包括：第一流體；第二流體，其中所述第一流體和所述第二流體彼此不混溶且能夠在被物理地攪拌時形成乳劑；表面活性劑；以及擴增試劑。

在各種方面中，本公開提供用于使用雙面乳劑執(zhí)行數(shù)字檢定的方法、組合物和套件。在一些方面中，所述雙面乳劑包括兩個水相和一油相。

在各種方面中，本公開提供用于執(zhí)行數(shù)字檢定的方法?？僧a(chǎn)生多個多分散小滴。所述小滴中的至少一些小滴可包括樣本?？蓴U增所述樣本?？墒褂每蓹z測劑標(biāo)記所述樣本。可獲得小滴的圖像棧?？蓮乃鰣D像棧確定所述小滴的體積?？蓮乃鰣D像棧確定所述可檢測劑在所述小滴中的存在或不存在?？苫谒隹蓹z測劑在所述多個小滴中的所述存在或不存在而確定所述多個小滴中的所述樣本的濃度。

在各種方面中，本公開提供用于執(zhí)行數(shù)字檢定的方法。可產(chǎn)生多個多分散小滴。所述小滴中的至少一些小滴可包括樣本?？蓴U增所述樣本?？墒褂每蓹z測劑標(biāo)記所述樣本。可使所述多個多分散小滴流動穿過流式細(xì)胞儀通道?？呻S著小滴流動穿過所述流式細(xì)胞儀通道而確定所述小滴的體積。可確定所述可檢測劑在所述小滴中的存在或不存在。可基于所述可檢測劑在所述多個多分散小滴中的所述存在或不存在而確定所述多個小滴中的所述樣本的濃度。在一些方面中，可通過檢測從所述小滴散射的光來確定所述小滴的大小?？苫谒鲂〉蔚乃龃笮』虼笮》植级_定所述多個多分散小滴中的所述樣本的所述濃度。

在各種方面中，本公開提供用于執(zhí)行數(shù)字檢定的組合物。組合物可包括第一流體、第二流體、表面活性劑，以及擴增試劑。所述第一流體和所述第二流體可彼此不混溶且可能夠在被攪拌時形成乳劑。在一些方面中，所述組合物可進(jìn)一步包括例如核苷酸的樣本，和/或能夠標(biāo)記所述樣本的可檢測劑。

在各種方面中，本公開提供用于確定至少一個小滴的體積的系統(tǒng)。所述系統(tǒng)可包括容器、成像源，以及計算裝置。所述容器可被配置成用于保持所述小滴。所述成像源可被配置成獲得所述容器中的所述小滴的圖像。所述計算裝置可包括處理器和存儲器(例如，非暫時性有形計算機可讀存儲媒體，例如ROM、RAM、閃速存儲器，或類似者)。所述存儲器可存儲一組指令，所述一組指令在由所述處理器執(zhí)行時致使(i)所述成像源獲得所述小滴的圖像棧，以及(ii)所述處理器基于所述所獲得的圖像棧而確定樣本中的所述小滴的所述體積。

在各種方面中，本公開提供用于確定小滴的體積的方法?？色@得所述小滴的圖像棧?？勺R別所述圖像棧的個別圖像中的像素組?？蓪⑺鱿袼亟M識別為對應(yīng)于至少一個小滴的至少一部分。可基于所述對應(yīng)而從所述像素組識別個別小滴?？苫谒鲋辽僖粋€像素組而確定所述所識別的個別小滴的所述體積。至少一個小滴的所述部分可包括單個小滴的一部分、多個小滴的多個部分、整個小滴、多個整個小滴，或其組合。

在各種方面中，本公開提供用于執(zhí)行數(shù)字檢定的系統(tǒng)。所述系統(tǒng)可包括容器、成像源，以及計算裝置。所述容器可被配置成用于保持多個多分散小滴。所述小滴中的至少一些小滴可包括使用可檢測劑標(biāo)記的樣本。所述成像源可被配置成獲得所述容器中保持的所述多個多分散小滴的圖像棧。所述計算裝置可被配置成操作所述成像源。所述計算裝置可包括處理器和存儲器(例如，非暫時性有形計算機可讀存儲媒體，例如ROM、RAM、閃速存儲器，或類似者)。所述存儲器可存儲一組指令，所述一組指令在由所述處理器執(zhí)行時致使(i)所述成像源獲得所述容器中保持的所述多個多分散小滴的所述圖像棧，(ii)所述處理器基于所述所獲得的圖像棧而確定所述多個多分散小滴的體積，(iii)所述處理器確定所述可檢測劑在所述多個多分散小滴中的存在或不存在，以及(iv)所述處理器基于所述可檢測劑在所述多個多分散小滴中的所述存在或不存在以及所述多個多分散小滴的所述體積而確定所述多個小滴中的所述樣本的濃度。

附圖說明

在所附權(quán)利要求書中特定地陳述了本公開的新穎特征。將通過參考陳述供利用本公開的原理的說明性實施例的以下詳細(xì)描述及其附圖而獲得對本公開的特征和優(yōu)點的更好理解，在附圖中：

圖1是使用共聚焦熒光顯微術(shù)獲得的示范性多分散小滴乳劑系統(tǒng)的灰度圖像。

圖2A示意性地說明被配置成分析樣本在多個小滴中的存在或不存在的示范性檢測系統(tǒng)。

圖2B示意性地說明用以分析樣本在多個小滴中的存在和或不存在的示范性檢測方法。

圖2C示意性地說明用以分析樣本在多個小滴中的存在和或不存在的另一示范性檢測方法。

圖2D示意性地說明用以識別體積中的小滴的示范性掃描檢測方法，其可與圖2A的系統(tǒng)一起使用以實施圖2B和圖2A的方法。

圖2E示意性地說明用以識別體積中的小滴的示范性簡單邊界方法，其可與圖2A的系統(tǒng)一起使用以實施圖2B和圖2A的方法。

圖2F示意性地說明用以識別體積中的小滴的示范性反向分水線方法，其可與圖2A的系統(tǒng)一起使用以實施圖2B和圖2A的方法。

圖2G示意性地說明用以識別體積中的小滴的示范性圓檢測方法，其可與圖2A的系統(tǒng)一起使用以實施圖2B和圖2A的方法。

圖2H示意性地說明用以識別體積中的小滴的示范性組合式反向分水線與圓檢測方法，其可與圖2A的系統(tǒng)一起使用以實施圖2B和圖2A的方法。

圖3描繪根據(jù)本公開的一個方面的用于執(zhí)行數(shù)字檢定的示范性方法。根據(jù)此方面，可通過渦旋來產(chǎn)生含有核苷酸樣本的多分散小滴(步驟3A)，可通過PCR來擴增核苷酸(步驟3B)，且可以多井板格式分析核苷酸樣本(步驟3C)。

圖4描繪根據(jù)本公開的一個方面的用于執(zhí)行數(shù)字檢定的示范性方法。根據(jù)此方面，可將乳劑PCR執(zhí)行為具有對樣本轉(zhuǎn)移的最少需要的優(yōu)化高通量系統(tǒng)的部分。根據(jù)此方面，將油和含水PCR組分加載到多井板上，使整個多井板渦旋以誘發(fā)乳化，核苷酸組分在熱循環(huán)儀中經(jīng)歷PCR擴增，且使用熒光顯微鏡來使所得產(chǎn)物成像。

圖5A和圖5B描繪如應(yīng)用于圖1中的圖像的反向分水線方法的初始步驟的結(jié)果，包含如圖5A所示的所關(guān)注區(qū)(ROI)的識別，和如圖5B所示的具有優(yōu)化圓形區(qū)的最終經(jīng)處理圖像，可從其確定關(guān)于小滴大小和目標(biāo)分子存在的信息。

圖6A示出在執(zhí)行如應(yīng)用于圖1的圖像的圓檢測方法的初始步驟之后所產(chǎn)生的經(jīng)處理圖像。圖6B示出在對圖6A中的圓進(jìn)行分類以識別和定位小滴之后所獲得的最終結(jié)果。

圖7A示出在執(zhí)行如應(yīng)用于圖1的圖像的組合式反向分水線與圓檢測方法的初始步驟之后所產(chǎn)生的經(jīng)處理圖像。圖7B示出在對圖7A中的圓進(jìn)行分類以識別和定位小滴之后所獲得的最終結(jié)果。

圖8A和圖8B示出使用用于紅色熒光(圖8A)和綠色熒光(圖8B)檢測系統(tǒng)的掃描共聚焦顯微鏡獲取的多分散小滴乳劑的熒光圖像。圖8A和圖8B中的圓指示所識別的小滴。在圖8A和圖8B右側(cè)的曲線圖沿著在左側(cè)的圖像中所描繪的直線描繪熒光強度。圖8C示出在乳化之后使用ROX熒光信號測量的489個小滴的小滴直徑分布。

圖9示出針對以dsDNA的三種不同起始濃度(直方圖9A中的～2×10³dsDNA個副本/μL、直方圖9B中的～2×10⁶dsDNA個副本/μL，和直方圖9C中的～2×10⁷dsDNA個副本/μL)加載的多分散小滴的群體的綠色對紅色熒光強度的比率的頻率分布。

圖10示出用于計算機模擬中以驗證用于執(zhí)行數(shù)字檢定的方法的小滴直徑的計算機產(chǎn)生的截尾對數(shù)正態(tài)分布。所述分布是圖8C所示的實驗分布的理想化近似。

圖11示出樣本大小(即，在水平軸上示出的小滴數(shù)目)、小滴直徑測量中的誤差與樣本濃度測量中的誤差(在垂直軸上示出的測量可變性)之間的關(guān)系。使用在樣本濃度被設(shè)置為4.4×10^-5個分子/fL的情況下執(zhí)行的數(shù)字檢定的計算機模擬而產(chǎn)生數(shù)據(jù)。

圖12示出樣本濃度與統(tǒng)計功效之間的關(guān)系，可借此使用來自具有高50％的濃度的第二樣本的數(shù)字檢定來區(qū)別給定濃度的樣本。

圖13示出當(dāng)在沒有小滴直徑測量誤差的情況下對多分散小滴(灰色圓)或單分散小滴(黑色三角形)執(zhí)行時的數(shù)字檢定的樣本大小(在水平軸上示出的小滴數(shù)目)與動態(tài)范圍(在垂直軸上示出)之間的關(guān)系。

圖14示出自發(fā)地或由于熱循環(huán)而在多分散小滴乳劑中發(fā)生的小滴融合事件的頻率。含有ROX但沒有綠色熒光探測劑的乳化小滴與含有綠色熒光探測劑但沒有ROX的小滴進(jìn)行組合。在圖像14A(紅色熒光)和圖像14B(綠色熒光)中所示的組合混合物隨后保持在室溫以用作對照(沒有加熱)或經(jīng)受熱啟動以及1或50個熱循環(huán)中的一者。以含有ROX和綠色熒光探測劑兩者的小滴的百分比反映小滴融合事件的頻率(圖表14C)。

圖15示出不經(jīng)受加熱(白色條)、經(jīng)受1個熱循環(huán)(灰色條)或50個熱循環(huán)(黑色條)的多分散小滴直徑的頻率。

圖16示出使用構(gòu)成多分散小滴乳劑的流體的折射率匹配實現(xiàn)的數(shù)據(jù)獲取能力的改進(jìn)。使用共聚焦顯微鏡從兩個不同乳劑系統(tǒng)(分別在圖16的A1到A5和圖16的B1到B5中描繪)在逐漸較深(從左到右)的焦平面處獲取熒光圖像。在含水樣本(圖16的A1到A5)中，兩種不混溶流體組分的折射率不同，且小滴邊界在較深的焦平面處獲取的圖像中變得越來越不清楚，如在圖16的A5中。在混合的水和甘油樣本(圖16的B1到B5)中，兩種不混溶流體組分的折射率類似，且小滴邊界甚至在較深的焦平面處獲取的圖像中也仍然清楚，如在圖16的B5中。

圖17示出水/油/水雙面乳劑的熒光圖像。

圖18示出針對以跨越四個數(shù)量級(凈化dsDNA的2×10³、2×10⁴、2×10⁵和2×10⁶個dsDNA副本/μL)的dsDNA濃度加載的樣本的如通過最佳擬合方法(在垂直軸上示出)所確定以及如通過260nm處的吸收測量(在水平軸上示出)所確定的樣本濃度值之間的關(guān)系。

具體實施方式

本公開涉及用于使用多分散小滴執(zhí)行數(shù)字檢定的方法和系統(tǒng)。具體來說，本公開涉及用于多分散小滴系統(tǒng)中的樣本的擴增和分析的方法。本發(fā)明的方法和系統(tǒng)可用于識別多分散小滴系統(tǒng)中的小滴，確定所述小滴是否含有所關(guān)注樣本，以及執(zhí)行檢定步驟，例如數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)(dPCR)。

本公開的方法和系統(tǒng)有利地使能夠通過使用多分散小滴執(zhí)行樣本的高通量擴增和分析。本公開通過產(chǎn)生可變大小的體積而展現(xiàn)在數(shù)字檢定的性能中的顯著改進(jìn)的動態(tài)范圍。對于給定樣本濃度，體積的大小可界定被一或多個所關(guān)注分子(例如，模板分子)占據(jù)的概率。在擴增相關(guān)技術(shù)的實例中，體積大小的變化可用于更改此占據(jù)概率且因此更改示出擴增的井或樣本體積(例如，小滴)的數(shù)目。值得注意的是，本公開改進(jìn)了簡單地增加具有恒定大小的體積的數(shù)目的現(xiàn)有技術(shù)，以便增加動態(tài)范圍。與現(xiàn)有方法不同，可變體積樣本的使用不需要使用大區(qū)域來容納擴展動態(tài)范圍所需要的體積，使用大區(qū)域會例如增加一些數(shù)字化體積未適當(dāng)?shù)匦纬苫蚓哂衅渌毕莸男酒系娜毕莸目赡苄?。另外，增加體積的數(shù)目還會增加分析所有那些數(shù)字化體積所需要的時間。

本公開提供可用于多分散小滴樣本的產(chǎn)生、操縱、分析和建模中的裝置、系統(tǒng)和設(shè)備。還提供了相關(guān)方法。本公開還包含一種用于分析數(shù)字量化平臺的方法。雖然本公開被設(shè)計成實現(xiàn)使用多分散平臺的數(shù)字檢定，但本公開也可應(yīng)用于使用單分散乳劑平臺的數(shù)字檢定。本公開還包含用于乳劑分布建模、數(shù)據(jù)獲取和乳劑產(chǎn)生的方法。

本公開的一些方面包含用于操縱和分析物質(zhì)的方法和設(shè)備，所述物質(zhì)包括但不限于化學(xué)品、生化品、基因材料(例如，DNA、RNA，和類似者)、基因材料的表達(dá)產(chǎn)物、蛋白質(zhì)、代謝物、肽、多肽，結(jié)晶分子，或生物細(xì)胞，包含稀有細(xì)胞、細(xì)胞層、細(xì)胞器、外來體、線粒體、藥物、在周邊血液或淋巴系統(tǒng)中循環(huán)的生物粒子，或粒子。

在一些方面中，本公開的設(shè)備、裝置、方法和系統(tǒng)可用于例如使用以下各者擴增多核苷酸樣本：聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、反轉(zhuǎn)錄酶PCR(RT-PCR)、連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、環(huán)介導(dǎo)擴增(LAMP)、反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)擴增(RT-LAMP)、解旋酶相依擴增(HDA)、反轉(zhuǎn)錄解旋酶相依擴增(RT-HDA)、重組酶聚合酶擴增(RPA)、反轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶擴增(RT-RPA)、催化U形裝配反應(yīng)(CHA)、雜化鏈反應(yīng)(HCR)、熵驅(qū)動催化、鏈置換擴增(SDA)，和/或反轉(zhuǎn)錄鏈置換擴增(RT-SDA)。在某些方面中，本公開的設(shè)備、裝置、方法和系統(tǒng)可用于基于核酸序列的擴增(NASBA)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴增(TMA)、自持序列復(fù)制(3SR)，以及單引物等溫擴增(SPIA)?？墒褂玫钠渌夹g(shù)包含(例如)RNA技術(shù)信號介導(dǎo)擴增(SMART)、滾環(huán)擴增(RCA)、超支化滾環(huán)擴增(HRCA)、指數(shù)式擴增反應(yīng)(EXPAR)、智能擴增(SmartAmp)、核酸等溫和嵌合引物起始擴增(ICANS)，以及多重置換擴增(MDA)。其他方面可包含蛋白質(zhì)和小分子的結(jié)晶、細(xì)胞(例如，稀有細(xì)胞或單細(xì)胞)的操縱和/或分析、其他生物粒子(例如，隔離線粒體、細(xì)菌、病毒粒子)或其他生物或化學(xué)組分的操縱和/或分析。

用于數(shù)字檢定的多分散小滴乳劑

本公開提供用于以增加的動態(tài)范圍執(zhí)行數(shù)字檢定的方法、系統(tǒng)和裝置，其中產(chǎn)生不同大小的大量體積。與現(xiàn)有平臺不同，本公開的方法和系統(tǒng)可包含使用連續(xù)而不是離散的大小(例如，體積)分布。在一些方面中，可以各種方式(隨機地或通過微流體的受控施加)產(chǎn)生可變大小的小滴。舉例來說，通過使用三通接頭或流聚焦裝置，恒定體積小滴的微流體產(chǎn)生在本領(lǐng)域中是眾所周知的。在這些系統(tǒng)中，可通過剪切速率和通道尺寸來控制小滴的大小。如果對于給定三通接頭幾何形狀，剪切速率連續(xù)地變化，那么可產(chǎn)生不同體積的小滴?？衫缤ㄟ^計算機控制的注射泵或經(jīng)調(diào)制空氣壓力來實現(xiàn)這些方法，所述經(jīng)調(diào)制空氣壓力調(diào)整水相和油載流體的相對流動速度。

在本公開的各種方面中，可在兩種或多于兩種不混溶流體之間產(chǎn)生多分散小滴的乳劑。如本文中所使用，術(shù)語“不混溶流體”意指在一組給定實驗條件下甚至在彼此物理接觸時也不在明顯程度上經(jīng)歷混合或摻合以形成同質(zhì)混合物的兩種或多于兩種流體。

如本文中進(jìn)一步所描述，可通過多種方式來產(chǎn)生和分析用于數(shù)字測量的體積。本公開包含樣本保持器，其可用于保持所述體積，使得可進(jìn)一步處理和/或分析所述體積。本公開的樣本保持器可包含試管、微量離心管、在標(biāo)準(zhǔn)多井板中的井陣列、在微陣列上或在微流體芯片中的井陣列、被配置成產(chǎn)生小滴的微流體芯片，以及能夠保持樣本的離散體積(例如，井或小滴)的其他市售或以其他方式通常已知的裝置。

在一些方面中，可通過在樣本保持器(例如，試管)中的乳化而隨機地產(chǎn)生各種大小的小滴。小滴隨機性可簡化實驗，這是因為(例如)不需要努力控制小滴的大小。在乳化期間，可通過使用任何合適的表面活性劑來使不同體積的小滴穩(wěn)定。乳化途徑出于以下若干原因而特別有用：(1)所述方法與在每個生物醫(yī)學(xué)實驗室中發(fā)現(xiàn)的基本儀表兼容，(2)小滴產(chǎn)生是簡單的；它不需要用于流量控制的復(fù)雜芯片設(shè)計或高級設(shè)備，(3)小滴不限制在個別井中，這使容納大量小滴所需要的空間最小化，以及(4)檢定是簡單的，這是因為在擴增期間可將同一容器用于小滴產(chǎn)生和小滴存儲。有利的是，通過使用此方法，在小滴產(chǎn)生與擴增反應(yīng)之間不需要樣本轉(zhuǎn)移。

本公開的一些方面包含在不混溶流體中產(chǎn)生小滴。如在本領(lǐng)域中眾所周知，可組合廣泛多種不混溶流體以產(chǎn)生不同體積的小滴。如本文中進(jìn)一步所描述，可通過各種方式(例如通過乳化)來組合流體。舉例來說，含水溶液(例如，水)可與非含水流體(例如，油)組合以在樣本保持器中或在微流體芯片上產(chǎn)生小滴。適合用于本公開中的含水溶液可包含水基溶液，其還可進(jìn)一步包含緩沖劑、鹽，和通常已知用于檢測檢定(例如，PCR)中的其他組分。因此，本文中所描述的含水溶液可包含(例如)引物、核苷酸和探測劑。合適的非含水流體可包含但不限于有機相流體，例如礦物油(例如，輕礦物油)、硅酮油、氟化油或流體(例如，氟化酒精或全氟三丁胺)、其他市售材料(例如，Tegosoft)，或其組合。

可以多種方法產(chǎn)生乳劑。根據(jù)本公開的某些方面，可通過攪拌(其通常為物理攪拌)來產(chǎn)生乳劑。用于乳劑產(chǎn)生的物理攪拌的一些方法包含但不限于搖動、渦旋(其可包含使個別管或整個井板或其他裝置渦旋)、聲波處理、與磁體混合、快速移液或某一其他擠壓方法，或經(jīng)由在微流體裝置內(nèi)的流聚焦，以及其他方法。根據(jù)本公開而使用的攪拌可為足以產(chǎn)生乳劑的任何合適的攪拌手段。舉例來說，可容易地調(diào)整用于渦旋、聲波處理、移液、擠壓或其他攪拌方法的速度、程度和時間，使得足以產(chǎn)生本公開的乳劑系統(tǒng)。可通過調(diào)整所述系統(tǒng)中的化學(xué)組分和所述系統(tǒng)所經(jīng)受的攪拌條件來調(diào)諧乳劑的特定特性。

多種流體或液體可用于制備根據(jù)本公開的乳劑。在一些方面中，所述系統(tǒng)包含兩種或多于兩種不混溶流體，其在適當(dāng)條件下混合時分離成分散小滴相和連續(xù)載體相。舉例來說，將變?yōu)榉稚⑿〉蜗嗟牡谝涣黧w可含有樣本。在一些方面中，此第一流體將為含水溶液。在一些方面中，此第一流體將仍是液體，在其他方面中，其可為或變?yōu)槟z或固體。在一些方面中，此第一流體可具有或可形成不同殼層。

可用作小滴乳劑的一個相的可能的含水流體包含但不限于各種PCR和RT-PCR溶液、等溫擴增溶液(例如用于LAMP或NASBA)、血液樣本、血漿樣本、血清樣本、含有細(xì)胞溶菌產(chǎn)物或分泌物或細(xì)菌溶菌產(chǎn)物或分泌物的溶液，和含有蛋白質(zhì)、細(xì)菌、病毒粒子和/或細(xì)胞(真核、原核，或其粒子)的其他生物樣本，以及其他者。在某些方面中，含水流體還可含有表面活性劑或其他劑以促進(jìn)與不混溶流體和/或它們可能接觸的其他材料或界面的所要交互和/或兼容性。在某些方面中，加載在裝置上的含水溶液可具有表達(dá)惡性表型的細(xì)胞、胚胎細(xì)胞、循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、感染上病毒的細(xì)胞、使用所關(guān)注基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，或存在于患有自體免疫或自體反應(yīng)紊亂的主體的周邊血液中的T細(xì)胞或B細(xì)胞，或其他亞型的免疫細(xì)胞，或稀有細(xì)胞或生物粒子(例如，外來體、線粒體)，其在周邊血液中或在淋巴系統(tǒng)或脊髓液或其他體液中循環(huán)。細(xì)胞或生物粒子在一些情況下在樣本中可為稀有的，且可使用離散化，例如，以在空間上隔離細(xì)胞，由此允許檢測稀有細(xì)胞或生物粒子。

在一些方面中，將變?yōu)檫B續(xù)相的第二流體將是與第一流體不混溶的流體。第二流體有時被稱作油，但不需要是油?？捎米鞯诙黧w的潛在流體包含但不限于碳氟基油、硅化合物基油、烴基油(例如礦物油和十六烷)、植物基油、離子液體、與第一水相的不混溶或與第一相形成物理屏障的水相、超臨界流體、空氣或其他氣相。

在本公開的一些方面中，多分散小滴可包括流體界面改性。流體界面改性元素包含界面穩(wěn)定或改性分子，例如但不限于表面活性劑、脂類、磷脂、糖脂、蛋白質(zhì)、肽、納米粒子、聚合物、沉淀物、微粒、具有疏水部分和親水部分的分子，或其他組分。在一些方面中，一或多個流體界面改性元素可存在于將包括在分散小滴相流體中的流體中。在其他方面中，一或多個流體界面改性元素可存在于將包括在連續(xù)載體相流體中的流體中。在又其他方面中，一或多個流體界面改性元素可存在于分散小滴相流體和連續(xù)載體相流體兩者中。存在于將包括在乳劑的一個相中的流體中的流體界面改性元素可與存在于將包括在乳劑的另一相中的流體中的流體界面改性元素相同或不同。

在本公開的一些方面中，流體界面改性元素可用于防止相鄰乳劑小滴的聚結(jié)，從而導(dǎo)致長期的乳劑穩(wěn)定性。在一些方面中，流體界面改性元素可具有一些其他或額外重要作用，例如在小滴內(nèi)提供生物兼容表面，這也可或可不促成乳劑穩(wěn)定性。在一些方面中，所述組分可在控制流體之間或小滴之間的組分輸送方面起作用。流體界面改性元素的一些非限制性實例包含但不限于ABIL WE 09、ABIL EM90、TEGOSOFT DEC、牛血清白蛋白(BSA)、山梨醇酐(例如，Span 80)、聚山梨醇酯(例如，聚乙二醇化山梨醇酐，例如TWEEN 20和TWEEN 80)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、1H，1H，2H，2H-全氟辛醇(PFO)、Triton-X100、monolein、油酸、磷脂，和Pico-Surf，以及各種氟化表面活性劑，以及其他者。

在一些方面中，乳劑系統(tǒng)將由被連續(xù)油相環(huán)繞的分散水相(含有所關(guān)注樣本)組成。其他方面可為此系統(tǒng)的變化或修改，或它們可為完全不同的組成或構(gòu)造的乳劑。替代性乳劑系統(tǒng)包含多種乳劑，例如水包油包水(水/油/水，或w/o/w)乳劑，或油包水包油(油/水/油，或o/w/o)乳劑。這些多種乳劑系統(tǒng)于是將具有內(nèi)部相、中間相和外部相。在一些方面中，內(nèi)部相和外部相可具有相同組成。在其他方面中，內(nèi)部相和外部相可類似-例如，都是含水的，或都是相同的油-但具有不同的子組分。在其他方面中，所有三種乳劑相可具有不同且有時非常不同的組成。

在某些方面中，乳劑系統(tǒng)可包括兩種不混溶流體，其都是含水的或都非含水的。在另外方面中，兩種乳劑流體都可為油基，其中油彼此不混溶。舉例來說，所述油中的一者可為烴基油，且另一油可為碳氟基油。在其他乳劑系統(tǒng)中，兩種流體可主要是含水的，但仍彼此不混溶。在一些方面中，這會在含水溶液含有彼此相分離的組分時發(fā)生?？墒褂玫娜苜|(zhì)的一些實例包含但不限于含有以下各者的系統(tǒng)：右旋糖酐、聚蔗糖、甲基纖維素、不同長度的聚乙二醇(PEG)、聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、Reppal PES、K₃PO₄、檸檬酸鈉、硫酸鈉、Na₂HPO₄，以及K₃PO₄。

除了含水溶液和非含水流體之外，還可包含表面活性劑，例如，以改進(jìn)小滴的穩(wěn)定性和/或促進(jìn)小滴形成。合適的表面活性劑可包含但不限于非離子表面活性劑、離子表面活性劑、硅酮基表面活性劑、氟化表面活性劑或其組合。非離子表面活性劑可包含(例如)山梨醇酐單硬脂酸酯(Span 60)、辛基苯氧基乙氧基乙醇(Triton X-100)、聚環(huán)氧乙烷山梨醇酐單油酸酯(Tween 80)和山梨醇酐單油酸酯(Span 80)。硅酮基表面活性劑可包含(例如)ABIL WE 09表面活性劑。可類似地使用在本領(lǐng)域中通常眾所周知的其他類型的表面活性劑。在一些方面中，表面活性劑可以多種濃度或濃度范圍而存在，例如按重量計大約0.01％、0.1％、0.25％、0.5％、1％、5％，或10％。

在一些方面中，本公開的多分散小滴具有連續(xù)體積分布。如本文中所提供，術(shù)語“連續(xù)體積分布”意欲描述橫越體積分布連續(xù)地變化而不是按預(yù)界定的離散階躍而變化的體積分布。舉例來說，基于芯片的平臺可包含覆蓋被制造為芯片的部分的預(yù)界定的離散階躍界定的體積分布的井或小滴體積。即，可將芯片制成具有以100nL、10nL和1nL而存在的體積，而不具有存在于那些離散階躍之間的其他體積。與此對比，連續(xù)體積分布不是預(yù)界定的(即，體積分布在產(chǎn)生或形成小滴體積之前未被界定)?？衫缃?jīng)由乳化而產(chǎn)生連續(xù)體積分布，如本文中進(jìn)一步所描述。在乳劑中，體積(例如小滴體積)具有離散體積，但分布中的小滴體積在產(chǎn)生小滴之前未被界定(即，未通過制造技術(shù)預(yù)界定)，且所述體積沿著連續(xù)體積分布隨機地分布。根據(jù)本公開，可通過物理攪拌(例如使樣本渦旋或搖動)來產(chǎn)生乳化系統(tǒng)?？赏ㄟ^賦予在乳劑上的力(例如，通過渦旋速度或搖動強度)來修改小滴體積的上邊界和下邊界。然而，通過此類技術(shù)產(chǎn)生的小滴體積沿著所產(chǎn)生的體積分布連續(xù)地變化。

根據(jù)本公開的各種方面，通過兩種或多于兩種不混溶流體的乳化來形成多分散小滴。根據(jù)這些方面，至少一些多分散小滴含有樣本，其隨后通過目前描述的方法予以擴增和分析。如本文中所使用，術(shù)語“多分散”是指具有連續(xù)體積分布的小滴系統(tǒng)中的多個小滴。給定多分散小滴系統(tǒng)的最小、最大、平均和中值小滴直徑以及它們的相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)偏差取決于乳劑的物理性質(zhì)(例如，化學(xué)組分和溫度)和形成多分散小滴的方式(例如，產(chǎn)生多分散小滴系統(tǒng)的物理攪拌的類型和持續(xù)時間)。可通過調(diào)整給定系統(tǒng)的這些參數(shù)來調(diào)諧小滴和它們的相應(yīng)概率的分布。

在一些方面中，也可特性化連續(xù)體積分布，使得對于任一組(或多個)小滴體積，其分布函數(shù)可被表示為f(x)，其中f(x)dx是所述組中的給定小滴將具有介于x與x+dx之間的體積的概率。(dx是無限小的數(shù)。)在某些方面中，連續(xù)分布是小滴組中的小滴的體積滿足以下條件的分布：(1)是未預(yù)指定的；和(2)對于某一范圍x_lower＜x＜x_upper，f(x)始終大于零(x_lower不能等于x_upper，且不需要知曉關(guān)于f(x)的其他方面)。因此，本公開在一些方面中可包含使用從連續(xù)分布提取的小滴組，測量所述組中的每個小滴的體積，以及在分析中使用所測量的小滴體積。

圖8C示出根據(jù)目前描述的方法和系統(tǒng)產(chǎn)生的小滴直徑和它們的相應(yīng)概率的實驗上測量的分布。實驗上確定的小滴直徑和概率的分布與理論上確定的值一致，如圖10所描繪，且兩個圖描繪小滴的連續(xù)體積分布。

如本文中所描述，可產(chǎn)生具有多種體積分布的體積，其可使用多種不同方法予以分析。在一些方面中，樣本可含有可被分析的所關(guān)注分子?？僧a(chǎn)生樣本的離散體積以用于經(jīng)由數(shù)字測量進(jìn)行分析。舉例來說，本文中的方法可包含產(chǎn)生具有體積分布的多個小滴。在一些方面中，可在包含組合的不混溶流體的乳劑中產(chǎn)生樣本的多個小滴，如本文中進(jìn)一步所描述。在一個實例中，樣本可包含含水溶液，含水溶液包含所關(guān)注分子(例如，核酸分子)。樣本可與油混合以形成懸浮在油中的樣本的小滴。取決于所使用的方法，乳劑中的多個小滴的體積可沿著連續(xù)體積分布隨機地分布。此外，可通過用于形成乳劑的方法來控制體積范圍。舉例來說，可控制渦旋、搖動、聲波處理和/或擠壓的強度以產(chǎn)生所要的體積分布，或通過變化表面活性劑和/或油的組成而進(jìn)行。

本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將了解，體積分布的范圍和體積分布內(nèi)的體積將取決于用于給定分析的多種因素。在一些方面中，多個小滴的體積分布可包含以下體積范圍：從大約100毫微升(nL)到大約1毫微微升(fL)、從大約10nL到大約10fL、從大約1nL到大約100fL、從大約100nL到大約1微微升(pL)、從大約10nL到大約10pL、從大約1nL到大約1pL、從大約500pL到大約50fL、從大約100pL到大約100fL。取決于用于產(chǎn)生小滴的選定因素，常規(guī)的是通過(例如)改變使樣本和油與表面活性劑混合的強度來界定體積分布的上邊界和下邊界。可存在體積分布中的體積范圍。舉例來說，分布中的體積范圍可多于2倍、多于10倍、多于100倍、多于1000倍、多于10000倍、多于100000倍、多于1000000倍、多于大約2倍、多于大約10倍、多于大約100倍、多于大約1000倍、多于大約10000倍、多于大約100000倍或多于1000000倍。通過將范圍變動2倍，體積分布的下邊界可為(例如)10nL，其中上邊界為20nL。類似地，通過將范圍變動10倍，體積分布的下邊界可為(例如)10nL，其中上邊界為100nL。

在本公開的一些方面中，多分散小滴具有標(biāo)準(zhǔn)偏差比中值小滴直徑大1000％、大500％、大100％、大50％、大30％、大20％、大15％、大10％、大9％、大8％、大7％、大6％或大5％的小滴直徑分布。

在本公開的一些方面中，多分散小滴具有標(biāo)準(zhǔn)偏差比平均小滴直徑大1000％、大500％、大100％、大50％、大30％、大20％、大15％、大10％、大9％、大8％、大7％、大6％或大5％的小滴直徑分布。

在本公開的一些方面中，可使用閥、井或小滴產(chǎn)生體積。此處，可使用廣泛范圍的方法產(chǎn)生不同體積(直徑)的小滴。在一種方法中，使用微流體(例如，使用在本領(lǐng)域中眾所周知的T形通道或流聚焦)產(chǎn)生所界定的體積的小滴；通過變化通道尺寸的剪切速率，可形成不同大小的小滴。在另一方法中，憑借不同的表面活性劑通過乳化來產(chǎn)生不同體積的小滴；此處，通過使用不同的表面活性劑來穩(wěn)定和控制不同體積的小滴。通過任一方法，可在不同體積(大小)的所有小滴中同時地實行分析物的擴增(例如，數(shù)字PCR)。在某些方面中，小滴隨后可以單行格式流動穿過可確定小滴的大小且可詢問來自小滴的熒光所處的流式細(xì)胞儀或其他類似裝置。當(dāng)使用流式細(xì)胞儀或其他流入式方法時，基于每個小滴的熒光和大小(體積)而確定擴增產(chǎn)物在每個小滴中的存在，所述熒光和大小是基于來自小滴的散射信號予以確定。替代地，可通過以類似于基于圖像的流式細(xì)胞儀的方式隨著小滴穿過設(shè)備而取得圖像來確定大小。以此方式，通過標(biāo)注每個小滴的大小以及擴增產(chǎn)物在給定大小的每個小滴中的存在或不存在，有可能在詢問不同大小的足夠數(shù)目個小滴之后反算樣本中存在的分析物的原始濃度。因為小滴具有不同大小，所以對于給定動態(tài)范圍，出于先前所論述的原因，分析會比小滴全部具有類似大小的情況快得多。

在某些方面中，本發(fā)明的方法和系統(tǒng)可用于分析數(shù)字化體積中的樣本。術(shù)語“數(shù)字化體積”是指在獲得初始樣本且將其分離為物理上不同的較小體積以準(zhǔn)備用于檢定之后產(chǎn)生的體積。

根據(jù)本公開的某些方面，可在芯片中形成和檢定小滴。根據(jù)另外方面，擴增和數(shù)字測量可在數(shù)字化芯片中進(jìn)行。

在一個方面中，本公開提供一種用于產(chǎn)生與數(shù)字測量和讀出整合的濃度梯度的方法。舉例來說，可將微流體梯度產(chǎn)生與樣本數(shù)字化芯片整合。為了增加動態(tài)范圍，對數(shù)或指數(shù)濃度梯度是優(yōu)選的，但大量方法現(xiàn)在可用于在芯片上形成各種類型和形狀的濃度梯度，包含非線性梯度，例如冪、指數(shù)、誤差、高斯和立方根函數(shù)。

根據(jù)本公開的某些方面，可使用微流體裝置中的濃度梯度，其中僅存在兩個入口儲集器或通道，但更多入口儲集器或通道也適合于本公開的使用。根據(jù)此方面，一個入口用于樣本且一個入口用于緩沖劑(或在數(shù)字PCR的情況下是PCR試劑)。隨著兩種溶液流動穿過網(wǎng)絡(luò)，樣本溶液以預(yù)界定的方式被緩沖劑(水或PCR試劑)溶液稀釋，使得在入口通道中的每一者處，存在不同濃度的樣本?？缭搅鶄€數(shù)量級的線性、多項式和對數(shù)梯度已全部使用此設(shè)計的變化予以產(chǎn)生。

在另一方面中，使用在濃度上跨越六個數(shù)量級的對數(shù)或指數(shù)梯度。將樣本和PCR溶液移液到兩個入口儲集器中，此后，它們將經(jīng)過井陣列。一旦井已被填充有濃度梯度，輕礦物油或某一其他不混溶流體就流過井以在井內(nèi)產(chǎn)生個別數(shù)字化體積。此實例中的井具有相同體積。在本公開的另一方面中，可使用不同體積的井。

在另一方面中，將樣本和PCR溶液移液到兩個入口儲集器中，此后，它們將經(jīng)過親水和疏水小片的陣列。隨著樣本流過親水小片，它們致使形成不同大小樣本體積的潤濕小滴。替代地，可將樣本數(shù)字化。

在本公開的另一方面中，結(jié)合使用閥、井或小滴產(chǎn)生的數(shù)字化體積而使用梯度。在具有小滴的方面中，可以連續(xù)流方式而以T形通道幾何形狀或流聚焦幾何形狀形成小滴，所述幾何形狀兩者在本領(lǐng)域中是眾所周知的。

為了將已稀釋的樣本數(shù)字化，可使用數(shù)字化方案。此處，使含有不同濃度的目標(biāo)分子的樣本溶液流過構(gòu)形上圖案化的表面以形成數(shù)字化和離散體積，以供后續(xù)數(shù)字測量和讀出。替代地，有可能使用經(jīng)圖案化表面將樣本數(shù)字化。

在另一方面中，可使用微流體通道和不混溶流體相將樣本數(shù)字化。在此方面中，將樣本相引入到通道中，隨后是不混溶相，其形成由側(cè)空腔的幾何尺寸界定的離散樣本體積(D.E.Cohen、T.Schneider、M.Wang、D.T.Chiu，《分析化學(xué)(Anal.Chem.)》，82，5707-5717)。

根據(jù)一個示范性方面，本公開提供不同大小的數(shù)字化體積陣列，其中使用經(jīng)圖案化表面來產(chǎn)生不同大小的體積陣列。根據(jù)此方面，產(chǎn)生七組陣列，其中每個陣列含有900個數(shù)字化體積(30×30)。通過在疏水表面的背景中產(chǎn)生親水圓形小片而形成所述陣列。結(jié)果，當(dāng)所述表面暴露于含水溶液和油時，親水小片將被由油環(huán)繞的含水液滴覆蓋。小滴可為半球形，但形狀可改變(更扁平或更圓)，這取決于所使用的確切表面以及所使用的油和含水溶液。在一個方面中，使用重油，且因為油將推動液滴，所以液滴更扁平。

界定每組900個親水小片的圓具有不同大小，其范圍為從1μm的直徑到5μm到10μm到50μm到100μm到500μm且最終到1mm的直徑。因為液滴的體積大致與液滴的直徑的立方成比例，所以將小片的直徑增加十倍會將體積增加大約1,000倍。結(jié)果，使用不同大小的數(shù)字化體積相比于簡單地使用相同大小的更多數(shù)字化體積在空間和讀出方面更有效。在一個方面中，使用陣列的每組的900個數(shù)字化體積，這是因為此數(shù)目適合于達(dá)到統(tǒng)計上穩(wěn)健的數(shù)字讀出。然而，取決于特定應(yīng)用和讀出的所需穩(wěn)健性，可設(shè)計陣列的每組內(nèi)的更多數(shù)字化體積或更少數(shù)字化體積。根據(jù)此方面，歸因于不同大小的表面圖案化親水小片的簡易性，可以不同大小產(chǎn)生大的數(shù)字化體積陣列。此方面對于例如常常需要廣泛動態(tài)范圍的數(shù)字PCR等應(yīng)用可為有用的，高度地有益的是在使用經(jīng)圖案化表面產(chǎn)生的液滴中執(zhí)行PCR。

在某些方面中，分散小滴系統(tǒng)可經(jīng)受分散小滴系統(tǒng)的至少一部分從液相到固相的改變。在一些方面中，可通過膠凝過程將分散小滴系統(tǒng)的液體轉(zhuǎn)化為固體。舉例來說，瓊脂糖的溶液可隨著溫度下降到低于其熔化溫度而固化。在另外方面中，可通過由可溶前驅(qū)物形成藻酸鈣(通過溶液組分的光聚合、使用誘發(fā)光聚合的交聯(lián)劑)發(fā)生液體到固體轉(zhuǎn)化。在一些方面中，整個小滴固化，而在其他方面中，僅界面處的層固化。

在一些方面中，本公開的乳劑系統(tǒng)可被配置成使得可增強或最小化小滴與周圍媒介之間的擴散程度，這取決于所關(guān)注應(yīng)用。在某些方面中，多分散小滴乳劑系統(tǒng)可被設(shè)計成增強小滴與周圍相之間的試劑擴散。在某些方面中，多分散小滴乳劑系統(tǒng)可被設(shè)計成減少或消除小滴與周圍相之間的試劑擴散。舉例來說，在高于瓊脂糖熔化溫度的溫度下形成的瓊脂糖小滴在冷卻到室溫時固化，且取決于溶液中的瓊脂糖的濃度，可發(fā)生在液滴邊界內(nèi)或橫越液滴邊界的擴散。在某些方面中，可調(diào)諧小滴和周圍媒介的組成以最大化在小滴囊封之后的擴散。還可調(diào)諧小滴的性質(zhì)以防止(例如)目標(biāo)分子的非想要的擴散。在某些方面中，目標(biāo)分子可在原處交聯(lián)或錨定。舉例來說，例如引物等關(guān)鍵分子可錨定到基質(zhì)。將目標(biāo)分子錨定在原處可使能夠在非油基平臺中使用乳劑，這可具有更好地促進(jìn)下游處理或樣本回收的優(yōu)點，以及其他優(yōu)點。

在一些方面中，可在分散小滴系統(tǒng)中的多個相之間產(chǎn)生物理屏障。在某些方面中，環(huán)繞小滴的物理屏障可為聚合固體殼層、脂雙層、沉淀界面，或例如界面處的蛋白質(zhì)、納米粒子、囊泡、沉淀物、微觀粒子或其他材料等材料的聚集體。

可對乳劑系統(tǒng)作出其他修改以更改可有益于乳劑的操縱、處理或分析的某些性質(zhì)。取決于分析方法，乳劑系統(tǒng)的不同物理和光學(xué)性質(zhì)可起到非常重要的作用。這些性質(zhì)包含但不限于乳劑小滴的大小分布、流體的相對密度、流體的粘度、流體的折射率，以及連續(xù)流體內(nèi)的小滴的整體和局部密度。

折射率匹配可有益于改進(jìn)用于光學(xué)分析的成像深度(例如，減少小滴邊界的失真)。水相的折射率通常接近于水的折射率，即，大約n＝1.33。水相的折射率通常低于烴基油的折射率，但稍微高于氟化油的折射率。在本公開的一個方面中，可通過向乳劑的水相添加例如但不限于甘油、蔗糖、Cargille光學(xué)液體、乙二醇、丙二醇、CS₂、水楊酸甲酯、二甲亞砜(DMSO)以及其他者等高折射率(即，n＞1.45)組分以使水相的折射率能夠更接近地匹配于油的折射率來實現(xiàn)折射率匹配。在其他方面中，可通過調(diào)整非水相的折射率來實現(xiàn)折射率匹配，所述非水相相比于水相通常由具有較高折射率的組分與具有較低折射率的組分的混合物組成。任何合適的添加物可用于提高低折射率流體的折射率，例如但不限于：碳氟基油(例如，全氟萘烷；全氟三丁胺油，例如FC-40、FC-70；Krytox油以及其他者，具有高折射率(即，n＝1.36到1.4)；碳氟溶劑，例如但不限于八氟甲苯、六氟苯、五氟苯、1，2，4，5-四氟苯十氟-對-二甲苯，以及其他者。下表1提供添加物的非包含性列表，所述添加物可用于調(diào)整非水相的折射率，由此致使其更接近地匹配于水相(即，水，n＝1.33)的折射率：

表1.以遞增折射率的次序所列出一系列碳氟油和溶劑的物理性質(zhì)的概述。包含水以供參考。

小滴的適當(dāng)間距對于最大化可在不具有來自一個小滴干擾另一小滴的信息的情況下分析的小滴的數(shù)目是重要的。在一些方面中，可通過更改油系統(tǒng)的密度來增加小滴之間的空間。舉例來說，部分氟化烴化合物可用于降低碳氟油的密度。在另一方面中，可通過添加CsCl或某一其他合適密度增加組分來更改含水溶液的密度。舉例來說，按重量計含有56％的CsCl的溶液將具有接近1.7g/mL的密度，且按重量計含有65％的CsCl的溶液將具有大約1.9g/mL的密度，其中這些密度接近地匹配于許多碳氟化合物的密度。還可更改油的粘度，使得小滴移動得較慢和/或增加小滴之間的潤濕層。在另一方面中，第二流體可經(jīng)歷到更固態(tài)性質(zhì)的相轉(zhuǎn)變，使得在某些位置處捕獲離散相。在另一方面中，可使用雙面乳劑(例如，w/o/w)以將小滴接近地包在一起，同時還防止直接接觸/重疊。

在一些方面中，小滴直徑分布具有比中值小滴直徑大1000％、大500％、大100％、大50％、大30％、大20％、大15％、大10％、大9％、大8％、大7％、大6％或大5％的標(biāo)準(zhǔn)偏差。在一些方面中，小滴直徑分布具有比中值小滴直徑大大約1000％、大大約500％、大大約100％、大大約50％、大大約30％、大大約20％、大大約15％、大大約10％、大大約9％、大大約8％、大大約7％、大大約6％或大大約5％的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

在其他方面中，小滴直徑分布具有比平均小滴直徑大1000％、大500％、大100％、大50％、大30％、大20％、大15％、大10％、大9％、大8％、大7％、大6％或大5％的標(biāo)準(zhǔn)偏差。在一些方面中，小滴直徑分布具有比平均小滴直徑大大約1000％、大大約500％、大大約100％、大大約50％、大大約30％、大大約20％、大大約15％、大大約10％、大大約9％、大大約8％、大大約7％、大大約6％或大大約5％的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

在另外方面中，多分散小滴中的體積變化多于2倍、多于10倍、多于100倍、多于1000倍、多于10000倍、多于100000倍、多于1000000倍、多于2倍、多于10倍、多于100倍。在又另外方面中，多分散小滴中的體積變化多于大約2倍、多于大約10倍，或多于大約100倍、多于大約1000倍、多于大約10000倍、多于大約100000倍或多于1000000倍。

在一些方面中，多分散小滴具有以下范圍的體積分布：從100毫微升(nL)到1毫微微升(fL)、從10nL到10fL、從1nL到100fL、從100nL到1pL、從10nL到10pL，或從1nL到1pL、從500pL到50fL、從100pL到100fL。在另外方面中，多分散小滴具有以下范圍的體積分布：從大約100毫微升(nL)到大約1毫微微升(fL)、從大約10nL到大約10fL、從大約1nL到大約100fL、從大約100nL到大約1pL、從大約10nL到大約10pL，或從大約1nL到大約1pL、從大約500pL到大約50fL、從大約100pL到大約100fL。

在某些方面中，多分散小滴的平均體積在擴增樣本期間改變少于50％、少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％，或少于1％。在其他方面中，多分散小滴的中值體積在擴增樣本期間改變少于大約50％、少于大約40％、少于大約35％、少于大約30％、少于大約25％、少于大約20％、少于大約15％、少于大約10％、少于大約5％、少于大約4％、少于大約3％、少于大約2％，或少于大約1％。

在一些方面中，擴增樣本包括第一擴增循環(huán)，且其中少于50％、少于45％、少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于19％、少于18％、少于17％、少于16％、少于15％、少于14％、少于13％、少于12％、少于11％、少于10％、少于9％、少于8％、少于7％、少于6％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％或少于1％的多分散小滴在第一擴增循環(huán)之后融合。在另外方面中，擴增樣本包括第一擴增循環(huán)，且其中少于大約50％、少于大約45％、少于大約40％、少于大約35％、少于大約30％、少于大約25％、少于大約20％、少于大約19％、少于大約18％、少于大約17％、少于大約16％、少于大約15％、少于大約14％、少于大約13％、少于大約12％、少于大約11％、少于大約10％、少于大約9％、少于大約8％、少于大約7％、少于大約6％、少于大約5％、少于大約4％、少于大約3％、少于大約2％或少于大約1％的多分散小滴在第一擴增循環(huán)之后融合。

在一些方面中，第一流體的折射率與第二流體的折射率相差少于200％、少于100％、少于60％、少于50％、少于45％、少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于19％、少于18％、少于17％、少于16％、少于15％、少于14％、少于13％、少于12％、少于11％、少于10％、少于9％、少于8％、少于7％、少于6％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％，或少于1％。在另外方面中，第一流體的折射率與第二流體的折射率相差少于大約200％、少于大約100％、少于大約60％、少于大約50％、少于大約45％、少于大約40％、少于大約35％、少于大約30％、少于大約25％、少于大約20％、少于大約19％、少于大約18％、少于大約17％、少于大約16％、少于大約15％、少于大約14％、少于大約13％、少于大約12％、少于大約11％、少于大約10％、少于大約9％、少于大約8％、少于大約7％、少于大約6％、少于大約5％、少于大約4％、少于大約3％、少于大約2％，或少于大約1％。

在一些方面中，例如在雙面乳劑中，第一流體的折射率與塊體媒介的折射率相差少于200％、少于100％、少于60％、少于50％、少于45％、少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于19％、少于18％、少于17％、少于16％、少于15％、少于14％、少于13％、少于12％、少于11％、少于10％、少于9％、少于8％、少于7％、少于6％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％，或少于1％。

在一些方面中，多分散小滴包括多種乳劑。在某些方面中，通過組合三種或多于三種不混溶流體來制備多種乳劑。

用于執(zhí)行數(shù)字測量的裝置和方法

本公開的另一方面包括一種用于實行本公開的方法的裝置。根據(jù)此方面，本公開提供用于產(chǎn)生具有體積分布的多個多分散小滴的構(gòu)件、用于測量多個多分散小滴中的給定小滴的體積的構(gòu)件、用于確定樣本在小滴中的存在或不存在以及多個多分散小滴中的樣本的濃度的構(gòu)件。本發(fā)明的方法使能夠遍及大動態(tài)范圍執(zhí)行數(shù)字測量且使能夠執(zhí)行用于增加動態(tài)范圍的方法和系統(tǒng)。具體來說，所述裝置尤其通過產(chǎn)生不同大小的樣本體積而增加樣本的數(shù)字測量的動態(tài)范圍。

在各種方面中，本公開提供用于執(zhí)行數(shù)字檢定的方法，其包括：產(chǎn)生多個多分散小滴，其中小滴中的至少一些小滴包括樣本；擴增樣本；使用可檢測劑標(biāo)記樣本；獲得小滴的圖像棧；從圖像棧確定小滴的體積；從圖像棧確定可檢測劑在小滴中的存在或不存在；以及基于可檢測劑在多個小滴中的存在或不存在而確定多個小滴中的樣本的濃度。

在一些方面中，獲得圖像棧包括光學(xué)成像。在一些方面中，檢測可檢測劑包括光學(xué)成像。

在另外方面中，通過以下各者執(zhí)行光學(xué)成像：共聚焦顯微術(shù)、線共聚焦顯微術(shù)、反卷積顯微術(shù)、旋轉(zhuǎn)盤顯微術(shù)、多光子顯微術(shù)、平面照明顯微術(shù)、Bessel光束顯微術(shù)、微分干涉差顯微術(shù)、相差顯微術(shù)、落射熒光顯微術(shù)、明場成像、暗場成像、傾斜照明，或其組合。

在某些方面中，圖像棧包括從穿過單個小滴的單獨焦深取得的多個圖像。

在另外方面中，圖像棧包括從針對小滴的單獨焦深取得的2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100個圖像。在其他方面中，圖像棧包括從針對小滴的單獨焦深取得的大于2、大于3、大于4、大于5、大于6、大于7、大于8、大于9、大于10、大于15、大于20、大于25、大于30、大于35、大于40、大于45、大于50、大于55、大于60、大于65、大于70、大于75、大于80、大于85、大于90、大于95或大于100個圖像。在又其他方面中，圖像棧包括從針對小滴的單獨焦深取得的大于大約2、大于大約3、大于大約4、大于大約5、大于大約6、大于大約7、大于大約8、大于大約9、大于大約10、大于大約15、大于大約20、大于大約25、大于大約30、大于大約35、大于大約40、大于大約45、大于大約50、大于大約55、大于大約60、大于大約65、大于大約70、大于大約75、大于大約80、大于大約85、大于大約90、大于大約95或大于大約100個圖像。

在另外方面中，圖像棧包括從針對小滴的單獨焦深或成像裝置的物平面取得的從100到50、100到75、100到25、100到20、100到10、100到5、50到20、50到10、50到5、20到10、20到5、10到5、10到2、大約100到大約50、大約100到大約75、大約100到大約25、大約100到大約20、大約100到大約10、大約100到大約5、大約50到大約20、大約50到大約10、大約50到大約5、大約20到大約10、大約20到大約5、大約10到大約5或大約10到大約2個圖像。

在一些方面中，對多個小滴同時地執(zhí)行本發(fā)明的方法。在另外方面中，多個多分散小滴包括多分散小滴陣列。在又另外方面中，多分散小滴陣列安置在多井板中。

在一些方面中，通過以下各者從圖像棧確定小滴的體積：行掃描方法、簡單邊界方法、反向分水線方法、圓檢測方法、組合式反向分水線與圓檢測方法，或其組合。

在一些方面中，遍及至少三個數(shù)量級的動態(tài)范圍或遍及至少六個數(shù)量級的動態(tài)范圍確定可檢測劑的濃度。

在一些方面中，多個多分散小滴包括第一流體和第二流體，其中第一流體不混溶于第二流體中。在某些方面中，通過攪拌包括第一流體和第二流體的溶液而形成多分散小滴的乳劑，其中第一流體不混溶于第二流體中。在另外方面中，攪拌包括渦旋。

在各種方面中，本公開提供包括以下操作的方法：通過攪拌包括第一流體和第二流體的溶液而形成多分散小滴的乳劑，其中第一流體不混溶于第二流體中；以及在第三流體中攪拌乳劑，其中第三流體不混溶于第二流體中，由此形成雙面乳劑。

在一些方面中，本公開提供包括流體攪拌的方法，其中攪拌可為搖動、渦旋、聲波處理、與磁體混合、擠壓、經(jīng)由流聚焦，或其組合。在另外方面中，攪拌足以形成乳劑。在另外方面中，擠壓包括對流體進(jìn)行移液，其中移液足以產(chǎn)生乳劑。在某些方面中，攪拌發(fā)生在微流體裝置中。

在各種方面中，第一流體包括水，第二流體包括油且第三流體包括水。

在各種方面中，多分散小滴包括多種乳劑。在另外方面中，通過組合三種或多于三種不混溶流體來制備多種乳劑。

在一些方面中，第一流體是含水的。在某些方面中，第一流體包括樣本。在另外方面中，第二流體是油。在某些方面中，第二流體是油，且第二流體與第一流體和第三流體不混溶。在一些方面中，第一流體不同于第三流體。在某些方面中，第三流體是油，且其中第三流體與第一流體和第二流體不混溶。

在一些方面中，乳劑包括水相和非水相。在另外方面中，第一流體包括水且第二流體包括油。

在某些方面中，多個多分散小滴進(jìn)一步包括流體界面改性元素。在另外方面中，流體界面改性元素是表面活性劑。在又另外方面中，流體界面改性元素是選自脂類、磷脂、糖脂、蛋白質(zhì)、肽、納米粒子、聚合物、沉淀物、微粒、具有疏水部分和親水部分的分子，或其組合。

在一些方面中，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括將不混溶流體中的一或多者轉(zhuǎn)化成凝膠或固體。在某些方面中，在擴增樣本之前、在擴增樣本期間或在擴增樣本之后將不混溶流體轉(zhuǎn)化成凝膠或固體。

在各種方面中，用于本發(fā)明的方法中的可檢測劑是熒光的或冷光的。在某些方面中，可檢測劑是熒光素、熒光素的衍生物、若丹明、若丹明的衍生物，或半導(dǎo)電聚合物。

如本文中所使用，術(shù)語“動態(tài)范圍”被界定為可改變量的最大可能值與最小可能值之間的比率。

術(shù)語“數(shù)字檢定”是指基于較小測量的計數(shù)進(jìn)行測量的檢定，其中每個較小測量是二元的，其具有為可被指派給所述測量的確切兩個可能值中的一者的值。本文中所描述的數(shù)字檢定包括基于從流體的個別體積獲得的二元測量的計數(shù)而測量流體中存在的樣本。

可在分析具有不同大小的體積以確定在哪些體積中已經(jīng)歷反應(yīng)(例如，具有經(jīng)擴增產(chǎn)物)之前或期間在所述體積中實行反應(yīng)(例如，擴增)。在某些實例中，可對體積(例如，小滴)進(jìn)行定大小，且對被占據(jù)小滴(例如，含有可檢測劑的小滴)的數(shù)目進(jìn)行計數(shù)?？煞治鲂〉沃械娜炕騼H僅一些小滴。可例如通過使小滴以單行流動穿過流式細(xì)胞儀或類似裝置而實現(xiàn)分析，其中可確定小滴的大小且可檢測擴增的存在?？衫缁趤碜孕〉蔚纳⑸湫盘柖_定小滴的大小，且可由來自小滴的熒光信號指示擴增的存在。替代地，可通過顯微術(shù)確定小滴的直徑?？蓮臉颖颈３制魈崛⌒〉?在完成反應(yīng)(例如，擴增)之前、期間或之后)，且使用CCD相機在寬場中使其成像。小滴(例如)可在表面上展開或嵌入在兩個玻璃載片之間，且放置在寬場顯微鏡下方。通過使用適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)和發(fā)射濾波器，可對小滴內(nèi)的熒光進(jìn)行量化以揭露擴增的存在或不存在。通過標(biāo)注小滴的大小以及擴增產(chǎn)物在每個小滴中的存在或不存在，有可能在詢問不同大小的足夠數(shù)目個小滴之后反算樣本中存在的分析物的原始濃度。因為小滴具有不同大小，所以對于給定動態(tài)范圍，分析會比小滴全部具有類似大小的情況快得多。在一些方面中，本文中的方法進(jìn)一步包含使用多個小滴中的若干小滴以及多個小滴中的小滴的個別體積以進(jìn)行數(shù)字測量。舉例來說，可使用多個小滴中的小滴的數(shù)目、多個小滴中具有一或多個所關(guān)注分子的小滴的數(shù)目且通過測量多個小滴中的一些或所有小滴的體積來確定所關(guān)注分子的樣本濃度?？稍趯嵗鹿?jié)中找到用于確定樣本濃度的實例方法。

在一些方面中，本公開提供用于執(zhí)行數(shù)字檢定的方法，其包括：產(chǎn)生多個多分散小滴，其中小滴中的至少一些小滴包括樣本；擴增樣本；使用可檢測劑標(biāo)記樣本；使多個多分散小滴流動穿過流式細(xì)胞儀通道；隨著小滴流動穿過流式細(xì)胞儀通道而確定小滴的體積；確定可檢測劑在小滴中的存在或不存在；以及基于可檢測劑在多個小滴中的存在或不存在而確定多個小滴中的樣本的濃度。

在某些方面中，確定樣本的濃度包括檢測從小滴散射的光。

本公開可用于數(shù)字測量提供關(guān)于樣本的有用信息的任何技術(shù)。因而，本文中所提供的方法、系統(tǒng)和裝置可包含含有可檢測劑的體積。在某些方面中，體積可為微流體芯片中的井或腔室或含有可檢測劑的小滴(例如，形成于乳劑中或芯片的表面上的小水滴)。通常將理解，可檢測劑可包含單個可檢測分子或多個可檢測分子?？墒褂闷渌愋偷目蓹z測劑，例如，珠粒、量子點、納米粒子，和類似者。此外，可檢測劑可例如為待分析的樣本中存在的所關(guān)注分子(例如，血液、血清、唾液或其他溶液中的核酸分子)。替代地，可檢測劑可為與樣本中的所關(guān)注分子(例如，核酸分子)相關(guān)聯(lián)的分子，由此允許檢測所述分子。在一些方面中，本公開的方法和系統(tǒng)可用于涉及數(shù)字測量的擴增相關(guān)技術(shù)(例如，數(shù)字PCR)。對于擴增測量，體積(例如，小滴)可例如包含單個DNA分子，但體積還將含有通常眾所周知為用于擴增和檢測的必要組分。在一些方面中，可檢測劑是熒光的，且因此可通過本領(lǐng)域中所知的基于熒光的檢測方法進(jìn)行檢測。然而，可使用其他檢測方法(例如，吸收、化學(xué)發(fā)光、濁度和/或散射)來分析體積的內(nèi)含物。適合于本公開的多種可檢測劑在本領(lǐng)域中通常是眾所周知的，且可例如在《分子探測劑手冊(Molecular Probes Handbook)》第11版(2010年)中被找到。

在某些方面中，可檢測劑可與用于檢測的所關(guān)注分子相關(guān)聯(lián)。舉例來說，可檢測劑可與核酸分子(例如，DNA或RNA)、肽、蛋白質(zhì)、脂類或存在于樣本中的其他分子(例如，生物分子)相關(guān)聯(lián)。如本文中所界定，在可檢測劑的上下文中的“關(guān)聯(lián)”包含經(jīng)由共價和/或非共價相互作用而與分子相互作用。舉例來說，可檢測劑可共價地附接到所關(guān)注分子。替代地，可檢測劑可(例如)為可用于檢測核酸分子(例如，DNA和/或RNA分子)的插層劑或Taqman探測劑。可使用其他可檢測劑，例如可不與所關(guān)注體積中的分子相關(guān)聯(lián)的參考染料。本公開進(jìn)一步包含確定樣本的濃度。舉例來說，所述方法和系統(tǒng)可用于確定(1)小滴的體積和(2)含有可檢測劑的小滴的數(shù)目，其可用于確定樣本的濃度(即，通過確定樣本在給定小滴中的存在或不存在)。此信息可以多種方式用于確定樣本濃度。舉例來說，目標(biāo)分子以一濃度(以分子/體積為單位)存在于樣本中。樣本可分布成可被分析的可變體積的小滴?？赏ㄟ^本文中所提供的方法來確定小滴(全部或僅僅一些)的個別體積。另外，通過使用本文中所描述的方法，可分析小滴是否含有可檢測劑。對于給定樣本濃度，一些可變體積小滴可含有可檢測劑，且一些可不含有可檢測劑。對于較高樣本濃度，通常多個小滴中的較多小滴將含有可檢測劑且反之亦然；對于低樣本濃度，多個小滴中的較少小滴可被可檢測劑占據(jù)。如本文中進(jìn)一步所描述，可針對廣泛范圍的樣本濃度來界定特定體積分布中的可檢測劑的占據(jù)概率，其隨后可與實際數(shù)據(jù)進(jìn)行比較以確定未知樣本的濃度。可在以下實例8中找到用于確定樣本濃度的額外公開內(nèi)容。實例8中所說明的方法涉及作出針對樣本濃度的初始估計，且隨后計算將被預(yù)測為含有一或多個可檢測劑的小滴(被占據(jù)小滴)的數(shù)目。隨后使用眾所周知的數(shù)值方法來調(diào)整針對樣本濃度的估計，直到被占據(jù)小滴的預(yù)測數(shù)目在所要的準(zhǔn)確度內(nèi)等于多個小滴中的被占據(jù)小滴的實際數(shù)目。

在一些方面中，本公開的方法包括僅在小滴包括樣本的情況下才測量小滴的體積。在另外方面中，所述方法包括將被確定為不包括樣本的任何小滴排除在測量之外。在一些方面中，根據(jù)本文中所公開的方法而通過識別、定大小或枚舉僅被確定為包括樣本的那些小滴來確定樣本濃度。在一些方面中，通過測量或知曉樣本的總體積且通過識別、定大小和枚舉僅被確定為包括樣本的那些小滴來確定樣本濃度。在另外方面中，通過測量或知曉樣本的總體積且通過枚舉所有肯定小滴且確定每個肯定小滴的體積來確定樣本中的分析物的濃度。此方法的優(yōu)點包含減少所掃描的小滴的數(shù)目且由此減少用于確定樣本濃度的分析時間。

如本文中進(jìn)一步所描述，本公開提供不能通過現(xiàn)有方法和系統(tǒng)實現(xiàn)的數(shù)字測量的各種方面。舉例來說，本公開可提供遍及廣泛動態(tài)范圍測量樣本濃度的能力。在一些方面中，動態(tài)范圍可為至少三個數(shù)量級、至少四個數(shù)量級、至少五個數(shù)量級或至少六個數(shù)量級。在一些方面中，動態(tài)范圍可介于以下各者之間：大約10與10¹⁰個分子/毫升、大約10²與10⁷個分子/毫升、大約10⁴與10¹⁰個分子/毫升、大約10⁵與10⁹個分子/毫升。在某些方面中，可通過檢測與樣本中的所關(guān)注分子相關(guān)聯(lián)的可檢測劑來執(zhí)行確定動態(tài)范圍內(nèi)的樣本濃度。動態(tài)范圍可取決于多種因素，例如乳劑中產(chǎn)生的體積的范圍和/或所分析和檢測的體積的范圍。在某些方面中，體積分布包含連續(xù)變化的小滴體積。

在一些方面中，使用濃度梯度在芯片上執(zhí)行本發(fā)明的方法。通過將dPCR與芯片上梯度產(chǎn)生整合，或通過使用不同大小的數(shù)字化體積，或這兩種方法的組合，本公開有效地將我們的dPCR芯片的動態(tài)范圍增加一到六個數(shù)量級，這與由RT-PCR提供的動態(tài)范圍相當(dāng)。通過使用較大范圍的濃度梯度或具有較大的大小差異的數(shù)字化體積陣列，可在需要時甚至進(jìn)一步增加動態(tài)范圍。用于實行定量PCR(qPCR)的此方法與現(xiàn)有技術(shù)相比較提供若干關(guān)鍵優(yōu)點：(1)其較準(zhǔn)確；(2)其不需要運行RT-PCR所需要的類型的校準(zhǔn)樣本，且因此具有較高通量；和(3)其不需要實時的敏感熒光檢測，其負(fù)責(zé)RT-PCR對標(biāo)準(zhǔn)PCR裝置的相對較高成本(～10x)。

本公開的另一方面包括一種用于實行本公開的方法的裝置，其中所述裝置產(chǎn)生不同大小的數(shù)字化和離散體積的陣列。在另一方面中，所述裝置實行用于增加樣本的數(shù)字測量的動態(tài)范圍的方法，所述方法包括產(chǎn)生樣本濃度梯度以及產(chǎn)生不同大小的樣本體積。

在一些方面中，本公開提供用于使用數(shù)字測量來確定樣本的濃度的方法。所述方法可包含：產(chǎn)生具有體積分布的多個小滴，其中多個小滴中的至少一個小滴含有來自樣本的內(nèi)含物；確定小滴的體積；確定樣本在小滴中的存在或不存在；以及使用被發(fā)現(xiàn)為含有可檢測劑的小滴的體積和小滴的數(shù)目來確定樣本的濃度。

在一些方面中，本公開包含用以增加基于產(chǎn)生不同大小(即，體積)的數(shù)字化和離散體積的陣列的數(shù)字測量的動態(tài)范圍的方法。此方法比簡單地增加數(shù)字化體積的數(shù)目以便增加動態(tài)范圍更佳。這是因為，簡單地增加數(shù)字化體積的數(shù)目會增加體積占據(jù)的面積，以及增加在一些數(shù)字化體積未適當(dāng)?shù)匦纬苫蚓哂衅渌毕莸男酒暇哂腥毕莸目赡苄?。簡單地增加?shù)字化體積的數(shù)目還會由于增加了分析所有數(shù)字化體積所需要的時間而減少了通量。在某些方面中，可通過產(chǎn)生不同大小的數(shù)字化體積的陣列而不是簡單地增加數(shù)字化體積的數(shù)目來增加動態(tài)范圍。不同大小的數(shù)字化體積的陣列可為隨機陣列(例如，不同直徑的小滴全部存在和隨機地分布于容器中)，或可為規(guī)則陣列。

樣本擴增

本公開還提供用于樣本(例如，核酸樣本)的擴增的方法、裝置和系統(tǒng)。在某些方面中，樣本擴增包括PCR。在另外方面中，樣本擴增包括dPCR。

在各種方面中，樣本包括核苷酸。在各種方面中，擴增樣本包括執(zhí)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、滾環(huán)擴增(RCA)、基于核酸序列的擴增(NASBA)、環(huán)介導(dǎo)擴增(LAMP)，或其組合。在另外方面中，擴增樣本包括核苷酸的等溫擴增或核苷酸的變溫擴增。

任何合適的裝置可用于執(zhí)行根據(jù)本公開的擴增?？砂喾N裝置特征，例如，用于維持或循環(huán)溫度的構(gòu)件，其可用于使能夠執(zhí)行基于PCR的擴增。其他裝置特征可包含但不限于溫水浴、保溫箱，和其他熱源，以及用于將熱捕獲到有限體積中的絕緣體。

在各種方面中，本公開提供用于執(zhí)行同質(zhì)檢定的方法、裝置和系統(tǒng)。如本文中所使用，術(shù)語“同質(zhì)檢定”是指所有檢定組分在檢測時以溶液相而存在的檢定。在同質(zhì)檢定中，檢定的任何組分都不散射可檢測光。

在另外方面中，本公開提供用于執(zhí)行非同質(zhì)檢定的方法、裝置和系統(tǒng)。如本文中所使用，術(shù)語“非同質(zhì)檢定”是指一或多個檢定組分在檢測時以固相而存在的檢定。術(shù)語非同質(zhì)檢定與術(shù)語“異質(zhì)檢定”可被互換地使用。例如在LAMP或滾環(huán)擴增中形成沉淀物或顆粒是常見形式的異質(zhì)檢定。在此類型的檢定中，固相組分可散射可檢測光。

在各種方面中，本公開提供用于通過執(zhí)行數(shù)字PCR(dPCR)進(jìn)行擴增的方法、裝置和系統(tǒng)。數(shù)字PCR是一種在一或多個目標(biāo)序列的PCR擴增之前將存在于樣本中的個別核酸分子分布到許多單獨反應(yīng)體積(例如，腔室或小份)的方法。調(diào)整樣本中的個別分子的濃度，使得至少一些反應(yīng)體積不含有目標(biāo)分子，且至少一些反應(yīng)體積含有至少一個目標(biāo)分子。目標(biāo)序列的擴增會引起二元數(shù)字輸出，其中將每個腔室識別為含有或不含有指示對應(yīng)目標(biāo)序列的存在的PCR產(chǎn)物。含有可檢測水平的PCR最終產(chǎn)物的反應(yīng)體積的計數(shù)是絕對核酸數(shù)量的直接量度。在本公開的各種方面中，通過將核酸樣本分割為單獨反應(yīng)體積來分布核酸樣本。隨后在存在PCR試劑的情況下對數(shù)字化樣本進(jìn)行熱循環(huán)，由此促進(jìn)核酸樣本的擴增。

在本公開的另外方面中，本文中所描述的方法、系統(tǒng)和裝置可應(yīng)用于等溫擴增技術(shù)，例如數(shù)字ELISA、NASBA和LAMP。ELISA是基于蛋白質(zhì)的，且通常用于蛋白質(zhì)或小分子的量化。NASBA和LAMP是已被開發(fā)以補充PCR的等溫擴增方案。

在等溫擴增中，與在傳統(tǒng)PCR中一樣，不發(fā)生溫度循環(huán)。存在若干類型的等溫核酸擴增方法，例如轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴增、基于核酸序列的擴增、RNA技術(shù)信號介導(dǎo)擴增、鏈置換擴增、滾環(huán)擴增、DNA環(huán)介導(dǎo)等溫擴增、等溫多重置換擴增、解旋酶相依擴增、單引物等溫擴增，以及循環(huán)解旋酶相依擴增。

NASBA(基于核酸序列的擴增)是用于擴增RNA的等溫(～40℃°)過程，且已成功地用于檢測臨床樣本中的病毒RNA和細(xì)菌RNA兩者。由NASBA提供的優(yōu)點是：(1)它具有高擴增效率和快擴增動力學(xué)，其中可在一小時或兩小時內(nèi)實現(xiàn)超過一千倍的擴增；(2)與在RT-PCR的情況下一樣，它沒有給出由基因組dsDNA造成的錯誤肯定；(3)可在不使用基因內(nèi)區(qū)側(cè)翼引物的情況下執(zhí)行基因表達(dá)研究；(4)它不需要PCR所需要的溫度控制和反饋的程度。因此，NASBA已變得普遍用于檢測病毒RNA和細(xì)菌RNA。NASBA是等溫方法的事實使有可能在使用溫度控制箱的情況下同時地運行多個樣本，這在許多領(lǐng)域工作中是重要的實踐優(yōu)點。

LAMP(其代表環(huán)介導(dǎo)等溫擴增)能夠在等溫條件(～60°℃)下以高特定性、效率和快速性擴增DNA。由于LAMP的擴增反應(yīng)的特性，LAMP能夠在擴增期間區(qū)分單核苷酸差異。結(jié)果，LAMP已應(yīng)用于SNP(單核苷酸多態(tài)性)分型。LAMP還已被示出為在檢測病毒方面具有比RT-PCR高大約10倍的敏感性。另外，因為DNA的LAMP擴增可與焦磷酸鎂的產(chǎn)生直接相關(guān)，這會增加溶液的濁度，所以已使用簡單的濁度計來監(jiān)測LAMP的進(jìn)展。因此，非同質(zhì)檢定可用于檢測由LAMP引起的擴增產(chǎn)物。

在一個方面中，本公開提供一種用于執(zhí)行樣本的數(shù)字環(huán)介導(dǎo)擴增的方法。所述方法可包含：在微流體裝置上產(chǎn)生樣本的多個小滴，其中多個小滴中的至少一個小滴包括核酸分子(例如，DNA和/或RNA分子)；以及在至少一個小滴中執(zhí)行環(huán)介導(dǎo)擴增以產(chǎn)生核酸分子的經(jīng)擴增產(chǎn)物。所述方法還可包含檢測經(jīng)擴增產(chǎn)物。在一些方面中，所述方法包含：確定多個小滴中包括經(jīng)擴增產(chǎn)物的小滴的數(shù)目；以及使用多個小滴中的小滴的個別體積和多個小滴中含有核酸分子的小滴的數(shù)目來計算樣本中的核酸分子的濃度。微流體裝置可包含被配置成形成多個小滴的多個腔室。

盡管NASBA和LAMP提供一些優(yōu)點，但一個重要缺點是難以按常規(guī)的實時方式或大批地執(zhí)行量化，按常規(guī)的實時方式或大批地執(zhí)行量化在大多數(shù)情形中是有益的。量化常常要求使用在同等條件下擴增的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行細(xì)致的校準(zhǔn)和控制，這可為非常繁瑣的(尤其對于現(xiàn)場研究)且在許多情況下不實用。對于非同質(zhì)檢定，例如，LAMP中的沉淀物檢測，準(zhǔn)確的校準(zhǔn)可尤其具挑戰(zhàn)性。通過采用端點檢測的本發(fā)明的數(shù)字方法來有效地解決此問題。

滾環(huán)擴增(RCA)是等溫核酸擴增方法。它在若干方面不同于聚合酶鏈反應(yīng)和其他核酸擴增方案。在RCA期間，短DNA探測劑退火到所關(guān)注目標(biāo)DNA，例如致病生物的DNA或含有有害變異的人類基因。探測劑隨后充當(dāng)用于滾環(huán)擴增反應(yīng)的引物。探測劑的自由端退火到小圓形DNA模板。添加DNA聚合酶來延伸引物。DNA聚合酶圍繞圓形DNA模板連續(xù)地延伸引物，從而產(chǎn)生由圓的許多重復(fù)副本組成的長DNA產(chǎn)物。在反應(yīng)結(jié)束時，聚合酶產(chǎn)生圓形模板的數(shù)千個副本，其中副本的鏈系接到原始目標(biāo)DNA。這允許目標(biāo)的空間解析和信號的快速擴增。使用正向和反向引物可將以上線性擴增反應(yīng)改變?yōu)橹笖?shù)模式，其可在1小時內(nèi)產(chǎn)生多達(dá)10¹²個副本。此類定量測量所需要的校準(zhǔn)可為麻煩的

為了克服此缺點，本公開提供數(shù)字等溫擴增，例如NASBA和LAMP，其中數(shù)字化體積陣列的使用(類似于數(shù)字PCR)用于實行數(shù)字NASBA、數(shù)字LAMP，以及滾環(huán)擴增。此外，通過使用不同大小的數(shù)字化體積的濃度梯度和/或陣列，我們可有效地增加這些數(shù)字測量的動態(tài)范圍。當(dāng)前方法理想地補充這些等溫擴增方案以使其成為用于測量RNA和DNA的存在的定量技術(shù)。在本公開的另一方面中，所述方法應(yīng)用于基于抗體的擴增。在另一方面中，所述方法應(yīng)用于基于特定分子辨識的擴增。

根據(jù)本公開可使用各種可檢測劑。在各種方面中，可檢測劑是熒光的。在另外方面中，可檢測劑是冷光的。所使用的可檢測劑可取決于所采用的擴增方法的類型。在一個方面中，信號產(chǎn)生可來自不連續(xù)特定熒光團，例如EvaGreen或SYBRgreen，其中熒光團在溶液中時猝熄，但可插入到雙鏈DNA中，其中其展現(xiàn)明亮得多的熒光。因此，在PCR期間產(chǎn)生的大量雙鏈DNA引起熒光的顯著增加。在另一方面中，使用連續(xù)特定熒光探測劑。在一個方面中，這由例如U形結(jié)構(gòu)的分子信標(biāo)組成，其熒光在其閉合構(gòu)造中高度地猝熄，且其強度在其雜交到經(jīng)擴增目標(biāo)DNA時就增加。在另一方面中，其由Taqman探測劑組成，其雜交到目標(biāo)DNA，且在下一個擴增步驟期間經(jīng)歷熒光報告從探測劑DNA的裂解。

這些探測劑具有不可忽略的背景熒光，且在擴增期間的強度的相對增加可相當(dāng)小，這取決于添加到反應(yīng)的探測劑的量。此外，激發(fā)強度可在檢測過程期間橫越視場而變化。在一些方面中，從圖像中的所有像素減去閾值像素強度值以確定小滴中的熒光強度是否大到足以指示擴增產(chǎn)物的存在。在一些方面中，可將參考染料添加到一或多種不混溶流體，參考染料的光譜特征可與報告擴增的熒光探測劑很好地分離，且參考染料的熒光信號對擴增或其他反應(yīng)或試劑條件不敏感。

分析方法和系統(tǒng)

在各種方面中，本公開提供用于執(zhí)行數(shù)字檢定的方法?？僧a(chǎn)生多個多分散小滴。小滴中的至少一些小滴可包括樣本。可擴增樣本。可使用可檢測劑標(biāo)記樣本?？色@得小滴的圖像棧?？蓮膱D像棧確定小滴的體積?？蓮膱D像棧確定可檢測劑在小滴中的存在或不存在?？苫诳蓹z測劑在多個小滴中的存在或不存在而確定多個小滴中的樣本的濃度。

可通過光學(xué)成像來獲得圖像棧?？赏ㄟ^光學(xué)成像來檢測可檢測劑?？梢栽S多方式執(zhí)行光學(xué)成像，例如通過共聚焦顯微術(shù)、線共聚焦顯微術(shù)、反卷積顯微術(shù)、旋轉(zhuǎn)盤顯微術(shù)、多光子顯微術(shù)、平面照明顯微術(shù)、Bessel光束顯微術(shù)、微分干涉差顯微術(shù)、相差顯微術(shù)、落射熒光顯微術(shù)、明場成像、暗場成像、傾斜照明，或其組合。在一些方面中，光學(xué)成像包括使用自適應(yīng)光學(xué)器件和成像。

圖像?？砂◤拇┻^單個小滴的單獨焦深取得的多個圖像。圖像棧可包括從針對小滴的單獨焦深取得的2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100個圖像。

可對多個小滴同時地執(zhí)行本公開的方法。多個多分散小滴可包括多分散小滴陣列。多分散小滴陣列可安置在多井板中。

可以許多方式從圖像棧確定小滴的體積，例如通過行掃描方法、簡單邊界方法、反向分水線方法、圓檢測方法、組合式反向分水線與圓檢測方法，或其組合?？杀榧爸辽偃齻€數(shù)量級的動態(tài)范圍或遍及至少六個數(shù)量級的動態(tài)范圍確定可檢測劑的濃度。

多個多分散小滴可包括第一流體和第二流體。第一流體可不混溶于第二流體中?？赏ㄟ^攪拌包括第一流體和第二流體的溶液而形成多分散小滴的乳劑，其中第一流體不混溶于第二流體中。為了形成多分散小滴的乳劑，可攪拌包括第一流體和第二流體的溶液。第一流體可不混溶于第二流體中?？稍诘谌黧w中攪拌乳劑。第三流體可不混溶于第二流體中，由此形成雙面乳劑?？梢栽S多方式攪拌流體，例如搖動、渦旋、聲波處理、與磁體混合、擠壓、流聚焦或其組合。攪拌可足以形成乳劑。舉例來說，擠壓可包括對流體進(jìn)行移液，其中移液足以產(chǎn)生乳劑。攪拌可發(fā)生在微流體裝置中。攪拌可例如為渦旋。所產(chǎn)生的乳劑可包括水相和非水相。第一流體可包括水且第二流體可包括油。第一流體可包括水，第二流體可包括油，且第三流體可包括水。

多個多分散小滴可包括多種乳劑?？赏ㄟ^組合三種或多于三種不混溶流體來制備多種乳劑。第一流體可為含水的。第一流體可包括樣本。第二流體可包括油。第二流體可包括油，且第二流體可與第一流體和第三流體不混溶。第一流體可不同于第三流體。第三流體可包括油，且第三流體可與第一流體和第二流體不混溶。

多個多分散小滴可進(jìn)一步包括流體界面改性元素。流體界面改性元素可包括表面活性劑。流體界面改性元素可選自脂類、磷脂、糖脂、蛋白質(zhì)、肽、納米粒子、聚合物、沉淀物、微粒、具有疏水部分和親水部分的分子，或其組合。

可將不混溶流體中的一或多者轉(zhuǎn)化成凝膠或固體。可在擴增樣本之前、在擴增樣本期間或在擴增樣本之后將不混溶流體轉(zhuǎn)化成凝膠或固體。

可檢測劑可為熒光的或冷光的?？蓹z測劑可包括以下各者中的一或多者：熒光素、熒光素的衍生物、若丹明、若丹明的衍生物，或半導(dǎo)電聚合物。樣本可包括核苷酸。

為了擴增樣本，可執(zhí)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、滾環(huán)擴增(RCA)、基于核酸序列的擴增(NASBA)、環(huán)介導(dǎo)擴增(LAMP)，或其組合。替代地或組合地，可通過核苷酸的等溫擴增或核苷酸的變溫擴增來擴增樣本。

小滴直徑分布可具有比中值小滴直徑大1000％、大500％、大100％、大50％、大30％、大20％、大15％、大10％、大9％、大8％、大7％、大6％或大5％的標(biāo)準(zhǔn)偏差。替代地或組合地，小滴直徑分布可具有比平均小滴直徑大1000％、大500％、大100％、大50％、大30％、大20％、大15％、大10％、大9％、大8％、大7％、大6％或大5％的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

多分散小滴中的體積可變化多于2倍、多于10倍、多于100倍、多于1000倍、多于10000倍、多于100000倍、多于1000000倍、多于大約2倍、多于大約10倍、多于大約100倍、多于大約1000倍、多于大約10000倍、多于大約100000倍或多于1000000倍。多分散小滴可具有以下范圍的體積分布：從100毫微升(nL)到1毫微微升(fL)、從10nL到10fL、從1nL到100fL、從100nL到1pL、從10nL到10pL，或從1nL到1pL、從大約500pL到大約50fL、從大約100pL到大約100fL。多分散小滴的平均體積可在擴增樣本期間改變少于50％、少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％，或少于1％。

擴增樣本可包括第一擴增循環(huán)，且少于50％、少于45％、少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于19％、少于18％、少于17％、少于16％、少于15％、少于14％、少于13％、少于12％、少于11％、少于10％、少于9％、少于8％、少于7％、少于6％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％或少于1％的多分散小滴可在第一擴增循環(huán)之后融合。

第一流體的折射率可與第二流體的折射率相差少于200％、少于100％、少于60％、少于50％、少于45％、少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于19％、少于18％、少于17％、少于16％、少于15％、少于14％、少于13％、少于12％、少于11％、少于10％、少于9％、少于8％、少于7％、少于6％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％，或少于1％。

在各種方面中，本公開提供用于執(zhí)行數(shù)字檢定的方法。可產(chǎn)生多個多分散小滴。小滴中的至少一些小滴可包括樣本?？蓴U增樣本?？墒褂每蓹z測劑標(biāo)記樣本?？墒苟鄠€多分散小滴流動穿過流式細(xì)胞儀通道?？呻S著小滴流動穿過流式細(xì)胞儀通道而確定小滴的體積?？纱_定可檢測劑在小滴中的存在或不存在。可基于可檢測劑在多個多分散小滴中的存在或不存在而確定多個小滴中的樣本的濃度。在一些方面中，可通過檢測從小滴散射的光來確定小滴的大小和/或小滴中的樣本的濃度。

在各種方面中，本公開提供用于執(zhí)行數(shù)字檢定的組合物。組合物可包括第一流體、第二流體、表面活性劑，以及擴增試劑。第一流體和第二流體可彼此不混溶且可能夠在被攪拌時形成乳劑。在一些方面中，組合物可進(jìn)一步包括例如核苷酸的樣本，和/或能夠標(biāo)記樣本的可檢測劑?？墒褂每蓹z測劑標(biāo)記樣本。

組合物可進(jìn)一步包括能夠結(jié)合核酸樣本的可檢測劑。

組合物的擴增試劑可選自聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑、滾環(huán)擴增(RCA)試劑、基于核酸序列的擴增(NASBA)試劑、環(huán)介導(dǎo)擴增(LAMP)試劑，或其組合。擴增試劑可包括PCR試劑，例如熱穩(wěn)定DNA聚合酶、核苷酸、引物、探測劑或其組合。

組合物可進(jìn)一步包括第三流體。第三流體可不混溶于第二流體中。組合物可能夠形成雙面乳劑。第一流體可為含水的。第一流體可包括擴增試劑。第二流體可包括油。第二流體可與第一流體和第三流體不混溶。第一流體可不同于第三流體。第三流體可包括油，且可與第一流體和第二流體不混溶。

組合物可進(jìn)一步包括流體界面改性元素。流體界面改性元素可包括表面活性劑。流體界面改性元素可選自脂類、磷脂、糖脂、蛋白質(zhì)、肽、納米粒子、聚合物、沉淀物、微粒、具有疏水部分和親水部分的分子，或其組合。

組合物可進(jìn)一步包括能夠?qū)⒉换烊芰黧w中的一或多者轉(zhuǎn)化成凝膠或固體的固化或膠凝劑。

在一些方面中，本公開提供用于執(zhí)行數(shù)字檢定的套件，其包括前述組合物中的任一者。

在各種方面中，本公開提供用于確定小滴的體積的系統(tǒng)。所述系統(tǒng)可包括容器、成像源，以及計算裝置。容器可被配置成用于保持小滴。成像源可被配置成獲得容器中的小滴的圖像。計算裝置可包括處理器和存儲器(例如，非暫時性有形計算機可讀存儲媒體，例如ROM、RAM、閃速存儲器，或類似者)。存儲器可存儲一組指令，所述一組指令在由處理器執(zhí)行時致使(i)成像源獲得小滴的圖像棧，以及(ii)處理器基于所獲得的圖像棧而確定樣本中的小滴的體積。

小滴可包括多個小滴。多個小滴可為多分散的。容器可包括多井板。

成像源可包括光學(xué)成像源。光學(xué)成像源可被配置成執(zhí)行共聚焦顯微術(shù)、線共聚焦顯微術(shù)、反卷積顯微術(shù)、旋轉(zhuǎn)盤顯微術(shù)、多光子顯微術(shù)、平面照明顯微術(shù)、Bessel光束顯微術(shù)、微分干涉差顯微術(shù)、相差顯微術(shù)、落射熒光顯微術(shù)、明場成像、暗場成像、傾斜照明，或其組合。

小滴的圖像棧可包括從穿過小滴的單獨焦深取得的多個圖像。圖像?？砂◤尼槍π〉蔚膯为毥股钊〉玫?、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100個圖像。

所述一組指令在由處理器執(zhí)行時可致使處理器通過以下操作來確定小滴的體積：(i)識別圖像棧的個別圖像中的像素組；(ii)將像素組識別為至少一個小滴的至少一部分；(iii)基于對應(yīng)而從像素組識別個別小滴；以及(iv)基于像素組而確定所識別的小滴的體積。至少一個小滴的至少一部分可包括單個小滴、多個小滴的多個部分、單個整個小滴、多個整個小滴，或其組合。

所述一組指令在由處理器執(zhí)行時可致使處理器基于所獲得的圖像棧而確定多個小滴的多個體積。所述一組指令在由處理器執(zhí)行時可進(jìn)一步致使處理器確定可檢測劑在多個小滴中的至少一些小滴中的存在或不存在。所述一組指令在由處理器執(zhí)行時可進(jìn)一步致使處理器基于可檢測劑在多個小滴中的存在或不存在以及多個小滴的所確定的多個體積而確定多個小滴中的樣本的濃度。樣本可包括核苷酸?？蓹z測劑可為熒光的或冷光的?？蓹z測劑可包括熒光素、熒光素的衍生物、若丹明、若丹明的衍生物，或半導(dǎo)電聚合物。

多個小滴可包括樣本，樣本包括核苷酸。多個小滴中的樣本可已被擴增?？梢淹ㄟ^執(zhí)行以下各者來擴增多個小滴中的樣本：聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)(dPCR)、滾環(huán)擴增(RCA)、基于核酸序列的擴增(NASBA)、環(huán)介導(dǎo)擴增(LAMP)，或其組合?？梢淹ㄟ^核苷酸的等溫擴增或核苷酸的變溫擴增來擴增樣本。所述一組指令在由處理器執(zhí)行時可致使遍及至少三個數(shù)量級的動態(tài)范圍或遍及至少六個數(shù)量級的動態(tài)范圍確定可檢測劑的濃度。

在各種方面中，本公開提供用于確定小滴的體積的方法?？色@得小滴的圖像棧?？勺R別圖像棧的個別圖像中的像素組?？蓪⑾袼亟M識別為對應(yīng)于至少一個小滴的至少一部分，其可包括單個小滴的一部分、多個小滴的多個部分、整個小滴、多個整個小滴，或其組合?？苫趯?yīng)而從像素組識別個別小滴?？苫谙袼亟M而確定所識別的個別小滴的體積。

可通過獲得從穿過小滴的單獨焦深取得的多個圖像而獲得樣本的圖像棧?？蓮尼槍π〉蔚膯为毥股钊〉?、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100個圖像。

可通過以以下方式單獨地或以各種組合使用圖像棧的至少一個圖像來確定所識別的小滴的直徑而確定所識別的小滴的體積。1、可使所識別的小滴在圖像棧的多個圖像之間相關(guān)，且可測量多個圖像中的所識別的小滴的最大直徑。2、可使曲線擬合到所識別的小滴的邊界，且可基于所擬合的曲線而內(nèi)插所識別的小滴的直徑。3、可使所識別的小滴的直徑在圖像棧的多個圖像之間相關(guān)，可在每個圖像中識別所識別的小滴的直徑，且可從圖像棧的多個圖像中的所識別的小滴的直徑確定所識別的小滴的直徑。4、可使所識別的小滴在圖像棧的多個圖像之間相關(guān)，可在每個圖像中確定所識別的小滴的直徑，且可從圖像棧的多個圖像中的所識別的小滴的直徑以及多個圖像之間的圖像深度差確定所識別的小滴的直徑。還預(yù)期確定所識別的小滴的直徑的其他方式，且其在本公開的范圍內(nèi)。

可確定多個小滴的體積?？蓮膱D像棧確定可檢測劑在多個小滴中的存在或不存在?？苫诳蓹z測劑在多個小滴中的存在或不存在以及多個小滴的所確定的體積而確定多個小滴中的樣本的濃度。

樣本可包括核苷酸?？梢栽S多方式來擴增多個小滴中的樣本，例如通過執(zhí)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、滾環(huán)擴增(RCA)、基于核酸序列的擴增(NASBA)、環(huán)介導(dǎo)擴增(LAMP)，或其組合。替代地或組合地，可通過核苷酸的等溫擴增或核苷酸的變溫擴增來擴增樣本。

可遍及至少三個數(shù)量級的動態(tài)范圍或遍及至少六個數(shù)量級的動態(tài)范圍確定可檢測劑的濃度?？蓹z測劑可為熒光的或冷光的?？蓹z測劑可包括熒光素、熒光素的衍生物、若丹明、若丹明的衍生物，或半導(dǎo)電聚合物。

可通過光學(xué)成像來獲得圖像棧?？赏ㄟ^以下各者執(zhí)行光學(xué)成像：共聚焦顯微術(shù)、線共聚焦顯微術(shù)、反卷積顯微術(shù)、旋轉(zhuǎn)盤顯微術(shù)、多光子顯微術(shù)、平面照明顯微術(shù)、Bessel光束顯微術(shù)、微分干涉差顯微術(shù)、相差顯微術(shù)、落射熒光顯微術(shù)、明場成像、暗場成像、傾斜照明，或其組合。

可獲得多個多分散小滴的圖像棧。多個多分散小滴可包括第一流體和第二流體。第一流體可不混溶于第二流體中?？赏ㄟ^攪拌包括第一流體和第二流體的溶液而形成多分散小滴的乳劑。為了獲得圖像棧，可使所形成的乳劑成像。第一流體可包括水且第二流體可包括油。

此外，可通過攪拌包括第一流體和第二流體的溶液而形成多分散小滴的乳劑。第一流體可不混溶于第二流體中。而且，可在第三流體中攪拌乳劑。第三流體可不混溶于第二流體中，由此形成雙面乳劑。第一流體可包括水，第二流體可包括油，且第三流體可包括水。可以許多方式攪拌流體，例如通過搖動、渦旋、聲波處理、與磁體混合、擠壓、流聚焦或其組合。攪拌可足以形成乳劑。擠壓(例如)可包括對流體進(jìn)行移液，其中移液足以產(chǎn)生乳劑。攪拌可發(fā)生在微流體裝置中。

乳劑可包括水相和非水相。多分散小滴可包括多種乳劑。多分散小滴可包括多種乳劑?？赏ㄟ^組合三種或多于三種不混溶流體來制備多種乳劑。三種或多于三種不混溶流體可包括第一流體、第二流體和第三流體。第一流體可為含水的。第二流體可包括油。第二流體可與第一流體和第三流體不混溶?？蓪⒉换烊艿牡谝弧⒌诙?或第三流體轉(zhuǎn)化成凝膠或固體。第一流體可不同于第三流體。第三流體可包括油。第三流體可與第一流體和第二流體不混溶?？蓪⒉换烊艿牡谌黧w轉(zhuǎn)化成固體或凝膠。第一流體可包括用于檢測的樣本。第一流體的折射率可與第二流體的折射率相差少于200％、少于100％、少于60％、少于50％、少于45％、少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于19％、少于18％、少于17％、少于16％、少于15％、少于14％、少于13％、少于12％、少于11％、少于10％、少于9％、少于8％、少于7％、少于6％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％，或少于1％。

多個多分散小滴可進(jìn)一步包括流體界面改性元素。流體界面改性元素可包括表面活性劑。流體界面改性元素可選自脂類、磷脂、糖脂、蛋白質(zhì)、肽、納米粒子、聚合物、沉淀物、微粒、具有疏水部分和親水部分的分子，或其組合。舉例來說，流體界面改性元素可包括基于PEG的表面活性劑。

小滴直徑分布可具有比中值小滴直徑大1000％、大500％、大100％、大50％、大30％、大20％、大15％、大10％、大9％、大8％、大7％、大6％或大5％的標(biāo)準(zhǔn)偏差。小滴直徑分布可具有比平均小滴直徑大1000％、大500％、大100％、大50％、大30％、大20％、大15％、大10％、大9％、大8％、大7％、大6％或大5％的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

多分散小滴中的體積可變化多于2倍、多于10倍、多于100倍、多于1000倍、多于10000倍、多于100000倍、多于1000000倍、多于大約2倍、多于大約10倍、多于大約100倍、多于大約1000倍、多于大約10000倍、多于大約100000倍或多于1000000倍。

多分散小滴可具有以下范圍的體積分布：從100毫微升(nL)到1毫微微升(fL)、從10nL到10fL、從1nL到100fL、從100nL到1pL、從10nL到10pL，或從1nL到1pL、從大約500pL到大約50fL、從大約100pL到大約100fL。

可擴增樣本以用于在多分散小滴中進(jìn)行檢測。

多分散小滴的平均體積可在擴增樣本期間改變少于50％、少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％，或少于1％。

擴增樣本可包括第一擴增循環(huán)，且少于50％、少于45％、少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于19％、少于18％、少于17％、少于16％、少于15％、少于14％、少于13％、少于12％、少于11％、少于10％、少于9％、少于8％、少于7％、少于6％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％或少于1％的多分散小滴可在第一擴增循環(huán)之后融合。

此外，可通過以下操作來識別圖像棧的個別圖像中的像素組：在個別圖像內(nèi)獲得多個行掃描；設(shè)置閾值水平；以及將在閾值水平之外的多個行掃描中的區(qū)域識別為像素組(例如，如果所述區(qū)域低于或高于閾值水平，那么所述區(qū)域可在閾值水平之外)。雖然本文中大體上論述行掃描，但還預(yù)期產(chǎn)生掃描的其他方法。這些方法可包含共聚焦掃描、行照明和收集、Nipkow盤型掃描，或類似者。

為了識別圖像中的一或多個小滴，可使用簡單邊界方法。為了執(zhí)行簡單邊界方法，可識別高于閾值的圖像棧的個別圖像的一或多個像素組。像素組可包含單個小滴的一部分、多個小滴的多個部分、整個小滴、多個整個小滴，或其組合?？赏ㄟ^確定像素組的縱橫比而將像素組識別為對應(yīng)于一個小滴。可在像素組的縱橫比小于或等于閾值時將像素組識別為對應(yīng)于一個小滴。閾值可為1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2。

為了識別圖像中的小滴，可執(zhí)行反向分水線方法。執(zhí)行反向分水線方法可包括：基于圖像棧的個別圖像的像素強度而產(chǎn)生地圖；識別所產(chǎn)生的地圖中的一或多個像素組；將個別像素組識別為所關(guān)注區(qū)；使所關(guān)注區(qū)的邊界與最佳擬合圓擬合。像素組可包含單個小滴的一部分、多個小滴的多個部分、整個小滴、多個整個小滴，或其組合?？稍诋a(chǎn)生地圖之前使圖像棧的個別圖像平滑?；趫D像棧的個別圖像的像素強度而產(chǎn)生的地圖可包括拓?fù)涞貓D。為了識別一或多個像素組，可基于個別像素的像素強度以及一或多個閾值而確定個別像素是否包括背景像素或小滴像素?？稍趥€別像素組具有高于最小所需區(qū)域的區(qū)域時將個別像素組識別為所關(guān)注區(qū)。此外，可確定個別像素組是否包括多個所關(guān)注區(qū)，且可將多個所關(guān)注區(qū)組合為單個所關(guān)注區(qū)。所關(guān)注區(qū)可包含單個小滴的一部分、多個小滴的多個部分、整個小滴、多個整個小滴，或其組合。

為了識別圖像中的一或多個小滴，可執(zhí)行圓檢測方法。為了執(zhí)行圓檢測方法，可識別高于閾值的圖像棧的個別圖像的一或多個像素組，可將多個圓疊加在所識別的一或多個像素組上方，可在所疊加的多個圓中的一或多個圓不滿足至少一個預(yù)定準(zhǔn)則時拒絕所述一或多個圓，且可將一或多個剩余圓識別為對應(yīng)于小滴。像素組可包含單個小滴的一部分、多個小滴的多個部分、整個小滴、多個整個小滴，或其組合。

為了識別圖像中的一或多個小滴，可執(zhí)行組合式反向分水線與圓檢測方法。為了執(zhí)行組合式反向分水線與圓檢測方法，可產(chǎn)生基于圖像棧的個別圖像的像素強度的地圖，可識別地圖中的一或多個像素組，可將個別像素組識別為所關(guān)注區(qū)，可將多個圓疊加在所關(guān)注區(qū)上方，可在所疊加的多個圓中的一或多個圓不滿足至少一個預(yù)定準(zhǔn)則時拒絕所述一或多個圓，且可將一或多個剩余圓識別為對應(yīng)于一個小滴。像素組可包含單個小滴的一部分、多個小滴的多個部分、整個小滴、多個整個小滴，或其組合?？稍诋a(chǎn)生地圖之前使圖像棧的個別圖像平滑。基于圖像棧的個別圖像的圖像強度的地圖可包括拓?fù)涞貓D。為了識別一或多個像素組，可基于個別像素的像素強度以及一或多個閾值而將個別像素識別為背景像素或小滴像素。所關(guān)注區(qū)可包含單個小滴的一部分、多個小滴的多個部分、整個小滴、多個整個小滴，或其組合。

可在個別像素組具有高于最小所需區(qū)域的區(qū)域的情況下將個別像素組確定為包括所關(guān)注區(qū)。至少一個預(yù)定準(zhǔn)則可包括以下各者中的一或多者：(i)選擇包含所關(guān)注區(qū)的外部邊界像素的最大分?jǐn)?shù)的一或多個圓；(ii)選擇包含所關(guān)注區(qū)的區(qū)域的最大分?jǐn)?shù)的一或多個圓；(iii)拒絕包含來自與所關(guān)注區(qū)不同的像素群組的像素的一或多個圓；(iv)拒絕包含大量非群組像素的一或多個圓；或(v)排斥在像素群組的內(nèi)部中具有它們的圓周的巨大分?jǐn)?shù)的一或多個圓。

為了拒絕一或多個圓，可成對地檢查多個所疊加的圓。被檢查的圓可包括第一圓和第二圓。此外，可基于可為用戶定義的投票而拒絕第一圓或第二圓中的一者。

可通過將一或多個剩余圓指派給一個小滴而將一或多個剩余圓識別為對應(yīng)于一個小滴。可基于以下各者中的一或多者而將一或多個圓指派給一個小滴：(i)向小滴指派與小滴具有最佳擬合優(yōu)度統(tǒng)計的圓；或(ii)將所關(guān)注區(qū)指派給在區(qū)域上與所關(guān)注區(qū)的一或多個圓具有最大重疊的小滴。

為了基于所關(guān)注區(qū)而確定所識別的小滴的體積，可確定對應(yīng)于小滴的一或多個所識別的圓的一或多個直徑。

在各種方面中，本公開提供用于執(zhí)行數(shù)字檢定的系統(tǒng)。所述系統(tǒng)可包括容器、成像源，以及計算裝置。容器可被配置成用于保持多個多分散小滴。小滴中的至少一些小滴可包括使用可檢測劑標(biāo)記的樣本。成像源可被配置成獲得容器中保持的多個多分散小滴的圖像棧。計算裝置可被配置成操作成像源。計算裝置可包括處理器和存儲器(例如，非暫時性有形計算機可讀存儲媒體，例如ROM、RAM、閃速存儲器，或類似者)。存儲器可存儲一組指令，所述一組指令在由處理器執(zhí)行時致使(i)成像源獲得容器中保持的多個多分散小滴的圖像棧，(ii)處理器基于所獲得的圖像棧而確定多個多分散小滴的體積，(iii)處理器確定可檢測劑在多個多分散小滴中的存在或不存在，以及(iv)處理器基于可檢測劑在多個多分散小滴中的存在或不存在以及多個多分散小滴的體積而確定多個小滴中的樣本的濃度。

容器可包括多井板。成像源可包括光學(xué)成像源。光學(xué)成像源可被配置成執(zhí)行以下各者中的一或多者：共聚焦顯微術(shù)、線共聚焦顯微術(shù)、反卷積顯微術(shù)、旋轉(zhuǎn)盤顯微術(shù)、多光子顯微術(shù)、平面照明顯微術(shù)、Bessel光束顯微術(shù)、微分干涉差顯微術(shù)、相差顯微術(shù)、落射熒光顯微術(shù)、明場成像、暗場成像、傾斜照明，或其組合。

所獲得的圖像?？砂◤拇┻^單個小滴的單獨焦深取得的多個圖像。圖像?？砂◤尼槍蝹€小滴的單獨焦深取得的2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100個圖像。

所述一組指令在由處理器執(zhí)行時可致使處理器通過以下操作來確定多個多分散小滴的體積：(i)識別圖像棧的個別圖像中的像素組；(ii)將像素組識別為對應(yīng)于至少一個小滴的至少一部分(其可包括單個小滴的一部分、多個小滴的多個部分、整個小滴、多個整個小滴，或其組合)；(iii)從像素組識別個別小滴；以及(iv)基于像素組而確定所識別的小滴的體積。

樣本可包括核苷酸。樣本可已被擴增?？蓹z測劑可為熒光的或冷光的。多個多分散小滴可包括第一流體和第二流體，第一流體與第二流體不混溶。

本公開的系統(tǒng)進(jìn)一步包含被配置成分析體積以及樣本在多個小滴中的存在或不存在的檢測系統(tǒng)。檢測系統(tǒng)可包含用于分析體積的內(nèi)含物、確定小滴的體積和/或其他所關(guān)注特性的檢測器。本文中所描述的方法將與能夠檢測和分析體積(例如，小滴和/或井)的任何已知系統(tǒng)大體上兼容。

在各種方面中，本公開提供用于執(zhí)行樣本的數(shù)字測量的系統(tǒng)和方法。在某些方面中，可識別小滴且使用目前描述的系統(tǒng)和方法來測量小滴的體積。在一些方面中，通過獲得給定小滴的圖像棧來測量小滴的體積。圖像棧中的每個圖像對應(yīng)于在單個平面中取得的測量。獲得給定小滴中的兩個或多于兩個平面的圖像使能夠確定小滴體積。如果小滴足夠小，那么可有可能從其在圖像棧的單個圖像中的外觀確定其體積。圖像棧還可被稱作“z?！?，這是因為焦平面通常在顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的z方向上被分離用戶選擇的距離。給定z棧的高度可與所使用的顯微鏡物鏡的工作距離一樣大。在另外方面中，可針對給定小滴確定樣本在給定小滴中的存在或不存在。在某些方面中，小滴體積以及樣本在多個小滴中的每一者中的存在或不存在的確定可用于確定多個多分散小滴中的任何給定小滴將含有樣本的概率，所述概率隨后可用于確定樣本的濃度。

在各種方面中，本公開提供用于使用數(shù)字測量來確定樣本的濃度的系統(tǒng)。所述系統(tǒng)可包含：樣本保持器，其含有具有體積分布的多個多分散小滴；檢測器，其用于檢測小滴大小(即，體積)以及多個多分散小滴中的至少一個小滴中含有的可檢測劑；以及計算機，其包括被存儲有可執(zhí)行指令的存儲器裝置，所述指令在由處理器執(zhí)行時致使處理器進(jìn)行以下操作：分析具有體積分布的多個多分散小滴以確定小滴的體積以及它們是否含有可檢測劑以確定樣本的濃度。在一些方面中，樣本中的可檢測劑的濃度用于計算樣本濃度。在各種方面中，可檢測劑的濃度與樣本的濃度直接相關(guān)。

在各種方面中，通過光學(xué)檢測方法檢測小滴直徑以及可檢測劑的存在。通過檢測可測量的光學(xué)性質(zhì)(例如光的存在)而操作的任何檢測器或其組件包括光學(xué)檢測器。光學(xué)檢測器的實例包含但不限于相機、光電倍增管、光電二極管和光電二極管陣列，以及顯微鏡，及其關(guān)聯(lián)組件，例如物鏡、光學(xué)濾波器、鏡子，和類似者。

在某些方面中，處理由光學(xué)檢測器或其他合適檢測器檢測的信號，以便解釋由檢測器測量的信號。在某些方面中，由存儲和/或處理由檢測器(例如，光學(xué)檢測器)獲取的信息的裝置、設(shè)備或其組件處理所測量的信息。信息處理器的實例包含但不限于個人計算裝置，其存儲由檢測器獲取的信息，以及在個人計算裝置上運行的處理所述信息的軟件。在其他方面中，信息處理器或其組件可嵌入在檢測器中，例如在嵌入在相機的永久地或臨時地存儲由相機獲取的光學(xué)信息的芯片中。在其他方面中，信息處理器和檢測器可為既獲取又處理光學(xué)信息以執(zhí)行數(shù)字檢定的完全集成裝置的組件。

在又一方面中，所述系統(tǒng)可包含用于進(jìn)行數(shù)字測量的計算機可讀存儲媒體。計算機可讀存儲媒體具有存儲在其上的指令，所述指令在由計算機的一或多個處理器執(zhí)行時致使計算機進(jìn)行以下操作：分析具有體積分布的多個小滴以確定多個小滴中含有可檢測劑的小滴的數(shù)目；以及使用多個小滴中的小滴的數(shù)目、多個小滴中的一些或所有小滴的體積和第二多個小滴中含有一或多個可檢測劑的小滴的數(shù)目來確定樣本中的可檢測劑的濃度。

在另一方面中，提供用于分析體積以檢測和計算給定小滴的信息的系統(tǒng)。所述系統(tǒng)包含一或多個處理器，以及包含可由一或多個處理器執(zhí)行的指令的存儲器裝置。當(dāng)由一或多個處理器執(zhí)行指令時，所述系統(tǒng)至少接收用戶輸入來分析體積(例如，多個小滴)。所述系統(tǒng)可被配置成實行本公開的方法的多個方面，例如對體積(例如，小滴)的數(shù)目進(jìn)行計數(shù)，確定體積分布中的多個小滴的體積，以及使用含有一或多個可檢測劑的小滴的數(shù)目來確定樣本中的可檢測劑的濃度。所述系統(tǒng)還向用戶提供數(shù)據(jù)。提供給用戶的數(shù)據(jù)可包含樣本中的可檢測劑的濃度或樣本濃度。

在本公開的一些方面中，通過在特定波長范圍內(nèi)的熒光的增加來指示一或多個目標(biāo)分子在小滴內(nèi)的存在。在一些方面中，PCR反應(yīng)產(chǎn)物通過在特定波長范圍內(nèi)的熒光(指示劑熒光)的增加來指示目標(biāo)分子的存在。在一些方面中，可與目標(biāo)分子并行地利用參考劑。根據(jù)此方面，小滴發(fā)射在與目標(biāo)分子的波長范圍分離的波長范圍內(nèi)的熒光(即，參考熒光)，而不管是否存在目標(biāo)分子。對于一組給定小滴，獲得指示劑熒光和參考熒光的單獨組圖像，且識別和測量每個圖像中的小滴?？杀容^來自給定小滴的指示劑熒光和參考熒光。在一些方面中，指示劑熒光對參考熒光的比率可用于指示所述特定小滴是否含有目標(biāo)分子。在其他方面中，指示劑熒光的絕對強度將足以指示小滴是否含有目標(biāo)。在一些方面中，在比較指示劑的熒光強度和參考強度之前，可從小滴內(nèi)的像素強度減去背景像素的平均值或其倍數(shù)。通過執(zhí)行此分析，獲得小滴直徑的列表，且對于每個所測量的小滴，獲得界定小滴是否被占據(jù)(含有一或多個目標(biāo)分子)的二元量度。被占據(jù)小滴的小滴大小和總數(shù)的列表隨后可用于獲得樣本的目標(biāo)濃度。

在應(yīng)用本公開的方法時，存在用于測量乳劑中的多分散小滴的大小、內(nèi)含物和/或其他方面的許多可能方式。在一些方面中，可由包括流式細(xì)胞儀的光學(xué)檢測器光學(xué)地測量小滴。根據(jù)此方面，小滴可流過大流動通道，其中小滴形狀未失真，且它們的體積可在小滴通過光激發(fā)源時由計算機軟件基于由光學(xué)檢測器(例如，光電倍增管)獲取的光散射圖案的測量而確定。在其他方面中，小滴可穿過窄流動通道，其中小滴與通道寬度相符。根據(jù)此方面，可通過使用通道寬度以及通道中的個別小滴的長度來界定小滴的體積而確定分散小滴的體積。

根據(jù)本公開可使用多種信號檢測方法。在各種方面中，本發(fā)明的方法和系統(tǒng)實現(xiàn)使用光學(xué)檢測方法和光學(xué)檢測器來檢測小滴方面。在一些方面中，可由包括熒光顯微鏡及其關(guān)聯(lián)組件的光學(xué)檢測器光學(xué)地測量乳劑系統(tǒng)?？衫缡褂霉簿劢辜す鈷呙栾@微鏡、旋轉(zhuǎn)盤(Nipkow盤)共聚焦顯微鏡或使用鏡子或空間光調(diào)制器的可編程陣列以從多個焦深獲取數(shù)據(jù)的顯微鏡來獲取圖像。在其他方面中，可使用落射熒光顯微鏡獲取圖像。在一些方面中，隨后可使用由計算機軟件執(zhí)行的3D反卷積算法來處理使用落射熒光顯微鏡獲取的圖像。在其他方面中，可使用多光子顯微鏡(例如，二光子顯微鏡)來獲取圖像。在其他方面中，可使用平面照明顯微術(shù)、Bessel光束顯微術(shù)、微分干涉差顯微術(shù)、相差顯微術(shù)、明場成像、暗場成像或傾斜照明來獲取圖像。在一些方面中，可使用本文中所列出的成像裝置和方法或可合理地應(yīng)用于本發(fā)明的方法的任何其他合適成像裝置和方法的組合來獲取圖像。

小滴成像的方法提供關(guān)于小滴大小以及小滴是否含有所關(guān)注目標(biāo)分子兩者的信息，其根據(jù)本發(fā)明的方法而用于確定樣本濃度。在一些方面中，可基于使用共聚焦熒光顯微術(shù)獲取的光學(xué)信息而確定小滴大小和信號強度。根據(jù)此方面，乳劑可存儲在井、腔室或其他容器中，且可從其獲取多組圖像棧。在一些方面中，對于給定多分散小滴樣本中的每個樣本區(qū)域，收集圖像棧，所述圖像棧由在大致相同的XY位置(相同的樣本區(qū)域)但不同的Z位置(不同的深度)處取得的至少兩個圖像組成。樣本區(qū)域中大于Z中的間距的小滴將在大致相同的XY位置處出現(xiàn)在多個幀中，但具有不同的直徑。圖像棧使能夠確定各種參數(shù)，包含小滴大小以及目標(biāo)分析物在小滴中的存在或不存在。

在一些方面中，由信息處理器僅基于在含有最大直徑的Z棧的幀中確定的小滴邊界而確定小滴直徑。在其他方面中，由信息處理器基于在Z棧中的多個圖像處確定的小滴邊界以及Z維度上的圖像的相對位置而確定小滴直徑。此方法可包含假設(shè)球形小滴形狀，或某一其他經(jīng)修改形狀，這取決于多個因素，包含兩種流體的折射率、兩種流體的相對密度以及表面張力。

根據(jù)本公開，存在用于識別和選擇個別小滴的眾多方法。在一個方面中，在圖像內(nèi)獲得行掃描，且在設(shè)置適當(dāng)閾值水平之后，測量所關(guān)注區(qū)的直徑。在另一方面中，選擇每個圖像的閾值，且將高于閾值的區(qū)域評估為可能的單個小滴。如果所述區(qū)域足夠圓(即，具有低于選定閾值水平的縱橫比)，那么將所述區(qū)域視為單個小滴。針對每個圖像產(chǎn)生小滴列表。

在一些方面中，一旦已識別圖像中的小滴，就使它們在圖像棧的不同幀之間相關(guān)。最大的小滴將出現(xiàn)在多于一個圖像中，因此有必要穿過圖像棧的幀來識別圓的痕跡?？扇菀椎赝ㄟ^使用本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所知的任何數(shù)目種合適跟蹤算法來實現(xiàn)小滴相關(guān)。通常由于小滴在幀之間不會顯著地移動的事實且因為所關(guān)注小滴相當(dāng)大(以像素計)而促進(jìn)跟蹤。根據(jù)本公開，特定小滴的直徑可被假設(shè)為在圖像棧中與所述小滴相關(guān)聯(lián)的最大圓的直徑。替代地，可使曲線擬合到特定小滴的圓直徑且從所述曲線內(nèi)插最大直徑。所述最大直徑隨后將用作小滴的直徑。在本公開的各種方面中，獲得圖像棧中的多個圖像且將其用于確定給定小滴的各種所關(guān)注參數(shù)，且不要求小滴自身經(jīng)歷額外檢定。

本發(fā)明的方法服從自動化，且可使用任何合適方法來用于識別、選擇和分析小滴以及那些小滴內(nèi)含有的樣本。示范性方法包含行掃描方法、簡單邊界方法、反向分水線方法、經(jīng)修改反向分水線方法、圓檢測方法、圓Hough變換方法，以及組合式反向分水線與圓檢測方法。還預(yù)期其他方法且其在本公開的范圍內(nèi)。下文描述這些方法中的每一者。

行掃描方法。在本公開的一個方面中，可使用行掃描方法來分析多分散小滴系統(tǒng)中的小滴。根據(jù)此方面，在圖像內(nèi)獲得行掃描，且在設(shè)置適當(dāng)信號閾值水平之后，測量所關(guān)注區(qū)的直徑。

簡單邊界方法。在本公開的一個方面中，可使用簡單邊界方法來分析多分散小滴系統(tǒng)中的小滴。根據(jù)此方面，起初選擇每個圖像的閾值。將給定樣本中高于閾值的像素組評估為可能的單個小滴。如果像素組足夠圓(即，具有低于選定水平的縱橫比)，那么將所述區(qū)域視為單個小滴。隨后針對每個圖像產(chǎn)生小滴列表。

反向分水線方法。在本公開的一個方面中，可使用反向分水線方法來分析多分散小滴系統(tǒng)中的小滴。在標(biāo)準(zhǔn)分水線方法中，將圖像的像素強度視為3D構(gòu)形地圖中的評估。在局部極小值處引入“水”，其中水相對于全局零點的高度對于所有“池”是相同的。隨著水高度均一地升高，不同池中的水將合并。不同池合并的像素位置用于在圖像內(nèi)構(gòu)建單獨區(qū)。

在反向分水線方法中，相同地處理像素，但起初使“水”位置于圖像中的最高“峰”上方，且隨后排泄水，從而維持水貫穿圖像的相同高度。隨著水位下降，最密集的像素將作為小島突出在水上方。這些島被標(biāo)注為小滴的潛在質(zhì)心，且隨著水位下降而跟蹤每個“島”的大小。此過程繼續(xù)直到水位已下降到預(yù)定閾值。將島看作可為單個小滴的全部或部分的區(qū)。由于測量噪聲，有可能使單個小滴在以上過程期間出現(xiàn)時具有兩個或多于兩個峰。圖1表示以灰度示出的典型圖像?？赏ㄟ^在這些參數(shù)內(nèi)擬合的任何合適手段來執(zhí)行反向分水線方法。以下實例3描述一組示范性步驟，借此可根據(jù)本公開的一方面執(zhí)行反向分水線方法。

根據(jù)本公開的一些方面，可通過以下操作來執(zhí)行反向分水線方法：首先確定每個圖像的背景內(nèi)的信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差，且使其乘以信噪比(通常為2.5到3.5，然而，信噪比可由用戶取決于存在于圖像中的噪聲的量而調(diào)整)，且將結(jié)果加到背景像素的平均強度。此過程可迭代地進(jìn)行，且背景截止的初始估計用于識別可能的背景像素(強度小于初始估計的那些像素)。這些像素的強度又用于計算背景像素的強度的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。隨后使用新的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差來估計新的背景截止。如果新的背景截止顯著地不同于原始的背景截止，那么重復(fù)所述過程，直到原始的背景截止與新的背景截止一致。

還可使用用于確定背景截止的其他方法。在一些方面中，用戶可選擇界定截止來識別背景像素，且放棄上文所描述的迭代方法。在一些方面中，用戶可選擇將圖像內(nèi)的某些像素識別為背景像素，且從那些像素計算背景和標(biāo)準(zhǔn)偏差。在其他方面中，用戶可計算其中不具有樣本的所取得的圖像(即，暗圖像)中的像素的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。如下文所描述，可使用背景像素的平均值來分析熒光以確定哪些小滴含有目標(biāo)分子。

根據(jù)本公開的一些方面，隨后選擇截止閾值。通常在圖像的最大像素強度處或附近選擇截止閾值。逐步地降低此截止閾值，直到其達(dá)到最小截止閾值(SCT)。在一些方面中，SCT等效于背景閾值(BT)。在其他方面中，SCT可為從背景像素強度的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差計算的不同值。在其他方面中，SCT可為用戶定義的值。一旦確定SCT，用戶就選擇步驟的數(shù)目以及連續(xù)截止閾值之間的間距。將SCT選擇為識別作為小滴的部分的像素。將BT選擇為識別作為背景的部分的像素。在一些方面中，BT可小于SCT，在此情況下，可存在未指派給小滴或背景的一些像素。

根據(jù)本公開的一些方面，隨后可在每個步驟處使用成像分析軟件來找到圖像中高于當(dāng)前步驟的截止閾值的多組連接像素(在下文中被簡稱為“像素組”)。在一些方面中，用戶可要求所述一組像素是4連接或8連接。如果每個像素水平地或垂直地鄰近于正方形陣列中的一組像素中的至少一個其他像素，那么所述一組像素被視為“4連接”。如果每個像素水平地、垂直地或?qū)堑剜徑谡叫侮嚵兄械囊唤M像素中的至少一個其他像素，那么所述一組像素被視為“8連接”。在一些方面中，可使用不同形式的連接性來界定圖像中的多組連接像素。在一些方面中，可使用用戶定義的結(jié)構(gòu)化元素以在形態(tài)上接近由截止確定的多組連接像素。如果此類像素組的區(qū)域超過用戶定義的準(zhǔn)則(即，“最小所需區(qū)域”或“MRA”)，那么將其標(biāo)記為所關(guān)注區(qū)(ROI)。通過在給定像素組被接受為ROI之前使用MRA，有可能排斥背景像素中的噪聲。噪聲可造成背景中的隔離像素具有大于所需SCT的強度?？墒褂糜脩舳x的MRA來排除此類隔離像素。將MRA選擇成使得具有大于MRA的區(qū)域的一組給定連接背景像素可全部具有大于SCT的強度的概率足夠小(用戶滿意)，使得所找到的對象事實上是小滴且在背景中沒有噪聲?？苫谛〉螀^(qū)域內(nèi)的噪聲的量以及用戶希望能夠識別的圖像中的最小的小滴的區(qū)域而選擇MRA的大小。

一旦ROI出現(xiàn)在圖像的特定位置中，就可隨著減小截止閾值而跟蹤ROI的區(qū)域。還可跟蹤每個ROI內(nèi)的最大強度像素的位置以及ROI內(nèi)的像素的值。使用SCT識別的像素組被稱作“群組”。如果群組含有多于一個小滴，那么群組內(nèi)的像素的區(qū)可實際上表示小滴之間的空間。如果在單個群組中含有三個或多于三個小滴，那么有可能在小滴之間可存在間隙，其將顯現(xiàn)為群組的內(nèi)部中的孔。在一些方面中，應(yīng)用用于識別孔的孔閾值(HT)來找到由單個群組內(nèi)的連接像素組成的可能的孔。指定孔的用戶指定的最小的大小來區(qū)別孔與圖像中的噪聲。將僅把其區(qū)域等于或超過孔的最小的大小的多組連接像素標(biāo)記為孔。在一些方面中，HT將等于SCT。在其他方面中，用戶可選擇不等于SCT的HT。

群組的外部邊界是由群組內(nèi)的像素組成，所述像素鄰近于在群組外部的具有低于SCT的強度的像素和/或在群組內(nèi)部中且鄰近于孔中的像素的像素。這些像素被稱作非群組像素。反向分水線程序隨后識別作為同一小滴的部分的外部邊界像素，且使用現(xiàn)有優(yōu)化方法來確定對那些外部邊界像素的最佳擬合圓。

根據(jù)本公開的一些方面，隨著降低截止閾值，兩個或多于兩個ROI可合并。高于特定截止閾值水平的像素組可包含對于較大截止閾值是單獨的兩個或多于兩個ROI。這之所以可發(fā)生是因為不同的ROI表示不同的小滴，所述小滴靠近在一起以使得它們之間的邊界區(qū)具有大于當(dāng)前截止閾值的像素強度，或樣本中的噪聲的振幅足夠大以使得單個小滴內(nèi)的兩個或多于兩個區(qū)展現(xiàn)局部極大值。這些極大值對于算法可顯現(xiàn)為較大截止閾值處的單獨ROI。

根據(jù)本公開的另外方面，用戶定義的準(zhǔn)則可用于決定其區(qū)域包含在當(dāng)前步驟同一像素組內(nèi)的不同ROI應(yīng)(a)被合并且此后被看作一個ROI，還是(b)不被合并且作為單獨ROI被跟蹤。這些準(zhǔn)則可包含但不限于：(i)不同ROI的最大強度像素之間的距離，和/或(ii)與在像素組中將它們分離的最小強度像素相比較的不同ROI的最大強度像素的值，和/或(iii)在不同ROI的平滑之后的最大強度像素的值。

對于以上準(zhǔn)則(i)，可使用圖像的平滑版本來代替實際圖像。使圖像平滑可減少噪聲在評估兩個ROI的“峰”之間的距離方面的影響。另外，對于以上準(zhǔn)則(i)，還可使用ROI的質(zhì)心或另一中心估計量。此估計量的實例包含：未加權(quán)質(zhì)心，其中每個像素對于確定質(zhì)心貢獻(xiàn)相等權(quán)重；或經(jīng)加權(quán)質(zhì)心，其中每個像素向質(zhì)心貢獻(xiàn)等于其強度的某一函數(shù)的權(quán)重。

對于以上準(zhǔn)則(ii)，如果ROI是單獨小滴的部分，那么將預(yù)期到，它們將被強度上顯著地小于兩個ROI的峰的像素區(qū)分離。如果位于兩個峰之間的像素的強度代替地類似于峰的強度，那么可得出結(jié)論：兩個ROI事實上是同一小滴的部分且應(yīng)被組合。用戶定義的準(zhǔn)則可基于取決于圖像的任何性質(zhì)的函數(shù)，所述性質(zhì)可包含：(a)ROI的最大峰強度，(b)在平滑之后的ROI的最大峰強度，(c)平均背景強度，(d)背景強度的標(biāo)準(zhǔn)偏差，(e)用于確定當(dāng)前像素組的截止水平，或(f)任何任意的用戶指定的值。

對于以上準(zhǔn)則(iii)，在一些方面中，圖像中的噪聲可引起單個像素含有由小得多的強度的像素環(huán)繞的ROI的最大強度。這在一些情況下可通過平滑而揭露，這是因為在平滑之后的ROI的最大像素強度將顯著地較低。如果此類平滑將兩個ROI的最大強度減小到低于用戶定義的水平，那么兩個ROI將被確定為同一小滴的部分且被組合。用戶定義的水平可為取決于圖像的任何性質(zhì)的函數(shù)，所述性質(zhì)可包含：(a)ROI的最大峰強度，(b)在平滑之后的ROI的最大峰強度，(c)平均背景強度，(d)背景強度的標(biāo)準(zhǔn)偏差，(e)用于確定當(dāng)前像素組的截止水平，或(f)任何任意的用戶指定的值。

根據(jù)本公開的某些方面，如果其區(qū)域包含在當(dāng)前步驟的同一像素組內(nèi)的不同ROI未被合并，那么必須通過少許方法中的一者來指派先前未指派給ROI的那個像素組的像素，所述方法例如是以下兩種可能的方法。第一，按強度對像素組內(nèi)的未指派像素的列表進(jìn)行分類，且將緊接地鄰近于ROI中的一者且僅一者的具有最大強度的像素指派給那個ROI。重復(fù)此過程，直到剩余的僅未指派像素是緊接地鄰近于兩個或多于兩個不同ROI的像素，在此情況下，那些像素保持未指派。第二，未指派像素可保持未指派，直到在最后步驟之后(即，已使用SCT且像素組隨后被稱作群組)。在那種情況下，隨后將上文在此段落中所描述的第一方法應(yīng)用于群組的未指派像素。

根據(jù)本公開的某些方面，可將到此時的程序的結(jié)果應(yīng)用于小滴圖像。根據(jù)此方面，可將小滴圖像劃分為被其強度低于SCT的像素分離的群組。所述群組中的一些僅含有單個ROI，且一些含有兩個或多于兩個ROI。邊界像素是屬于鄰近于非群組像素的群組的那些像素。

根據(jù)本公開的某些方面，如果群組僅由單個ROI組成，那么將其視為單個小滴，且使其邊界像素擬合到圓以獲得小滴直徑。

根據(jù)本公開的另外方面，如果群組是由兩個或多于兩個ROI組成，那么分析來自那個群組的多組ROI(即，包括一或多個ROI的組)。將作為被分析的組的部分的邊界像素擬合到圓。隨后將用戶定義的準(zhǔn)則應(yīng)用于最佳擬合圓來確定所述組的ROI是否應(yīng)被組合且被視為單個小滴的部分。可迭代地應(yīng)用此程序，一次一個ROI地將一小滴拼接在一起?？捎糜跊Q定要檢查ROI的哪些組合的可能準(zhǔn)則包含但不限于：(i)檢查彼此鄰近的多對ROI(它們在群組內(nèi)的內(nèi)部邊界彼此接近)；(ii)檢查其最佳擬合圓具有彼此靠近的中心的多對ROI；以及(iii)檢查其區(qū)域大體上位于另一ROI或另一組ROI的最佳擬合圓內(nèi)部的ROI?？捎糜诖_定兩個或多于兩個ROI是否應(yīng)被組合且分類為單個小滴的可能準(zhǔn)則包含但不限于：(i)擬合的質(zhì)量(由給定擬合的優(yōu)度的均方誤差或某一其他統(tǒng)計量度界定)；(ii)來自所述組的ROI的多少區(qū)域處于最佳擬合圓內(nèi)；(iii)最佳擬合圓內(nèi)多少區(qū)域是由圖像背景中的像素組成；以及(iv)包含在擬合中的背景像素的圓度。

在另一方面中，以上協(xié)議可包含額外修改。對此程序的可能修改可包含檢查群組的邊界像素，且不在任何擬合中包含顯現(xiàn)為噪聲的那些像素?？墒褂玫臏?zhǔn)則的實例為不鄰近于群組的內(nèi)部像素的任何邊界像素將不包含在邊界到圓的任何擬合中。在此實例中，內(nèi)部像素可為作為群組的成員但不是邊界像素(即，不鄰近于非群組像素)的像素。

對上述反向分水線方法的另一可能修改可為：BT和SCT可不同?？墒褂眯∮谧钚〗刂归撝档谋尘伴撝狄詮谋尘跋袼亟M消除含有太模糊而無法特性化的對象的那些區(qū)域。這些區(qū)域可含有來自高于或低于被分析的樣本的焦平面的小滴的不同焦平面的信號。此情形的典型實例在使用熒光顯微術(shù)來使樣本成像時出現(xiàn)。由于顯微鏡在z方向上的分辨率的限制，來自一個焦平面的熒光可滲透到其他焦平面的圖像中。

根據(jù)本公開，對上述反向分水線方法的其他修改是可能的。對此程序的可能修改可包含檢查群組的邊界像素，且不在任何擬合中包含顯現(xiàn)為噪聲的那些像素。可使用的準(zhǔn)則的實例例如采用以下假定：不鄰近于群組的內(nèi)部像素的任何邊界像素將不包含在邊界到圓的任何擬合中。根據(jù)此假設(shè)，內(nèi)部像素可為作為群組的成員但不是邊界像素(即，不鄰近于非群組像素)的像素。

在某些方面中，反向分水線方法可被修改成使得準(zhǔn)許BT和SCT不同?？墒褂眯∮赟CT的BT以從背景像素組消除含有太模糊而無法特性化的對象的那些區(qū)域。這些區(qū)域可含有來自高于或低于被分析的樣本的焦平面的小滴的不同焦平面的信號。此情形的典型實例在使用熒光顯微術(shù)來使樣本成像時出現(xiàn)。由于顯微鏡在z方向上的分辨率的限制，來自一個焦平面的熒光可滲透到其他焦平面的圖像中。

圓檢測方法。在本公開的一個方面中，可使用圓檢測方法來分析多分散小滴系統(tǒng)中的小滴。根據(jù)此方法，將閾值(如針對以上反向分水線方法所確定)應(yīng)用于圖像。如反向分水線方法中所描述，可使用SCT來識別群組，然而，不識別ROI。還可應(yīng)用孔閾值來識別單個群組內(nèi)的孔，如反向分水線方法中所描述。在識別孔閾值之后，可確定每個群組的外部邊界，如反向分水線方法中所描述。在一些方面中，隨后可通過圓Hough變換來分析所形成的群組的邊界。圓Hough變換是用于檢測存在分析描述的形狀(在此情況下是圓)的原始Hough變換(即，用于檢測圖像中的線)的一般化。根據(jù)本公開的某些方面，圓檢測方法分析外部邊界像素(也被稱為“特征像素”)的坐標(biāo)以找到形成圓的全部或部分的邊界像素組。邊界像素的識別會引起分析大量潛在圓，且僅保留很可能是小滴的圓。

根據(jù)此方法，可將通過圓檢測方法識別的圓疊加在圖像上，例如以下實例5中所描述?？蓙G棄未滿足圓檢測方法中所陳述的準(zhǔn)則的區(qū)。舉例來說，由一個群組的一些或整個外部邊界形成的圓可不包含來自不同的單獨群組的像素。隨后可根據(jù)此方法而應(yīng)用的可能準(zhǔn)則可包含但不限于：(i)選擇重疊或鄰近于群組的邊界像素的最大可能百分比的潛在圓；(ii)選擇重疊或鄰近于邊界像素的其圓周像素的分?jǐn)?shù)盡可能地接近1的潛在圓；(iii)拒絕具有完全在群組內(nèi)的顯著量的其圓周的潛在圓；(iv)拒絕其區(qū)域包含大量非群組像素的潛在圓；(v)拒絕其區(qū)域包含不同群組中的像素的潛在圓；(vi)對于特定群組，拒絕其區(qū)域包含那個群組的孔中的大量像素的潛在圓；和/或(vii)在給定特征像素的最佳擬合圓被判斷為具有低質(zhì)量(即，其中質(zhì)量程度是統(tǒng)計上計算的給定擬合的優(yōu)度的用戶定義的量度，且低質(zhì)量擬合是擬合未通過用戶定義的準(zhǔn)則的擬合)的情況下拒絕潛在圓。

在某些方面中，此時可存在重疊的圓?？蓹z查此類對來確定是否應(yīng)拒絕任一者。隨后可應(yīng)用于此類對的準(zhǔn)則可包含但不限于：(i)如果圓中的一者中的唯一區(qū)域(即，一個圓中的不在其他圓中的區(qū)域)的量小于總區(qū)域的用戶定義的分?jǐn)?shù)，那么移除所述圓中的一者；以及(ii)如果唯一特征像素(即，一個圓的不是其他圓的特征像素的特征像素)的數(shù)目小于特征像素的總數(shù)的用戶定義的分?jǐn)?shù)，那么移除所述圓中的一者。如果將移除一對中的一個圓，那么用于確定將移除哪個圓的可能準(zhǔn)則可包含但不限于：(i)移除具有較小數(shù)目個特征像素的圓；(ii)移除具有最小區(qū)域的圓；或(iii)移除含有較大數(shù)目個不是群組的部分的像素(即，在背景中的最大數(shù)目)或具有不被包含為群組的部分的其區(qū)域的較大分?jǐn)?shù)的圓。

在應(yīng)用以上準(zhǔn)則之后，可仍存在彼此顯著地重疊的圓。決定是否將此類圓接受為小滴將取決于乳劑的性質(zhì)。在一些乳劑系統(tǒng)中，可常見的是找到以使接觸表面平坦的方式被一起推動的小滴，這可具有使小滴失真的效應(yīng)(即，造成它們不是呈嚴(yán)格球形的形狀)。在此例子中，用戶可決定包含還是排除那些小滴，這取決于在確定此類小滴的大小方面的準(zhǔn)確性的要求。在一些系統(tǒng)中，小的小滴可與大得多的小滴重疊。在那種情況下，描述較小的小滴的圓可具有在大得多的圓內(nèi)的其區(qū)域的巨大分?jǐn)?shù)。如果足夠的小的小滴的邊界是其群組的外部邊界的部分，那么用戶可選擇接受小的小滴，且將其包含在分析中。在一些方面中，圓可具有在群組的內(nèi)部中的其圓周的巨大分?jǐn)?shù)。在某些方面中，可使用用戶定義的準(zhǔn)則來排除具有多于群組內(nèi)部中的其邊界的指定分?jǐn)?shù)圓的小滴，理由是所述圓由于圖像中的使群組的外部邊界失真的噪聲而為假影。在一些方面中，類似大小的兩個可能小滴具有顯著量的重疊。這可歸因于由于小滴如上述被一起推動而引起的失真?；蛘?，這可歸因于在假設(shè)圖像中的橢圓形形狀的情況下引起球形小滴的光學(xué)失真?？墒褂糜脩魷?zhǔn)則來標(biāo)記此類圓且將它們排除在進(jìn)一步分析之外。

在一些方面中，用戶可將擬合質(zhì)量測試應(yīng)用于小滴且拒絕不認(rèn)為被準(zhǔn)確地定大小的小滴?？舍槍A到小滴的特征像素的最佳擬合來計算擬合優(yōu)度統(tǒng)計，且可在小滴未能滿足用戶定義的標(biāo)準(zhǔn)的情況下拒絕所述小滴。在其他方面中，可檢查小滴內(nèi)的強度，且可在從某種意義上整個小滴強度太低的情況下拒絕所述小滴。這可發(fā)生的一種方式是歸因于顯微鏡在z方向上的有限分辨率。在z方向上的一個位置處的來自小滴的熒光可顯示針對z方向上的不同位置而取得的樣本的圖像中的極大減小的強度。總強度的測試可用于識別和拒絕此類模糊對象。

在另一方面中，以上協(xié)議可包含額外修改。對此程序的可能修改可包含檢查群組的邊界像素，且不在任何擬合中包含顯現(xiàn)為噪聲的那些像素?？墒褂玫臏?zhǔn)則的實例為不鄰近于群組的內(nèi)部像素的任何邊界像素將不包含在邊界到圓的任何擬合中。在此實例中，內(nèi)部像素可為作為群組的成員但不是邊界像素(即，不鄰近于非群組像素)的像素。

對上述圓檢測方法的另一可能修改可為：BT和SCT可不同?？墒褂眯∮赟CT的BT以從背景像素組消除含有太模糊而無法特性化的對象的那些區(qū)域。這些區(qū)域可含有來自高于或低于被分析的樣本的焦平面的小滴的不同焦平面的信號。此情形的典型實例在使用熒光顯微術(shù)來使樣本成像時出現(xiàn)。由于顯微鏡在z方向上的分辨率的限制，來自一個焦平面的熒光可滲透到其他焦平面的圖像中。

根據(jù)本公開，對上述圓檢測方法的其他修改是可能的。對此程序的可能修改可包含檢查群組的邊界像素，且不在任何擬合中包含顯現(xiàn)為噪聲的那些像素?？墒褂玫臏?zhǔn)則的實例例如采用以下假定：不鄰近于群組的內(nèi)部像素的任何邊界像素將不包含在邊界到圓的任何擬合中。根據(jù)此假設(shè)，內(nèi)部像素可為作為群組的成員但不是邊界像素(即，不鄰近于非群組像素)的像素。

對圓檢測方法的另一可能修改是：準(zhǔn)許BT和SCT不同?？墒褂眯∮赟CT的BT以從背景像素組消除含有太模糊而無法特性化的對象的那些區(qū)域。這些區(qū)域可含有來自高于或低于被分析的樣本的焦平面的小滴的不同焦平面的信號。此情形的典型實例在使用熒光顯微術(shù)來使樣本成像時出現(xiàn)。由于顯微鏡在z方向上的分辨率的限制，來自一個焦平面的熒光可滲透到其他焦平面的圖像中。

在對圓進(jìn)行分類之后，使用最佳地界定小滴的圓來找出應(yīng)使用哪些邊界像素來描述所述小滴。隨后將這些像素擬合到圓來獲得對應(yīng)于小滴的最佳擬合圓的集合。

在其他方面中，可由不同特征提取方法替換圓Hough變換方法，所述不同特征提取方法將用于通過分析圖像中的邊界像素來檢測圓形對象。

組合式反向分水線與圓檢測方法。在本公開的又一方面中，對反向分水線與圓檢測方法的多個方面進(jìn)行組合來得到用于分析多分散小滴系統(tǒng)中的小滴的組合式反向分水線與圓檢測方法。根據(jù)此方法，使用在反向分水線方法中所描述的程序來確定ROI和群組的邊界像素(即，針對SCT所找到的像素組)。隨后針對每個ROI，將圓Hough變換應(yīng)用于ROI的外部邊界像素，其也是含有ROI的群組的外部邊界像素。根據(jù)用戶確定的準(zhǔn)則對用于特定ROI的圓進(jìn)行分類，以找到描述那個ROI的邊界的最小數(shù)目個圓。在大多數(shù)情況下，每個ROI將存在一個圓?？墒褂玫目赡軠?zhǔn)則包含但不限于：(i)選擇包含ROI的外部邊界像素的最大分?jǐn)?shù)的圓；(ii)選擇包含ROI的區(qū)域的最大分?jǐn)?shù)的圓；(iii)拒絕包含來自不同群組的像素的圓；(iv)拒絕包含大量非群組像素的圓；(v)排斥在群組的內(nèi)部中具有它們的圓周的巨大分?jǐn)?shù)的圓。

根據(jù)本公開的某些方面，可成對地檢查用于ROI的初始組圓，其中兩個圓中的一者被拒絕以便支持另一個圓。此處可使用的可能準(zhǔn)則包含但不限于：(i)如果相同或類似大小的兩個圓的中心彼此緊密地接近，那么拒絕具有較小數(shù)目個投票的圓；或(ii)如果兩個圓共同地具有多于它們投票的用戶定義的分?jǐn)?shù)，那么拒絕具有較小數(shù)目個投票的圓。舉例來說，如果可能的Hough變換圓包含來自特定ROI的外部邊界像素，那么將拒絕所述圓，除非其包含那個ROI的區(qū)域的至少某一用戶定義的分?jǐn)?shù)。在此情況下，最小所需分?jǐn)?shù)可取決于ROI有多少邊界像素與Hough變換圓相關(guān)聯(lián)。

而且，在存在彼此緊密地接近的多個小滴的情況下，靠近兩個或多于兩個小滴但實際上不是所述小滴中的任一者的部分的像素的強度可具有相對于背景的高強度，且可被包含為群組的部分，且形成外部群組邊界的部分。在反向分水線方法中，這可導(dǎo)致困難，這是因為包含在群組中的額外像素將造成外部邊界的部分為非圓形。包含實際上不是小滴的部分的外部邊界像素可引起作為小滴的較不準(zhǔn)確的描述的最佳擬合圓。可通過使用圓Hough變換來減輕在具有高像素強度的兩個小滴之間的區(qū)導(dǎo)致非圓形邊界的問題，這是因為其排斥擬合中將形成非圓形邊界的像素。

與ROI相關(guān)聯(lián)的圓是ROI可為其部分的小滴的大小的估計。此信息可用于將ROI分組為小滴。舉例來說，如果與同一群組中的兩個ROI相關(guān)聯(lián)的圓具有類似的半徑且具有靠近在一起的中心，那么所述兩個ROI將被視為同一小滴的部分。將使用用戶定義的準(zhǔn)則來決定圓的半徑必須有多相似以及圓的中心必須有多靠近來使所述兩個ROI組成為一個小滴。與中心必須有多靠近相關(guān)的準(zhǔn)則可取決于兩個圓的大小。

有可能的是，可將ROI指派給兩個或多于兩個小滴，或考慮指派給兩個或多于兩個小滴。在一些方面中，用于確定應(yīng)將ROI指派給哪一小滴的可能準(zhǔn)則包含但不限于：(i)計算到使用參數(shù)被視為小滴中的每一者的最佳擬合圓的ROI的特征像素的擬合統(tǒng)計的優(yōu)度，且將ROI指派給其圓是到ROI的特征像素的最佳擬合的小滴；或(ii)將ROI指派給在區(qū)域上與其具有最大重疊的小滴。

在一些方面中，在將具有圓的所有ROI指派給小滴之后，檢查不是任何圓的部分的任何剩余外部邊界像素，以查看它們是否處于現(xiàn)有圓的邊界的用戶定義的距離內(nèi)。如果是，那么那些外部邊界像素包含在小滴的邊界中。如果ROI的外部邊界因噪聲而失真以使得圓Hough變換找不到用于那個ROI的可接受圓，那么可出現(xiàn)仍處于小滴的邊界上的未指派的外部邊界像素。隨后使每個小滴的外部邊界像素擬合到圓以獲得大小和位置?？山邮芑騺G棄顯著地重疊的小滴，這取決于所允許的此類重疊的量的用戶定義的準(zhǔn)則，且其可取決于乳劑的性質(zhì)。取決于用戶定義的準(zhǔn)則，可接受或丟棄顯現(xiàn)為在群組的內(nèi)部中具有其邊界的巨大分?jǐn)?shù)的小滴。另外，如果用戶愿意接受略微失真的小滴，那么可使用Hough變換來檢測圖像中的橢圓，且可將滿足用戶設(shè)置的準(zhǔn)則(例如，具有小于用戶選擇的極限的縱橫比)的那些橢圓接受為小滴。

此方法可包含額外修改。對此程序的可能修改可包含檢查群組的邊界像素，且不在任何擬合中包含顯現(xiàn)為噪聲的那些像素?？墒褂玫臏?zhǔn)則的實例為不鄰近于群組的內(nèi)部像素的任何邊界像素將不包含在邊界到圓的任何擬合中。在此實例中，內(nèi)部像素可為作為群組的成員但不是邊界像素(即，不鄰近于非群組像素)的像素。

對上述組合式反向分水線與圓檢測方法的另一可能修改可為：BT和SCT可不同。可使用小于SCT的BT以從背景像素組消除含有太模糊而無法識別的對象的那些區(qū)域。這些區(qū)域可含有來自高于或低于被分析的樣本的焦平面的小滴的不同焦平面的信號。此情形的典型實例在使用熒光顯微術(shù)來使樣本成像時出現(xiàn)。由于顯微鏡在z方向上的分辨率的限制，來自一個焦平面的熒光可滲透到其他焦平面的圖像中。

根據(jù)本公開，對上述組合式反向分水線與圓檢測方法的其他修改是可能的。對此程序的可能修改可包含檢查群組的邊界像素，且不在任何擬合中包含顯現(xiàn)為噪聲的那些像素?？墒褂玫臏?zhǔn)則的實例例如采用以下假定：不鄰近于群組的內(nèi)部像素的任何邊界像素將不包含在邊界到圓的任何擬合中。根據(jù)此假設(shè)，內(nèi)部像素可為作為群組的成員但不是邊界像素(即，不鄰近于非群組像素)的像素。

另一可能修改是：準(zhǔn)許BT和SCT不同?？墒褂眯∮赟CT的BT以從背景像素組消除含有太模糊而無法特性化的對象的那些區(qū)域。這些區(qū)域可含有來自高于或低于被分析的樣本的焦平面的小滴的不同焦平面的信號。此情形的典型實例在使用熒光顯微術(shù)來使樣本成像時出現(xiàn)。由于顯微鏡在z方向上的分辨率的限制，來自一個焦平面的熒光可滲透到其他焦平面的圖像中。

在另一方面中，可由識別圓的不同特征提取方法替換圓Hough變換。在那種情況下，通過替代特征提取方法產(chǎn)生的信息將用于識別小滴。

在又一方面中，此方法可用于搜索圖像中的非圓形對象?？捎勺R別所需形狀的對象的特征提取方法替換圓Hough變換。

占據(jù)率的確定。在一些方面中，在已識別小滴且確定它們的大小之后，使用熒光強度來確定所述小滴是否含有目標(biāo)分子。

在一些方面中，目標(biāo)分子的存在將引起來自小滴的熒光的增加。在那些情況下，可強加強度截止標(biāo)準(zhǔn)，其中其強度超過截止的小滴被視為被占據(jù)，且剩余者將被視為空白。在目標(biāo)分子的存在會引起熒光的減小的系統(tǒng)中，其強度超過截止的小滴被視為空白，且其他者將被視為被占據(jù)。在以上兩種情況下，與小滴截止比較較的強度可為：(i)小滴內(nèi)的平均強度；(ii)小滴內(nèi)的峰強度；或(iii)小滴內(nèi)的像素的強度的任何用戶選擇的函數(shù)(例如，可使用中值強度或強度的百分位)。

在一些方面中，用于確定占據(jù)率的方法將使用每個小滴的兩個熒光圖像。在所述圖像中的一者中，熒光的強度將適度地取決于小滴是否被占據(jù)。在另一圖像中，熒光的強度將由于目標(biāo)分子的存在而不改變或改變很小。來自兩個圖像的小滴的強度的函數(shù)(例如，比率)可用于決定小滴的占據(jù)率。使用比率或某一其他函數(shù)來代替來自單個圖像的強度可校正可能的儀器假影。此外，對于較大的小滴，來自高于所成像的平面的樣本中的焦平面的熒光可出現(xiàn)在圖像中，從而造成那個小滴內(nèi)的像素的所測量的強度增加。使用來自兩個不同圖像的小滴的強度將會允許用戶避免這些問題。所分析的小滴的強度可為：(i)小滴內(nèi)的平均強度；(ii)小滴內(nèi)的峰強度；或(iii)小滴內(nèi)的像素的強度的任何用戶選擇的函數(shù)(例如，可使用中值強度或強度的百分位)。在用戶的自由裁量權(quán)下，強度可為被減去背景的強度。在一些方面中，從圖像中的每個像素的強度減去用于識別群組的平均背景。

在一些方面中，在此階段確定一組經(jīng)校正背景像素。一種用于確定經(jīng)校正組的方法是以在群組(其可包含在群組內(nèi)部的孔中的像素)內(nèi)部的一組像素開始。在用戶的自由裁量權(quán)下，這些組像素可由一或多個像素擴大(即，放大)。未包含在這些組像素中的像素將形成所述一組經(jīng)校正邊界像素。

示范性分析系統(tǒng)和方法。如本文中所論述，本公開包含被配置成分析體積以及樣本在乳劑系統(tǒng)中的多個小滴中的存在或不存在的檢測系統(tǒng)。圖2A示意性地說明示范性檢測系統(tǒng)1000。所述檢測系統(tǒng)可包括：計算裝置1001，其被配置成由用戶US操作；成像源1040，其被配置成由計算裝置1001操作；以及多井板1050，其被配置成由成像平臺或源1040成像且其可含有待成像和分析的小滴系統(tǒng)或乳劑系統(tǒng)1055。

計算裝置1001可經(jīng)編程以實施本文中所描述的方法中的一或多者。舉例來說，計算裝置1001可包括個人計算機、工作站，或服務(wù)器。計算裝置1001包含處理器、計算機處理器、中央處理單元，或CPU 1005，其可為單核或多核處理器，或用于并行處理的多個處理器。

計算裝置1001還可包含存儲器1010(例如，隨機存取存儲器、只讀存儲器、閃速存儲器、硬盤，或類似者)。存儲器1010可存儲文件，例如由成像源1040取得的計算機可讀圖像文件。計算裝置1001在一些情況下可包含一或多個額外數(shù)據(jù)存儲單元，其在計算裝置1001外部，例如定位在通過一或多個網(wǎng)絡(luò)而與計算裝置1001通信的遠(yuǎn)程服務(wù)器上。

計算裝置1001可進(jìn)一步包括輸入/輸出或I/O系統(tǒng)1015，其可由計算裝置1001使用以與以下各者中的一或多者通信：用戶US、一或多個其他計算裝置或系統(tǒng)、一或多個網(wǎng)絡(luò)(例如，局域網(wǎng)(LAN)、外聯(lián)網(wǎng)、內(nèi)聯(lián)網(wǎng)、因特網(wǎng)、電信網(wǎng)絡(luò)、數(shù)據(jù)網(wǎng)絡(luò)、蜂窩式數(shù)據(jù)網(wǎng)絡(luò)，或類似者)，或一或多個外圍裝置，包含成像源1040、外部存儲器、各種適配器等等。I/O系統(tǒng)1015可包括顯示器1020、用戶接口1025，以及通信接口1030。舉例來說，顯示器1020可包括觸摸屏顯示器，通過所述觸摸屏顯示器將用戶接口1025投影到用戶US。通信接口1030可包括網(wǎng)絡(luò)適配器以用于將計算裝置1001連接到一或多個網(wǎng)絡(luò)。用戶US例如可通過一或多個網(wǎng)絡(luò)遠(yuǎn)程地操作計算裝置1001。舉例來說，計算裝置1001可包括基于云的計算系統(tǒng)，例如操作可在用戶US本地的成像源1040的分布式計算系統(tǒng)。計算裝置1001可通過一或多個網(wǎng)絡(luò)或通過直接通信而與成像源1040通信。

本文中所描述的方法可由機器(或計算機處理器)可執(zhí)行代碼(或軟件)實施，所述機器可執(zhí)行代碼存儲在計算裝置1001的電子存儲位置上，例如存儲在存儲器1010或其他電子存儲單元上。在使用期間，所述代碼可由處理器1005執(zhí)行。在一些情況下，所述代碼可從存儲單元進(jìn)行檢索且存儲在存儲器1010上以準(zhǔn)備好由處理器1005存取。在一些情形中，可排除電子存儲單元，且機器可執(zhí)行指令存儲在存儲器1010中。替代地，可在遠(yuǎn)程計算機系統(tǒng)上執(zhí)行所述代碼。所執(zhí)行的代碼可操作成像源1040以根據(jù)本文中所描述的方法中的任一者而對多井板1050進(jìn)行成像和分析。所述代碼可由計算裝置1001自動地執(zhí)行，或可根據(jù)由例如用戶US等操作者提供的指令而執(zhí)行。

所述代碼可被預(yù)編譯和配置成用于與具有適應(yīng)于執(zhí)行所述代碼的處理器的機器一起使用，或可在運行時間期間被編譯?？梢跃幊陶Z言供應(yīng)所述代碼，可將所述編程語言選擇成使所述代碼能夠以預(yù)編譯或依編譯的方式而執(zhí)行。

可在編程中體現(xiàn)本文中所提供的系統(tǒng)和方法的各方面，例如計算裝置1001。技術(shù)的各種方面可通常以機器(或處理器)可執(zhí)行代碼和/或關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)的形式被視為“產(chǎn)品”或“制品”，所述機器可執(zhí)行代碼和/或關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)被攜載于一種類型的機器可讀媒體上或體現(xiàn)于其中。機器可執(zhí)行代碼可存儲在電子存儲單元上，電子存儲單元例如為存儲器(例如，只讀存儲器、隨機存取存儲器、閃速存儲器)或硬盤?！按鎯Α鳖愋兔襟w可包含計算機、處理器或類似者的任何或所有有形存儲器，或其關(guān)聯(lián)模塊，例如各種半導(dǎo)體存儲器、磁帶驅(qū)動器、磁盤驅(qū)動器和類似者，其可在任何時間提供非暫時性存儲以用于軟件編程。軟件的全部或部分可有時通過因特網(wǎng)或各種其他電信網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行通信。舉例來說，此類通信可使能夠?qū)④浖囊粋€計算機或處理器加載到另一計算機或處理器中，例如，從管理服務(wù)器或主機計算機加載到應(yīng)用服務(wù)器的計算機平臺中。因此，可承載軟件元件的另一類型的媒體包含例如橫越本地裝置之間的物理接口、通過有線和光學(xué)陸線網(wǎng)絡(luò)且經(jīng)由各種空中鏈路而使用的光學(xué)、電和電磁波。攜載此類波的物理元件(例如，有線或無線鏈路、光學(xué)鏈路或類似者)也可被視為承載軟件的媒體。如本文中所使用，除非限定于非暫時性有形“存儲”媒體，否則例如計算機或機器“可讀媒體”等術(shù)語是指參與將指令提供給處理器以供執(zhí)行的任何媒體。

因此，機器可讀媒體(例如計算機可執(zhí)行代碼)可采取許多形式，包含但不限于有形存儲媒體、載波媒體或物理傳輸媒體。非易失性存儲媒體包含(例如)光盤或磁盤，例如任何計算機或類似者中的例如可用于實施數(shù)據(jù)庫等等的存儲裝置中的任一者(圖式中示出)。易失性存儲媒體包含動態(tài)存儲器，例如此類計算機平臺的主存儲器。有形傳輸媒體包含：同軸電纜；銅線和光纖，包含電線，其包括計算機系統(tǒng)內(nèi)的總線。載波傳輸媒體可采取電信號或電磁信號或聲波或光波(例如，在射頻(RF)和紅外(IR)數(shù)據(jù)通信期間所產(chǎn)生的聲波或光波)的形式。常見形式的計算機可讀媒體因此包含(例如)：軟盤、柔性磁盤、硬盤、磁帶、任何其他磁性媒體、CD-ROM、DVD或DVD-ROM、任何其他光學(xué)媒體，穿孔卡紙帶、具有孔圖案的任何其他物理存儲媒體、RAM、ROM、PROM和EPROM、FLASH-EPROM、任何其他存儲器芯片或盒式磁帶、輸送數(shù)據(jù)或指令的載波，輸送此類載波的電纜或鏈路，或可供計算機讀取編程代碼和/或數(shù)據(jù)的任何其他媒體。在將一或多個指令的一或多個序列攜載到處理器以供執(zhí)行的過程中可涉及這些形式的計算機可讀媒體中的許多者。

可在用戶US或其他操作者的電子裝置的用戶接口或UI 1025或其他用戶接口(其可包含圖形用戶接口(GUI))上向用戶顯示本公開的方法的結(jié)果。可在用戶的電子裝置(例如，平板計算機、智能電話、可穿戴計算機，或類似者)的顯示器上提供例如GUI等其他UI。舉例來說，所述顯示器可為電容性或電阻性觸摸顯示器。此類顯示器可與本公開的其他系統(tǒng)和方法一起使用。

成像源1040可包括本文中所描述的成像裝置和源中的任一者。舉例來說，成像源1040可包括光學(xué)成像源。成像源1040可被配置成執(zhí)行以下各者中的一或多者：共聚焦顯微術(shù)、線共聚焦顯微術(shù)、反卷積顯微術(shù)、旋轉(zhuǎn)盤顯微術(shù)、多光子顯微術(shù)、平面照明顯微術(shù)、Bessel光束顯微術(shù)、微分干涉差顯微術(shù)、相差顯微術(shù)、落射熒光顯微術(shù)、明場成像、暗場成像、傾斜照明，或其組合。

多井板1050可包括本領(lǐng)域中所知的任何多井板?？赏ㄟ^本文中所描述的方法中的任一者產(chǎn)生小滴系統(tǒng)或乳劑系統(tǒng)1055。

示范性檢測系統(tǒng)1000可由用戶US操作來實施本文中所描述的方法中的任一者。舉例來說，檢測系統(tǒng)1000可由用戶US操作來實施圖2B中示意性地所說明的示范性檢測方法1100或圖2C中示意性地所說明的示范性檢測方法100。圖2B的檢測方法1100可包括如下各種步驟。在步驟1110中，可產(chǎn)生小滴或乳劑系統(tǒng)?？梢匀绫疚闹兴枋龅脑S多方式產(chǎn)生小滴或乳劑系統(tǒng)，例如，通過搖動、渦旋，或其他攪拌。在步驟1120中，可以如本文中所描述的許多方式在多井板上提供小滴或乳劑系統(tǒng)。在步驟1130中，可以如本文中所描述的許多方式產(chǎn)生小滴或乳劑系統(tǒng)的圖像棧。在步驟1140中，可以如本文中所描述的許多方式分析圖像棧以檢測或辨識小滴。舉例來說，可使用以下各者中的一或多者來檢測或辨識小滴：行掃描方法、簡單邊界方法、反向分水線方法、圓檢測方法、組合式反向分水線與圓檢測方法，或其組合。在步驟1150中，可以如本文中所描述的許多方式在各種小滴中檢測樣本的存在(即，可確定占據(jù)率)。在步驟1170中，可以如本文中所描述的許多方式(例如，使用本文中所描述的統(tǒng)計方法)基于樣本在各種小滴中的所檢測的存在以及各種小滴的大小分布而確定樣本的濃度。

圖2C的檢測方法100可包括如下各種步驟。在步驟105中，可獲得樣本。可以本文中所描述的方式中的任一者獲得樣本。在步驟110中，從樣本制備乳劑?？梢员疚闹兴枋龅姆绞街械娜我徽咧苽淙閯?。在步驟115中，可擴增目標(biāo)。可以本文中所描述的方式中的任一者擴增目標(biāo)。在步驟120中，將乳劑放置在井或腔室中。在一些實施例中，步驟110和120可同時地進(jìn)行，且可在井或腔室中制備乳劑。在步驟125中，可在第一水平位置和第一垂直位置處使乳劑成像。在步驟130中，可在相同的第一水平位置和不同于第一垂直位置的第二垂直位置處使乳劑成像。在步驟135中，可針對2+n個垂直位置重復(fù)成像步驟。在步驟140中，可例如通過執(zhí)行先前步驟125、130和135而獲取多個圖像。在步驟145中，針對小滴大小來分析所獲取的圖像?？梢员疚闹兴枋龅姆绞街械娜我徽叻治鏊@取的圖像。舉例來說，可通過以下各者中的一或多者分析所獲取的圖像：在步驟145a中使用行掃描方法；在步驟145b中使用簡單邊界方法；在步驟145c中使用反向分水線方法；在步驟145d中使用圓檢測方法；在步驟145e中使用組合式反向分水線與圓檢測方法；或使用前述各者中的兩者或多于兩者的組合。小滴可出現(xiàn)在Z棧的多于一個圖像中。在此情況下，可通過上文所描述的方法對那些圖像中的信息進(jìn)行組合來確定那個小滴的直徑。在步驟150中，可針對目標(biāo)在小滴中的存在來分析所獲取的圖像?？梢员疚闹兴枋龅姆绞街械娜我徽邎?zhí)行針對目標(biāo)的存在的分析。步驟150可例如包括檢測和分析熒光的步驟150a。步驟150可在步驟145中針對小滴大小來分析圖像之后進(jìn)行，或可作為步驟145的并行步驟而進(jìn)行。步驟150可包含檢測和分析熒光的步驟150a。在步驟155中，可計算樣本中的目標(biāo)濃度?？梢员疚闹兴枋龅姆绞街械娜我徽哂嬎銟颖局械哪繕?biāo)濃度。舉例來說，所述計算可基于來自步驟145的針對小滴大小的圖像分析以及來自步驟150的針對小滴中的目標(biāo)存在的圖像分析。

盡管以上步驟示出根據(jù)許多方面和實施例的用于目標(biāo)檢測的方法1100和100，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將辨識基于本文中所描述的教示的許多變化。可以不同次序完成所述步驟?？商砑踊騽h除多個步驟。所述步驟中的一些步驟可包括子步驟。每當(dāng)有益時就可重復(fù)所述步驟中的許多步驟。

可使用如此處所描述的處理元件或電路(例如本文中所描述的系統(tǒng)1000的計算裝置1001的處理器或CPU 1005中的一或多者)執(zhí)行方法1100和100的步驟或子步驟中的一或多者。用于CPU 1005的指令可存儲在系統(tǒng)1000的存儲器1010上。這些指令在由CPU 1005執(zhí)行時可執(zhí)行方法1100和100的步驟或子步驟中的一或多者。

在各種方面中，本公開提供用于檢測或辨識小滴的許多方法，例如本文中所描述的行掃描方法、簡單邊界方法、反向分水線方法、圓檢測方法、組合式反向分水線與圓檢測方法，或其組合。在一些方面中，檢測或辨識小滴的方法可獨立于用于確定樣本濃度的方法。也就是說，檢測或辨識小滴的方法可用于除了執(zhí)行本文中所描述的數(shù)字檢定之外的許多目的。

圖2D、圖2E、圖2F、圖2G和圖2H分別示意性地說明示范性小滴辨識方法1200、1300、1400、1500和1600。舉例來說，步驟1140可應(yīng)用方法1200、1300、1400、1500和1600中的一或多者來分析圖像棧以檢測或辨識小滴。

如圖2D所示，小滴辨識方法1200可類似于或包括上文所描述的行掃描方法，且可包括如下各種步驟。在步驟1210中，可設(shè)置用于個別圖像的適當(dāng)閾值水平。舉例來說，適當(dāng)閾值水平可為像素強度閾值。在步驟1220中，可在圖像內(nèi)獲得行掃描。在步驟1230中，可針對像素組分析行掃描。這些像素組可包括(例如)在所設(shè)置的閾值水平處或之外(例如，高于或低于所設(shè)置的閾值水平)且在鄰近行掃描之間鄰接的行掃描的片段。在步驟1240中，可從像素組識別小滴。舉例來說，可將像素組的行掃描的最長片段視為小滴的直徑，且可從所述直徑計算小滴的大小。雖然本文中大體上論述行掃描，但還預(yù)期產(chǎn)生掃描的其他方法。這些方法可包含共聚焦掃描、行照明和收集、Nipkow盤型掃描，或類似者。

如圖2E所示，小滴辨識方法1300可類似于或可包括上文所描述的簡單邊界方法，且可包括如下各種步驟。在步驟1310中，針對個別圖像設(shè)置適當(dāng)閾值水平。在步驟1320中，可將在閾值水平處或之外(例如，高于或低于閾值水平)的區(qū)域識別為像素組。在步驟1330中，可測量像素組的縱橫比。在步驟1340中，將縱橫比在閾值縱橫比之外(例如，通常低于但替代地可高于閾值縱橫比)的像素組識別為單個小滴。閾值縱橫比可例如為1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2.0。在步驟1350中，可編譯每個圖像的小滴列表。

如圖2F所示，小滴辨識方法1400可類似于或可包括上文所描述的反向分水線方法，且可包括如下各種步驟。在步驟1405中，可產(chǎn)生基于個別圖像的像素強度的3D拓?fù)涞貓D。在步驟1410中，可使用“水”(即，水或其他流體的計算機化合成表示)將拓?fù)涞貓D填充到高于拓?fù)涞貓D的“峰”?？梢匀缟衔闹兴枋龅脑S多方式使用“水”填充拓?fù)涞貓D。舉例來說，可確定每個圖像的背景內(nèi)的信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差，將其乘以信噪比，且隨后加到背景像素的平均強度。在步驟1415中，可降低“水位”?？梢陨衔闹兴枋龅脑S多方式降低拓?fù)涞貓D的“水位”。舉例來說，可建立和降低最大像素強度截止閾值，直到其達(dá)到背景像素強度閾值。在步驟1420中，可隨著降低“水位”而跟蹤“突出部”或“島”(即，最高強度像素)。在步驟1425中，可在此類“突出部”或“島”滿足用戶定義的準(zhǔn)則(例如，最小所需區(qū)域)的情況下將它們識別為所關(guān)注區(qū)?？梢匀缟衔闹兴枋龅脑S多方式定義用戶定義的準(zhǔn)則。在步驟1430中，可隨著降低“水位”而合并所關(guān)注區(qū)，這取決于是否滿足某些準(zhǔn)則(例如，如上文中所描述)。如上文中所描述，可在確定是否合并兩個或多于兩個所關(guān)注區(qū)之前使圖像平滑。在步驟1435中，當(dāng)滿足閾值時，“水位”的降低可結(jié)束。閾值可包括本文中所描述的背景強度閾值或截止，且可以如上文中所描述的許多方式予以確定。

在步驟1440中，可將連接像素的群組識別為像素群組?？梢匀缟衔闹兴枋龅脑S多方式進(jìn)行此類識別。在步驟1445中，可例如通過應(yīng)用如上文中所描述的孔閾值而將像素群組內(nèi)的間隙識別為孔或噪聲。舉例來說，孔可包括小滴之間的間隙。在步驟1450中，可隨著降低“水位”或在“水位”的降低結(jié)束之后合并所關(guān)注區(qū)，這取決于是否滿足某些準(zhǔn)則(例如，如上文中所描述)。如上文中所描述，可在確定是否合并兩個或多于兩個所關(guān)注區(qū)之前使圖像平滑。

在步驟1455中，可將僅包括單個所關(guān)注區(qū)的像素群組識別為小滴。在步驟1460中，可使圓擬合到單個所關(guān)注區(qū)的邊界?？煞治鰣A以獲得小滴直徑，如上文中所描述。可根據(jù)上文中所描述的方法識別具有多個所關(guān)注區(qū)的像素群組以識別最可能的小滴。在步驟1465中，可使單個像素群組內(nèi)的所關(guān)注區(qū)與圓擬合。在步驟1470中，可將最佳擬合圓識別為小滴。可分析最佳擬合圓以獲得小滴直徑，如上文中所描述。

如圖2G所示，小滴辨識方法1500可類似于或可包括上文所描述的圓檢測方法，且可包括如下各種步驟。在步驟1510中，可將閾值應(yīng)用于個別圖像?？扇缭谏衔闹兴枋龅姆聪蚍炙€方法中一樣確定閾值。在步驟1520中，可將連接像素的群組識別為像素群組?？扇缭谏衔闹兴枋龅姆聪蚍炙€方法中一樣進(jìn)行此類識別。在步驟1530中，可例如通過應(yīng)用如上文中所描述的孔閾值而將像素群組內(nèi)的間隙識別為孔或噪聲。在步驟1540中，可確定像素群組的外部邊界。在步驟1550中，將圓Hough變換應(yīng)用于像素群組的邊界。在步驟1560中，可消除未滿足某些準(zhǔn)則的圓。所述準(zhǔn)則可為上文中所描述的準(zhǔn)則中的任一者。在步驟1570中，可接受剩余圓中的一或多者?？扇缟衔闹兴枋龆鴳?yīng)用準(zhǔn)則來確定是否接受剩余圓。在步驟1580中，使用被接受的剩余圓來找到小滴的最佳邊界像素。在步驟1590中，使邊界像素擬合到圓來獲得對應(yīng)于小滴的最佳擬合圓的集合。可使用這些最佳擬合圓來確定小滴的直徑和大小。

如圖2H所示，小滴辨識方法1600可類似于或可包括上文所描述的組合式反向分水線與圓檢測方法，且可包括如下各種步驟。步驟1605、1610、1615、1620、1625、1630、1635、1640和1645可分別類似于上文所描述的反向分水線方法1400的步驟1405、1410、1415、1420、1425、1430、1435、1440和1445。在步驟1605中，可產(chǎn)生基于個別圖像的像素強度的3D拓?fù)涞貓D。在步驟1610中，使用“水”(即，水或其他流體的計算機化合成表示)將拓?fù)涞貓D填充到高于拓?fù)涞貓D的“峰”。可以如上文中所描述的許多方式使用“水”填充拓?fù)涞貓D。舉例來說，可確定每個圖像的背景內(nèi)的信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差，將其乘以信噪比，且隨后加到背景像素的平均強度。在步驟1615中，可降低“水位”。可以上文中所描述的許多方式降低拓?fù)涞貓D的“水位”。舉例來說，可建立和降低最大像素強度截止閾值，直到其達(dá)到背景像素強度閾值。在步驟1620中，可隨著降低“水位”而跟蹤“突出部”或“島”(即，最高強度像素)。在步驟1625中，可在此類“突出部”或“島”滿足用戶定義的準(zhǔn)則(例如，最小所需區(qū)域)的情況下將它們識別為所關(guān)注區(qū)?？梢匀缟衔闹兴枋龅脑S多方式定義用戶定義的準(zhǔn)則。在步驟1630中，可隨著降低“水位”而合并所關(guān)注區(qū)，這取決于是否滿足某些準(zhǔn)則(例如，如上文中所描述)。如上文中所描述，可在確定是否合并兩個或多于兩個所關(guān)注區(qū)之前使圖像平滑。在步驟1635中，當(dāng)滿足閾值時，“水位”的降低可結(jié)束。閾值可包括如本文中所描述的背景強度閾值或截止，且可以如上文中所描述的許多方式予以確定。在步驟1640中，可將連接像素的群組識別為像素群組?？梢匀缟衔闹兴枋龅脑S多方式進(jìn)行此類識別。在步驟1645中，可例如通過應(yīng)用如上文中所描述的孔閾值而將所關(guān)注區(qū)內(nèi)的間隙識別為孔或噪聲。在步驟1650中，將圓Hough變換應(yīng)用于每個所關(guān)注區(qū)的邊界。

步驟1655、1660、1670和1675可分別類似于以上步驟1560、1570、1580和1590。在步驟1655中，可消除未滿足某些準(zhǔn)則的圓。所述準(zhǔn)則可為上文中所描述的準(zhǔn)則中的任一者。在步驟1660中，可接受剩余圓。在步驟1665中，可使用被接受的剩余圓來找到小滴的最佳邊界像素。在步驟1670中，使邊界像素擬合到最佳擬合圓?？墒褂眠@些最佳擬合圓來確定小滴的直徑和大小。

盡管以上步驟示出根據(jù)本公開的各種方面的用于檢測小滴和/或分析小滴或乳劑系統(tǒng)的方法1100、1200、1300、1400、1500和1600，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將辨識基于本文中所描述的教示的許多變化?？梢圆煌涡蛲瓿伤霾襟E。可添加或刪除多個步驟。所述步驟中的一些步驟可包括子步驟。每當(dāng)有益時就可重復(fù)所述步驟中的許多步驟。

可使用如本文中所描述的計算系統(tǒng)1000執(zhí)行方法1100、1200、1300、1400、1500和1600的步驟中的一或多者。替代地或組合地，可使用電路或邏輯電路(例如，用于現(xiàn)場可編程門陣列的可編程陣列邏輯、專用集成電路，或其他可編程或?qū)Ｓ眠壿嬰娐?執(zhí)行方法1100、1200、1300、1400、1500和1600的一或多個步驟。所述電路可經(jīng)編程以提供方法1100、1200、1300、1400、1500和1600的步驟中的一或多者，且程序可包括存儲在非暫時性計算機可讀存儲器或存儲媒體上的程序指令，或邏輯電路的經(jīng)編程步驟。

用于執(zhí)行數(shù)字檢定的組合物和套件

本公開提供用于執(zhí)行如本文中所描述的數(shù)字檢定的組合物和套件。在某些方面中，提供用于執(zhí)行數(shù)字PCR的套件和檢定。

在各種方面中，本公開提供用于執(zhí)行數(shù)字檢定的組合物和套件，其包括：第一流體；第二流體，其中第一流體和第二流體彼此不混溶且能夠在被攪拌時形成乳劑；表面活性劑；以及擴增試劑。

在一些方面中，組合物進(jìn)一步包括樣本。在某些方面中，樣本包括核苷酸。在另外方面中，組合物進(jìn)一步包括可檢測劑，其中可檢測劑能夠標(biāo)記樣本。在一些方面中，使用可檢測劑標(biāo)記樣本。在另外方面中，組合物進(jìn)一步包括能夠結(jié)合核酸樣本的可檢測劑。

在各種方面中，組合物包括擴增試劑，擴增試劑是選自聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑、滾環(huán)擴增(RCA)試劑、基于核酸序列的擴增(NASBA)試劑、環(huán)介導(dǎo)擴增(LAMP)試劑，或其組合。在一些方面中，擴增試劑是PCR試劑。在某些方面中，PCR試劑是選自熱穩(wěn)定DNA聚合酶、核苷酸、引物、探測劑或其組合。

在一些方面中，組合物進(jìn)一步包括第三流體，其中第三流體不混溶于第二流體中。在某些方面中，組合物能夠形成雙面乳劑。

在各種方面中，第一流體是含水的。在另外方面中，第一流體包括擴增試劑。在一些方面中，第二流體是油。在另外方面中，第二流體是油，且第二流體與第一流體和第三流體不混溶。在又另外方面中，第一流體不同于第三流體。在其他方面中，第三流體是油，且第三流體與第一流體和第二流體不混溶。

在一些方面中，組合物進(jìn)一步包括流體界面改性元素。在某些方面中，流體界面改性元素是表面活性劑。在另外方面中，流體界面改性元素是選自脂類、磷脂、糖脂、蛋白質(zhì)、肽、納米粒子、聚合物、沉淀物、微粒、具有疏水部分和親水部分的分子，或其組合。

在某些方面中，組合物進(jìn)一步包括能夠?qū)⒉换烊芰黧w中的一或多者轉(zhuǎn)化成凝膠或固體的固化或膠凝劑。

在一些方面中，本公開提供用于執(zhí)行數(shù)字檢定的組合物和套件，組合物或套件包括：第一流體；第二流體，其中第一流體和第二流體彼此不混溶且能夠在被物理地攪拌時形成乳劑；表面活性劑；以及PCR試劑。在另外方面中，PCR試劑是選自熱穩(wěn)定DNA聚合酶、核苷酸、引物、探測劑或其組合。在其他方面中，可檢測劑能夠結(jié)合核酸樣本。

在某些方面中，本公開提供用于執(zhí)行PCR的組合物和套件，其包括：第一流體和第二流體，其中第一流體和第二流體彼此不混溶；核酸引物；脫氧核苷酸；適合于延伸核酸引物的酶；熒光標(biāo)記；以及可檢測劑，其能夠結(jié)合擴增之后的核酸樣本。

在另外方面中，組合物和套件可進(jìn)一步包括與PCR擴增兼容的合適緩沖劑和穩(wěn)定劑。

在提供值范圍的情況下，應(yīng)理解，在本文中所提供的公開內(nèi)容內(nèi)涵蓋那個范圍的上限與下限之間的直至下限的單位的十分之一的每個中介值(除非上下文另有清楚指示)，以及在所述規(guī)定范圍內(nèi)的任何其他規(guī)定或中介值。這些較小范圍的上限和下限可獨立地包含在較小范圍內(nèi)，且也涵蓋在本公開內(nèi)，受制于規(guī)定范圍內(nèi)的任何特定排除的極限。在規(guī)定范圍包含所述極限中的一者或兩者的情況下，排除那些所包含的極限中的任一者或兩者的范圍也包含在本文中所提供的公開內(nèi)容中。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員鑒于本文中的公開內(nèi)容將顯而易見，本公開的設(shè)備、裝置、系統(tǒng)及其組件中的任一者的特定尺寸可容易地取決于預(yù)期應(yīng)用而變化。另外，應(yīng)理解，本文中所描述的實例和方面是僅出于說明性目的，且可向本領(lǐng)域的技術(shù)人員建議按照所述實例和方面而進(jìn)行的各種修改或改變，且其包含在本申請的精神和視界以及所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。本文中所描述的方面的眾多不同組合是可能的，且此類組合被視為本公開的部分。另外，結(jié)合本文中的任何一個方面所論述的所有特征可容易地適應(yīng)于用于本文中的其他方面中。在不同方面中使用類似特征的不同術(shù)語或參考數(shù)字未必暗示除了明確陳述的差異之外的差異。因此，本公開意欲僅通過參考所附權(quán)利要求書予以描述，且不限于本文中所公開的方面。

除非另有指定，否則可以任何次序執(zhí)行目前描述的方法和過程。舉例來說，描述步驟(a)、(b)和(c)的方法可首先以步驟(a)執(zhí)行，接著以步驟(b)執(zhí)行，且隨后以步驟(c)執(zhí)行?；蛘?，可以不同次序執(zhí)行所述方法，例如首先以步驟(b)執(zhí)行，接著以步驟(c)執(zhí)行，且隨后以步驟(a)執(zhí)行。此外，可同時地或單獨地執(zhí)行那些步驟，除非另有特定指定。

雖然本文中已示出和描述本公開的優(yōu)選方面，但應(yīng)理解，本公開不限于下文所描述的公開內(nèi)容的特定方面，這是因為可作出特定方面的變化且其仍屬于所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。還應(yīng)理解，所采用的術(shù)語是出于描述本公開的特定方面的目的，且不意欲是限制性的。代替地，本公開的范圍是由所附權(quán)利要求書確立。在本說明書和所附權(quán)利要求書中，單數(shù)形式“一”和“所述”包含復(fù)數(shù)參考，除非上下文另有清楚規(guī)定。

本說明書中所提及的所有公布、專利和專利申請是按照以下程度以引用的方式并入本文中：如同每個個別公布、專利或?qū)＠暾埗急惶囟ǖ厍覀€別地指示為以引用的方式并入。

實例

本領(lǐng)域的技術(shù)人員鑒于本文中的公開內(nèi)容將顯而易見，本公開的設(shè)備、裝置、系統(tǒng)及其組件中的任一者的特定尺寸可容易地取決于預(yù)期應(yīng)用而變化。另外，應(yīng)理解，本文中所描述的實例和方面是僅出于說明性目的，且可向本領(lǐng)域的技術(shù)人員建議按照所述實例和方面而進(jìn)行的各種修改或改變，且其包含在本申請的精神和視界以及所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。本文中所描述的方面的眾多不同組合是可能的，且此類組合被視為本公開的部分。另外，結(jié)合本文中的任何一個方面所論述的所有特征可容易地適應(yīng)于用于本文中的其他方面中。在不同方面中使用類似特征的不同術(shù)語或參考數(shù)字未必暗示除了明確陳述的差異之外的差異。因此，本公開意欲僅通過參考所附權(quán)利要求書予以描述，且不限于本文中所公開的方面。

實例1

用于在管中產(chǎn)生可變體積的小滴的方法

此實例提供根據(jù)本公開的一個方面的用于產(chǎn)生可變體積的多分散小滴的示范性方法。在此實例中，使用PCR管，然而，根據(jù)本公開，可使用任何合適的器皿。

圖3描繪通過使個別管渦旋而形成乳劑系統(tǒng)。在步驟4A中，將含有反應(yīng)混合物的水相移液到0.2ml PCR管中，所述PCR管被預(yù)填充有適當(dāng)?shù)挠?表面活性劑混合物。油相由73％的Tegosoft DEC、20％的輕礦物油和7％的ABIL WE 09表面活性劑組成，其被新近混合，且在使用之前均衡至少30分鐘。與此混合物一起形成的乳劑在標(biāo)準(zhǔn)乳劑PCR期間示出優(yōu)良的熱穩(wěn)定性。在步驟4B中，在將水相移液到油混合物之后，通過以大約3000rpm渦旋大約30秒而形成可變大小的小滴。通過將小攪拌棒添加到混合物來進(jìn)一步增強乳化，所述小攪拌棒促進(jìn)了渦旋期間水相分裂為較小的小滴。表面活性劑在油中的存在穩(wěn)定了乳劑，這減小了混合物中小滴融合的頻率。

將含有水相和油相兩者的系統(tǒng)添加到含有小不銹鋼珠的小收集微型管。隨后在15Hz到17Hz下?lián)u動所述管20秒以產(chǎn)生乳劑。在步驟4C中，隨后將乳劑轉(zhuǎn)移到0.2mL PCR管中，且在Bio-Rad C1000熱循環(huán)儀中在95℃(熱啟動)下實行3分鐘且在95℃下實行30秒的50個循環(huán)、在54℃下實行30秒的50個循環(huán)且在72℃下實行30秒的50個循環(huán)的PCR。

實例2

用于在多井板中產(chǎn)生可變體積的小滴的方法

此實例提供根據(jù)本公開的一個方面的用于產(chǎn)生可變體積的多分散小滴且隨后進(jìn)行改性和分析的方法。

圖4描繪用于小滴乳劑PCR的經(jīng)優(yōu)化的高通量過程。在多通道移液管將油和含水PCR試劑加載到多井板上之后，在3000rpm下將整個多井板渦旋30秒以誘發(fā)乳化。隨后將多井板裝配有熱循環(huán)儀適配器，且混合物在95℃(熱啟動)下經(jīng)歷3分鐘且在95℃下經(jīng)歷30秒的50個循環(huán)、在54℃下經(jīng)歷30秒的50個循環(huán)且在72℃下經(jīng)歷30秒的50個循環(huán)的PCR擴增。隨后從熱循環(huán)儀移除多壁板且使用熒光顯微鏡來使其成像，而不需要另外樣本轉(zhuǎn)移步驟。在此實例中，在乳化之后的任何小滴不穩(wěn)定性(例如，融合)將獨立于機械處置。

實例3

最佳擬合圓的確定

此實例提供用于確定用于多分散小滴系統(tǒng)中的小滴的最佳擬合圓的方法。在此方面中，使用現(xiàn)有優(yōu)化方法而使被假定為小滴的一些或整個邊界的一組像素擬合到圓。在此方面中，使用如在MATLAB中所實施的Nelder-Mead算法。所述算法最小化如在以下方程式(1)中所界定的擬合誤差：

在此方程式中，X_trial和Y_trial對應(yīng)于用于優(yōu)化程序中的當(dāng)前步驟的圓的中心的試驗位置。R_trial是用于優(yōu)化程序中的當(dāng)前步驟的圓的試驗半徑。在一組外部像素中存在與X_p擬合的N_p個像素，且Y_p是所述組中的第p個像素的位置。因此，平方根正負(fù)號內(nèi)的量是從試驗中心到第p個像素的距離，從所述距離減去試驗半徑而獲得誤差。對所述誤差進(jìn)行平方、遍及所述組中的所有像素進(jìn)行求和，且隨后除以試驗半徑的平方以獲得擬合誤差。

作為優(yōu)化的部分，對在群組內(nèi)部的也在當(dāng)前試驗圓內(nèi)部的像素的數(shù)目進(jìn)行計數(shù)。如果在圓內(nèi)部的像素的數(shù)目(N_C)超過既在圓內(nèi)部又在群組內(nèi)部的像素的數(shù)目(N_C，G)，那么通過將下者(如方程式(2)中所界定)加到擬合誤差來處罰當(dāng)前試驗位置和半徑：

(N_C-N_C，G)² (2)

來自方程式(2)的量的相加會抑制所述優(yōu)化將太大且顯著地延伸到群組之外的圓選擇為最佳擬合圓，當(dāng)僅擬合小滴的邊界的分?jǐn)?shù)且噪聲造成那個分?jǐn)?shù)展現(xiàn)不表示小滴的曲率時，可出現(xiàn)所述圓。在一些情況下，所述方法使用每個像素的擬合誤差來作為評估到小滴的擬合的質(zhì)量的部分。擬合中的像素的數(shù)目是N_p，且在以下方程式(e)中界定每個像素的擬合誤差：

在本公開的另一方面中，在評估到小滴的擬合的質(zhì)量時使用均方誤差。這在以下方程式(4)中予以界定：

實例4、5和6各自參考圓到外部邊界像素或特征像素的擬合，其涉及此實例中所描述的方法。

實例4

用于識別小滴的反向分水線方法

此實例描述根據(jù)本公開的一方面的用于執(zhí)行反向分水線方法的示范性過程。

根據(jù)此方面，通過假設(shè)40％的圖像是背景來計算圖像的初始背景截止。對于此初始背景截止，20％(等于40％除以2)是對應(yīng)于背景像素強度的中值的圖像強度的估計百分位。通過假設(shè)估計背景標(biāo)準(zhǔn)偏差是圖像的20％百分位與圖像的1％百分位之間的差的一半來計算估計背景標(biāo)準(zhǔn)偏差。背景截止的初始估計于是為估計中值加上估計標(biāo)準(zhǔn)偏差的兩倍。針對下一步驟選擇具有小于背景截止的初始估計的強度的像素。計算選定像素的強度的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，且確定具有小于所述平均值的強度的圖像像素的百分比，且發(fā)現(xiàn)是22％。將那個百分比與20％進(jìn)行比較，20％是對應(yīng)于背景的中值的圖像強度的估計百分位的初始估計。這些值被判斷為良好地一致，且選定像素的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差被接受為圖像中的背景的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差以用于計算SCT和BT。在那些值尚未良好地一致的情況下，隨后將通過將22％用作對應(yīng)于背景像素強度的中值的圖像強度的估計百分位且重復(fù)在此段落開頭開始的程序來計算新的初始背景截止。

隨后通過使先前所計算的背景的標(biāo)準(zhǔn)偏差乘以信噪比且將結(jié)果加到先前所計算的平均背景的平均強度來確定圖像的SCT。此處，將信噪比選擇為3.2，然而，可由用戶取決于圖像中的噪聲的量而調(diào)整此值。

隨后選擇等于圖像的最大像素強度的截止閾值。在30步內(nèi)降低此截止閾值，直到其達(dá)到SCT。在此情況下，所述步驟是以904.0、872.0、841.2、811.5、782.8、755.1、728.4、702.7、677.8、653.8、630.7、608.4、586.9、566.2、546.1、526.8、508.2、490.2、472.9、456.2、440.1、424.5、409.5、394.5、379.5、364.5、349.5、334.5、319.5和304.5而間隔。第一值等于圖像中的最大像素強度，且最后值等于圖像的SCT。創(chuàng)建經(jīng)平滑的圖像的副本以供在稍后步驟中使用。在此實例中，通過MATLAB的conv2()函數(shù)來執(zhí)行所述平滑，所述函數(shù)使圖像與被界定(使用MATLAB的記號法)為‘[0.05，0.10，0.05；0.10，0.40，0.10；0.05，0.10，0.05]’的平滑結(jié)構(gòu)卷積。

在每個步驟處，使用成像分析軟件來找到圖像中的高于當(dāng)前步驟的截止閾值的多組像素(在下文中被簡稱為像素組)。這些像素組可包括從“水位”起的“突出部”或“島”。在此實例中，要求像素為4連接以被視為同一像素組的部分。如果此類像素組的區(qū)域等于或超過用戶定義的準(zhǔn)則(即，在此情況下是9)，那么將其標(biāo)記為所關(guān)注區(qū)(ROI)。在此情況下，在確定所述組的區(qū)域是否具有足夠大小之前，使用MATLAB例程imclose()來閉合圖像，其中通過MATLAB表達(dá)strel(‘disk’，1)來界定結(jié)構(gòu)化元素。一旦ROI出現(xiàn)在圖像的特定位置中，就隨著減小截止閾值而跟蹤其區(qū)域。還跟蹤每個ROI內(nèi)的最大強度像素的位置以及像素的值。

隨著降低截止閾值，有可能使兩個或多于兩個ROI合并。高于特定截止閾值的像素組可包含對于較大截止閾值是單獨的兩個或多于兩個ROI。這可由于以下任一者而發(fā)生：(i)不同的ROI表示不同的小滴，所述小滴靠近在一起以使得它們之間的邊界區(qū)具有大于當(dāng)前截止閾值的像素強度；或(ii)樣本中的噪聲的振幅足夠大以使得單個小滴內(nèi)的兩個或多于兩個區(qū)展現(xiàn)局部極大值。這些極大值對于算法可顯現(xiàn)為較大截止閾值處的單獨ROI。

使用一組用戶定義的準(zhǔn)則來確定其區(qū)域包含在當(dāng)前步驟的同一像素組內(nèi)的不同ROI應(yīng)被合并且此后被看作一個ROI，還是不被合并且作為單獨ROI被跟蹤?？扇Q于以下各者而作出此確定：(i)不同ROI的最大強度像素之間的距離，以及(ii)不同ROI的最大強度像素的值，且。還可應(yīng)用其他用戶定義的準(zhǔn)則來作出此確定。

在此實例中，對于準(zhǔn)則(i)，如果圖像的平滑副本的最大強度像素中的距離小于5個像素，那么兩個ROI被合并且此后被看作單個ROI。在此實例中，對于準(zhǔn)則(ii)，如果最大強度像素具有在用于識別當(dāng)前像素組的截止的背景標(biāo)準(zhǔn)偏差的0.75倍內(nèi)的強度，那么兩個ROI被合并且此后被看作單個ROI。推理是：如果兩個先前單獨的ROI對于當(dāng)前截止值出現(xiàn)在同一像素組中，那么像素組中的位于兩個最大強度像素之間的像素必須具有高于當(dāng)前截止的強度。因此，如果兩個ROI中的每一者中的最大強度兩者都接近當(dāng)前截止，那么像素組中的位于兩個極大值之間的像素必定已具有接近極大值的強度。因此，兩個ROI被組合且被指派給同一小滴。

在最后步驟(即，已使用SCT的點)之后，像素組被稱作像素群組。在其區(qū)域包含在同一像素群組內(nèi)的不同ROI未被合并的情況下，那個像素群組的未指派像素被指派給ROI。具體來說，按強度對像素群組內(nèi)的未指派像素的列表進(jìn)行分類，且將緊接地鄰近于ROI中的一者且僅一者的具有最大強度的像素指派給那個ROI。重復(fù)此過程，直到剩余的僅未指派像素是緊接地鄰近于兩個或多于兩個不同ROI的像素。那些像素保持未指派。

將反向分水線方法應(yīng)用于圖1中的圖像，其為使用共聚焦熒光顯微術(shù)獲得的多分散小滴乳劑系統(tǒng)的灰度圖像。如圖5A所示，將圖像劃分為多個群組，所述多個群組是由其強度低于背景閾值的像素分離。所述群組中的一些僅含有單個ROI，且一些含有兩個或多于兩個ROI。圖5A所描繪的邊界像素是屬于鄰近于非群組像素的群組的那些像素。

分析所得的像素群組，且將其內(nèi)的ROI指派給小滴且經(jīng)受以下過程步驟，所述過程步驟未必需要以下文所描述的次序發(fā)生：

步驟1。如果群組僅含有單個ROI，那么將其視為單個小滴，且使其外部邊界像素擬合到圓以獲得小滴直徑。

步驟2。對于尚未指派給小滴的ROI，如在實例3中所描述而獲得到那個ROI的外部邊界像素的最佳擬合圓。隨后檢查每個未指派ROI。如果在圓內(nèi)部的ROI的像素的數(shù)目是圓的區(qū)域的至少30％，那么執(zhí)行擬合，從而將被檢查的ROI的外部邊界像素與尚未指派給小滴的任何鄰近ROI的外部邊界像素進(jìn)行組合。當(dāng)一個ROI的內(nèi)部邊界由零個或一個像素而與另一ROI的內(nèi)部邊界分離時，兩個ROI被視為“鄰近”。在圖5A中，被看似為二重線的東西分離的ROI被視為鄰近。所述二重線表示彼此靠近而安放的兩個內(nèi)部邊界。將外部邊界像素的組合組擬合到圓，且評估結(jié)果來決定兩個ROI是否應(yīng)被組合且被視為單個小滴的部分。用于組合兩個ROI的準(zhǔn)則是：(i)兩個ROI的組合的每個像素的擬合誤差小于0.12，或者每個像素的擬合誤差小于被檢查的原始ROI的擬合誤差的1.5倍；以及(ii)一起在最佳擬合圓內(nèi)部的兩個ROI的區(qū)域是ROI的區(qū)域的至少85％的區(qū)域。如果兩個ROI被組合，那么它們此后被標(biāo)示為小滴且被看作單個單元。所述小滴的外部邊界像素于是為指派給所述小滴的ROI的一組外部邊界像素。對所有鄰近的ROI重復(fù)此過程。

步驟3。如果未指派ROI不具有未指派的鄰近ROI，那么所述方法將那個ROI的外部邊界擬合到圓。如果每個像素的擬合誤差小于0.12且最佳擬合像素內(nèi)部的ROI的區(qū)域是圓的區(qū)域的至少60％，那么將所述ROI接受為小滴。

步驟4。此方法隨后檢查多對小滴來確定它們是否事實上為同一小滴的多個部分。在此步驟處，要求被檢查的小滴的最佳擬合圓在大小上彼此類似。所述方法比較已經(jīng)被找到的小滴的中心之間的距離。有可能的是，在此階段被識別為小滴的兩個區(qū)實際上是同一小滴的多個部分。計算一對小滴的最佳擬合中心之間的距離，且如果其小于小滴中的每一者的最佳擬合半徑的20％，那么測試所述對以查看它們是否實際上為同一小滴的多個部分。組合兩個小滴的外部邊界像素，且將像素的組合組擬合到圓。對所考慮的兩個小滴的擬合誤差進(jìn)行求和且除以外部邊界像素的組合組中的像素的數(shù)目。組合組的每個像素的擬合誤差必須小于此量的1.5倍且還小于0.12。在那種情況下，兩個小滴被組合且此后被視為一個小滴。針對所有對小滴重復(fù)此過程。

步驟5。接下來，檢查每個像素群組以確定其是否具有小滴以及未指派ROI兩者。如果是，那么對于每個小滴，檢查未指派ROI，且確定給定ROI的區(qū)域的至少85％是否位于與所述小滴相關(guān)聯(lián)的最佳擬合圓內(nèi)部。如果是，那么所述未指派ROI是添加到小滴的候選者。接下來，通過將小滴的外部像素與ROI的外部邊界像素進(jìn)行組合而形成組合的外部邊界像素組。隨后將所述組合組擬合到圓。存在需要在得出應(yīng)將ROI指派給小滴的結(jié)論之前滿足的若干準(zhǔn)則，這些準(zhǔn)則包含：(i)組合組的最佳擬合圓的位置與小滴的最佳擬合圓的位置之間的距離必須小于3個像素(這取決于若干考慮因素，主要是圖像中的像素的大小)；(ii)組合組的最佳擬合圓的位置與ROI的最佳擬合圓的位置之間的距離必須小于ROI的最佳擬合圓的半徑的20％；(iii)組合組的每個像素的擬合誤差必須小于ROI的每個像素的擬合誤差的兩倍；(iv)組合組的每個像素的擬合誤差必須小于0.12；以及(v)組合擬合的均方誤差必須小于到ROI的最佳擬合圓的均方誤差的1.5倍。如果滿足所有這些準(zhǔn)則，那么將ROI指派給小滴。

步驟6。在此步驟中，檢查多對小滴以確定它們是否為同一小滴的多個部分。在一些方面中，構(gòu)成所述多對的小滴可具有不同的直徑。計算一對小滴的最佳擬合中心之間的距離，且如果其小于小滴中的每一者的最佳擬合半徑的50％，那么計算兩個小滴區(qū)域的重疊量。如果每個最佳擬合圓的多于60％的區(qū)域位于另一最佳擬合圓內(nèi)部，那么將兩個小滴的外部邊界像素進(jìn)行組合，且將像素的組合組擬合到圓。擬合必須滿足的準(zhǔn)則列表比在前一步驟中的長。將乘數(shù)M_err界定為1.5。隨后，對所考慮的兩個小滴的擬合誤差進(jìn)行求和且除以外部邊界像素的組合組中的像素的數(shù)目。組合組的每個像素的擬合誤差必須小于此量的M_err倍且還小于0.12。接下來，計算組合擬合的均方誤差MSE_combined。另外，針對被檢查的兩個小滴中的每一者計算新均方誤差，但代替使用每個小滴的最佳擬合圓，通過比較像素的組合組的最佳擬合圓與指派給每個小滴的外部邊界像素來計算每個小滴的均方誤差。MSE_combined必須小于每個小滴的新均方誤差的M_err倍。最終，使像素的組合組的最佳擬合位置從被檢查的兩個小滴中的每一者的最佳擬合位置不變地移位。確定從第一小滴的最佳擬合位置到組合組的最佳擬合位置的距離。差必須小于第一小滴的最佳擬合半徑的20％。確定從第二小滴的最佳擬合位置到組合組的最佳擬合位置的距離。差必須小于第二小滴的最佳擬合半徑的20％。針對圖像中的所有對小滴重復(fù)此過程。如果一對小滴被發(fā)現(xiàn)為已滿足所有這些準(zhǔn)則，那么將那些小滴組合且此后看作單個小滴。在已檢查所有小滴之后，將0.35加到M_err且重復(fù)此整個步驟。逐漸地增加M_err會導(dǎo)致小滴緩慢地被組合且減小不正確的組合的可能性。繼續(xù)此過程以用于將M_err的值增加直到2.9。

步驟7。此步驟涉及檢查具有顯著重疊的多對小滴，而不管它們是否具有類似大小。將乘數(shù)M_err界定為1.5，且將最小分?jǐn)?shù)F_min界定為50％。按外部邊界像素的數(shù)目對最佳擬合圓的圓周的比率從最大到最小而對圖像的小滴進(jìn)行排序。檢查多對小滴(i，j)，其中i是指具有較大半徑的小滴，且j是指具有較小半徑的小滴。如果小滴j的區(qū)域的至少F_min被小滴i的區(qū)域重疊，那么檢查所述對以查看所述小滴是否應(yīng)組合。將兩個小滴的外部邊界像素組合為擬合到圓的組。必須滿足若干準(zhǔn)則以便得出應(yīng)組合兩個小滴的結(jié)論，包含以下各者：(i)組合擬合的每個像素的擬合誤差必須小于0.12；(ii)組合擬合的每個像素的擬合誤差必須小于小滴j的最佳擬合圓的每個像素的擬合誤差的M_err倍；(iii)組合擬合的均方誤差必須小于小滴j的最佳擬合圓的均方誤差的M_err倍；以及(iv)組合擬合的圓的中心的最佳擬合位置與小滴j的最佳擬合圓的中心的最佳擬合位置之間的距離必須小于小滴j的最佳擬合半徑的20％。如果滿足所有這些準(zhǔn)則，那么小滴i和j被組合且被視為一個小滴。

步驟8。在此步驟中，檢查每個像素群組且確定其是否具有小滴以及未指派ROI兩者。如果是，那么對于每個小滴，其檢查每個未指派ROI，且確定所述ROI的區(qū)域的至少85％是否位于與所述小滴相關(guān)聯(lián)的最佳擬合圓內(nèi)。如果是，那么所述未指派ROI是添加到小滴的候選者。接下來，通過將小滴的外部像素與ROI的外部邊界像素進(jìn)行組合而形成組合的外部邊界像素組。將所述組合組擬合到圓。此步驟具有在將把ROI添加到小滴的情況下必須滿足的一組準(zhǔn)則，包含以下各者：(i)組合擬合的每個像素的擬合誤差必須小于ROI的擬合誤差的每個像素的擬合誤差的1.2倍；以及(ii)到組合組的最佳擬合圓的中心的位置與到ROI的最佳擬合圓的中心的位置之間的距離必須小于1.4個像素或小于到ROI的最佳擬合圓的半徑的20％。如果滿足這些準(zhǔn)則，那么將ROI指派給小滴。

步驟9。在此階段，仍有可能的是，指派給小滴的ROI未完全地描述小滴的圓周。按外部邊界像素的數(shù)目對最佳擬合圓的圓周的比率從最大到最小而對圖像的小滴進(jìn)行排序。對于每個像素群組，檢查其中的每一者具有小于0.5的比率的多對小滴。此步驟具有需要在進(jìn)一步考慮小滴以供合并之前滿足的一些準(zhǔn)則。計算兩個小滴的最佳擬合圓之間的重疊量。計算兩個最佳擬合圓的中心之間的距離。所述準(zhǔn)則包含以下各者：(i)重疊區(qū)的大小必須超過兩個圓的區(qū)域的30％；(ii)兩個圓之間的距離必須小于無論哪個最佳擬合圓較大的最佳擬合半徑的20％；以及(iii)兩個最佳擬合圓之間的最佳擬合半徑的差必須小于30％。如果滿足這些準(zhǔn)則，那么對兩個小滴的外部邊界像素進(jìn)行組合，且將圓擬合到組合組。針對所有對小滴重復(fù)此程序。

步驟10。對于每個小滴，隨后計算外部像素的數(shù)目對最佳擬合圓的圓周的比率，且不考慮此比率不超過0.65的任何小滴。

步驟11。對于每個像素群組，制備仍未指派給小滴的所有ROI的列表。隨后對于每個未指派ROI，所述方法搜索與其具有最大重疊的小滴。如果重疊區(qū)的大小超過ROI內(nèi)的區(qū)域的50％，那么所述方法檢查是否應(yīng)將所述ROI指派給小滴。其計算小滴的最佳擬合圓內(nèi)部的未被指派給小滴的ROI占據(jù)的區(qū)域。如果未指派ROI的區(qū)域小于小滴的最佳擬合圓內(nèi)部的未被占據(jù)區(qū)域的區(qū)域的1.05倍，那么對小滴和未指派ROI的外部邊界像素進(jìn)行組合以形成外部邊界像素的組合組。隨后將此組合組擬合到圓。此步驟具有在可將ROI添加到小滴之前必須滿足的一組準(zhǔn)則，包含以下各者：(i)組合擬合的每個像素的擬合誤差必須小于ROI的擬合誤差的每個像素的擬合誤差的1.2倍；(ii)到組合組的最佳擬合圓的中心的位置與到ROI的最佳擬合圓的中心的位置之間的距離必須小于1.4個像素或小于到ROI的最佳擬合圓的半徑的20％；或(iii)組合組的每個像素的擬合誤差的每個像素的擬合誤差必須小于0.12。如果滿足這些準(zhǔn)則，那么將ROI指派給小滴。

步驟12。如果不具有任何外部邊界像素的任何ROI在小滴的最佳擬合圓內(nèi)部，那么隨后將它們指派給那個小滴。

圖5B示出通過此實例中的方法制備的最終的經(jīng)處理圖像。圖5B中的圖像對應(yīng)于圖1和圖5A，且包含可被識別為小滴的那些小滴的最佳擬合邊界。隨后可使用圖5B的圖像來確定每個給定所識別的小滴的小滴大小和目標(biāo)分子存在。

實例5

用于識別小滴的圓檢測方法

此實例描述根據(jù)本公開的一方面的用于執(zhí)行圓檢測方法的示范性過程。

根據(jù)此方面，如上文在實例4中針對反向分水線方法所描述而計算SCT，不同之處在于信噪比是2.5(而不是實例4中的3.2)。將此SCT應(yīng)用于圖像來界定所述圖像內(nèi)的像素群組。SCT的值還用于識別每個像素群組內(nèi)的孔。檢查像素群組以尋找像素群組內(nèi)部的其強度低于SCT的8連接組的像素。如果所述組含有9個或多于9個像素，那么將其標(biāo)示為孔。將像素群組內(nèi)的鄰近于孔的任何像素的列表添加到像素群組的外部邊界的列表。對像素群組的外部邊界進(jìn)行修整以消除噪聲像素。經(jīng)修整的外部邊界像素的列表僅包含像素群組的鄰近于至少一個內(nèi)部像素的那些外部邊界像素。在此實例中，經(jīng)修整的外部邊界像素還將被稱作特征像素。將圓Hough變換應(yīng)用于每個群組的特征像素的列表。

針對每個像素群組的范圍為從3個像素到60個像素的圓半徑執(zhí)行所述變換。根據(jù)此方面，對標(biāo)準(zhǔn)變換方法進(jìn)行修改以考慮圖像中的顯著噪聲水平?？扇芜x地執(zhí)行此修改，這取決于所使用的圖像的噪聲特性。指派給像素的投票的數(shù)目是指派給像素是半徑R的圓的中心的可能性的權(quán)重。一般來說，對于給定半徑R，此值僅為像素的距離R內(nèi)的特征像素的數(shù)目。在此方法中，其為圓的中心的距離R-1到R+1內(nèi)的特征像素的數(shù)目。針對R的每個值來計算特定中心位置的投票的數(shù)目以及投票給每個中心位置的特征像素的列表。在此實例中，通過圓Hough變換找到的圓將被稱作“H圓”，以將其與在將外部像素的列表擬合到圓時所獲得的最佳擬合圓區(qū)別開。后者被稱作“圓”。

如下減少針對每個像素群組而產(chǎn)生的H圓的列表。丟棄具有少于9個投票的H圓。還丟棄投票的數(shù)目對H圓的圓周的比率小于0.40的H圓。丟棄含有任何孔像素的H圓。接下來，識別包括H圓的圓周的像素，且對處于圖像中的像素的數(shù)目進(jìn)行計數(shù)(H圓可延伸到所述圖像之外)。此時應(yīng)用的準(zhǔn)則如下：(i)圖像中的圓周像素的數(shù)目N_CI必須超過14；(ii)N_CI對圓周中的像素的數(shù)目的比率必須超過0.60；以及(iii)H圓的投票的數(shù)目對N_CI的比率必須超過0.50。如果H圓通過這些準(zhǔn)則，那么檢查處于圖像的背景中的圓周的分?jǐn)?shù)。如果那個分?jǐn)?shù)小于0.15，那么在此階段接受H圓。如果所述分?jǐn)?shù)不小于0.15，但半徑是5或更小，那么計算與群組中的像素相距多于1個像素的H圓的區(qū)域的分?jǐn)?shù)。如果H圓的半徑是4或5且分?jǐn)?shù)是0.15或或更小，那么在此階段接受H圓。如果H圓的半徑是3且分?jǐn)?shù)是0.20或或更小，那么在此階段接受H圓。

針對仍在此階段接受的H圓來計算H圓的投票的數(shù)目對圖像中的圓周像素的數(shù)目的比率。按此比率對H圓進(jìn)行分類，開始于最大者且隨后在大小上遞減。比較每個H圓與具有那個比率的較小值的所有H圓。如果H圓的中心在彼此的個像素內(nèi)，且H圓的半徑相差小于四，那么拒絕具有所述比率的較小值的H圓。通過此方法來分析圖1中的圖像，且在圖6A中示出到此階段的結(jié)果。在此階段存在重疊的H圓。

在此實例中，下一步驟是拒絕作為任何小滴的不良表示的H圓，且隨后將被判斷為表示同一小滴的多個部分的圓進(jìn)行組合。每個H圓與投票給那個H圓的一組外部邊界像素相關(guān)聯(lián)。將每個H圓的特征像素的列表擬合到圓，且計算所述擬合的均方誤差。在此時，每個H圓界定經(jīng)擬合以獲得最佳擬合圓(BF圓)的一組像素。對于此實例中的額外分析，如果拒絕BF圓，那么也拒絕與其相關(guān)聯(lián)的H圓。如果將BF圓指派給小滴，那么將關(guān)聯(lián)H圓指派給同一小滴。如果均方誤差超過0.70，那么拒絕BF圓。觀察到，樣本中的一些較大小滴具有極不規(guī)則的外部邊界。這歸于小滴的內(nèi)含物與環(huán)繞小滴的連續(xù)媒介之間的折射率失配。位于大的小滴與顯微鏡物鏡之間的小的小滴能夠充當(dāng)透鏡，且因此使大的小滴的邊界的圖像失真。為了防止此情形造成過早地拒絕較大BF圓，針對較大BF圓放寬以上準(zhǔn)則。如果投票的數(shù)目(即，N_F個外部邊界像素擬合到圓)大于30，那么在擬合的均方誤差超過0.70+0.03x(N_F-30)的情況下拒絕BF圓。

接下來，計算多對BF圓的區(qū)域重疊的量，且編譯重疊區(qū)域大于兩個BF圓中的一者的65％的區(qū)域的多對BF圓的列表。對于每一對，計算圓內(nèi)部的作為像素群組的部分的區(qū)域的分?jǐn)?shù)，且計算每個圓的唯一(并非還投票給其他圓)的投票的分?jǐn)?shù)。如果針對一個BF圓計算的分?jǐn)?shù)都小于針對另一個BF圓的對應(yīng)分?jǐn)?shù)，那么拒絕第一BF圓。

對于任何BF圓尚未被拒絕且具有不同區(qū)域的多對BF圓，應(yīng)用另一測試。計算在較小BF圓內(nèi)部但不在較大BF圓內(nèi)部的像素的數(shù)目。如果所述數(shù)目小于較小BF圓的投票的數(shù)目的一半，那么拒絕較小BF圓。

對于此時任何BF圓尚未被拒絕的多對BF圓，計算BF圓的中心之間的距離，且計算兩個BF圓的半徑之間的差。如果所述中心之間的距離小于2.1個像素，且半徑之間的差小于2.1個像素，那么拒絕具有較小數(shù)目個投票的BF圓。

接下來，對于每個BF圓，計算唯一投票的數(shù)目。唯一投票是并非也是先前自身尚未被拒絕的任何其他BF圓的投票的投票。如果唯一投票的數(shù)目小于10或唯一投票對投票總數(shù)的比率小于0.40，那么拒絕那個BF圓。

對于每個像素群組，編譯未指派給任何H圓(未指派)的外部像素群組邊界像素的列表。如果未指派像素的分?jǐn)?shù)小于外部像素群組邊界像素的總數(shù)的10％，那么重新檢查被拒絕的H圓。對于其中的每一者，編譯唯一投票(不是任何被接受的H圓的部分的投票)的列表。如果此類投票的數(shù)目超過被拒絕的H圓的圓周的60％，那么將被拒絕的H圓恢復(fù)到被接受的H圓的列表。此時接受的所有H圓暫時被視為小滴。

接下來，檢查像素群組中的每一對可能小滴，這些小滴在下文分別被稱作“小滴1”和“小滴2”。針對每對中的每個小滴來計算唯一投票(即，一個小滴的不是其他小滴的投票的投票)的數(shù)目。針對小滴1和小滴2的唯一投票的數(shù)目分別被標(biāo)示為N_U1和N_U2。如果這些數(shù)目中的任一者小于9，那么使所述對經(jīng)受額外測試。對于這些測試，計算小滴的最佳擬合中心之間的距離(d)。而且，對于這些測試，內(nèi)部區(qū)域標(biāo)示位于最佳擬合圓內(nèi)部并且還位于像素群組中的像素。隨后計算四個額外量。這些量是d對小滴1的最佳擬合半徑的比率(D₁)、d對小滴2的最佳擬合半徑的比率(D₂)、不在小滴2內(nèi)部的小滴1內(nèi)部區(qū)域的分?jǐn)?shù)(F₁)，以及不在小滴1內(nèi)部的小滴2內(nèi)部區(qū)域的分?jǐn)?shù)(F₂)。應(yīng)注意，此實例中使用的術(shù)語僅適用于此實例。

應(yīng)用以下額外條件和測試：

條件A：如果N_U1和N_U2兩者都小于9，那么執(zhí)行測試A。測試A。如果D₁和D₁兩者都小于0.3，那么拒絕具有較小的最佳擬合半徑的小滴。

條件B：如果條件A不適用且N_U1小于9，那么執(zhí)行測試B。測試B：如果F₁小于0.4，那么拒絕小滴1。

條件C：如果條件A和B不適用且N_U2小于9，那么執(zhí)行測試C。測試C：如果F₂小于0.4，那么拒絕小滴2。

條件D：如果條件A、B或C都不適用，那么應(yīng)用兩部分測試D。測試D，部分1：如果N_U1小于N_U2，且如果D₁、D₂和F₁都小于0.3，那么拒絕小滴1。如果否，那么應(yīng)用測試D，部分2。測試D，部分2：如果N_U2小于N_U1，且如果D₁、D₂和F₂都小于0.3，那么拒絕小滴2。

條件E：如果條件A、B、C或D都不適用，那么應(yīng)用測試E。測試E：計算唯一區(qū)域像素的分?jǐn)?shù)，出于此測試的目的，所述分?jǐn)?shù)被界定為在一小滴內(nèi)部的不在像素群組中的任何其他小滴內(nèi)部的區(qū)域的分?jǐn)?shù)。計算全部唯一投票的分?jǐn)?shù)，出于此測試的目的，所述分?jǐn)?shù)被界定為一小滴的不是像素群組中的任何其他小滴的投票的投票的分?jǐn)?shù)。如果小滴1的兩個分?jǐn)?shù)小于小滴2的對應(yīng)分?jǐn)?shù)，那么拒絕小滴1。如果小滴2的兩個分?jǐn)?shù)小于小滴1的對應(yīng)分?jǐn)?shù)，那么拒絕小滴2。

接下來，個別地檢查像素群組中的每個小滴。構(gòu)建作為小滴的最佳擬合圓周的部分且在圖像內(nèi)的像素的列表。計算在像素群組內(nèi)部但不與外部邊界像素重合或鄰近的那些像素的分?jǐn)?shù)(F_C)。如果F_C超過60％，那么拒絕小滴。

如果F_C超過0.3且在像素群組內(nèi)部但不與外部邊界像素重合或鄰近的像素的數(shù)目大于2，那么執(zhí)行不同的測試。從作為小滴的最佳擬合圓周的部分的像素的列表創(chuàng)建兩個組。第一組(組1)是由與指派給小滴的投票重合或鄰近的那些像素組成。第二組(組2)是由在像素群組內(nèi)部但不在組1中的那些像素組成。計算組1中的像素的強度的平均值(A₁)和標(biāo)準(zhǔn)偏差(S₁)。計算組2中的像素的強度的平均值(A₂)。如果A₁+(2-F_C)xS₁＜A₂，那么拒絕小滴。在一些情況下，使小滴的外部邊界失真的噪聲產(chǎn)生顯著地小于小滴的H圓。在那些情況下，位于小滴的內(nèi)部中的BF圓的圓周的部分可具有顯著地大于位于像素群組的外部邊界附近的部分的平均強度。此測試用于識別和拒絕那些H圓。

接下來，對于每個小滴，構(gòu)建內(nèi)部像素(即，在最佳擬合圓內(nèi)部且在小滴內(nèi)部的像素)的列表，且分析那些像素的強度。如果那些強度的百分之九十小于平均背景強度加上背景強度的標(biāo)準(zhǔn)偏差的5倍，那么拒絕小滴。如果具有大于平均背景強度加上背景強度的標(biāo)準(zhǔn)偏差的3.5倍的強度的內(nèi)部像素的數(shù)目(N_3.5)小于4，那么拒絕小滴。還計算其強度高于平均背景強度加上3.5的內(nèi)部像素的分?jǐn)?shù)(F_3.5)。如果F_3.5小于0.10，那么拒絕小滴。如果F_3.5小于0.15且N_3.5小于20，那么拒絕小滴。

在那時重新檢查小滴。如果唯一投票(一小滴的并非也是不同小滴的投票的投票)的數(shù)目小于5，那么拒絕小滴。如果唯一投票的數(shù)目小于9且擬合的均方誤差多于0.25且擬合誤差多于0.4，那么拒絕小滴。

隨后嘗試將任何外部像素群組邊界像素指派給小滴。對于每個小滴，在小滴的最佳擬合圓內(nèi)部或鄰近處的任何外部像素群組邊界像素被暫時添加到那個小滴的投票(用于獲得最佳擬合圓的像素)的列表。從指派給那些小滴的投票的列表移除通過此程序而添加到多于一個小滴的像素。

隨后使用每個小滴的投票的經(jīng)修訂列表來獲得最佳擬合圓。

接下來，個別地檢查像素群組中的每個小滴。編譯在小滴的最佳擬合圓內(nèi)部、是群組的部分但不是另一小滴的部分的像素的列表。如果那些像素的數(shù)目小于在小滴的最佳擬合圓內(nèi)部且在像素群組內(nèi)的像素的總數(shù)的75％，那么應(yīng)用以下兩個測試(測試F和G)。

測試F：構(gòu)建作為小滴的最佳擬合圓周的部分且在圖像內(nèi)的像素的列表。計算在像素群組內(nèi)部但不與外部邊界像素重合或鄰近的那些像素的分?jǐn)?shù)(F_C)。如果F_C超過60％，那么拒絕小滴。

測試G：如果F_C超過0.3且在像素群組內(nèi)部但不與外部邊界像素重合或鄰近的像素的數(shù)目大于2，那么執(zhí)行不同的測試。從作為小滴的最佳擬合圓周的部分的像素的列表創(chuàng)建兩個組。第一組(組1)是由與指派給小滴的投票重合或鄰近的那些像素組成。第二組(組2)是由在像素群組內(nèi)部但不在組1中的那些像素組成。計算組1中的像素的強度的平均值(A₁)和標(biāo)準(zhǔn)偏差(S₁)。計算組2中的像素的強度的平均值(A₂)。如果A₁+(2-F_C)xS₁＜A₂，那么拒絕小滴。在一些情況下，使小滴的外部邊界失真的噪聲產(chǎn)生顯著地小于小滴的最佳擬合圓。在那些情況下，位于小滴的內(nèi)部中的最佳擬合圓的圓周的部分可具有顯著地大于位于像素群組的外部邊界附近的部分的平均強度。此測試用于識別和拒絕那些小滴。

如果均方誤差超過1.0，那么拒絕BF圓。然而，如果投票的數(shù)目(N_F個外部邊界像素擬合到圓)大于30，如果那么放寬此要求，且在擬合的均方誤差超過1.0+0.03x(N_F-30)的情況下拒絕小滴。

如果每個像素的最大擬合誤差超過0.10，那么拒絕小滴。

計算其到最佳擬合圓的距離在最佳擬合半徑的±1.16個像素內(nèi)的小滴的投票的分?jǐn)?shù)(F_G)。而且，計算小滴的投票對位于圖像中的最佳擬合圓周的那個部分的大小的比率(F_VC)。如果F_G小于0.5且F_VC小于0.575，那么拒絕小滴。

對于每個小滴，構(gòu)建內(nèi)部像素(在最佳擬合圓內(nèi)部且在像素群組內(nèi)部的像素)的列表，且分析那些像素的強度。如果那些強度的百分之九十小于平均背景強度加上背景強度的標(biāo)準(zhǔn)偏差的5倍，那么拒絕小滴。如果具有大于平均背景強度加上背景強度的標(biāo)準(zhǔn)偏差的3.5倍的強度的內(nèi)部像素的數(shù)目(N_3.5)小于4，那么拒絕小滴。還計算其強度高于平均背景強度加上3.5的內(nèi)部像素的分?jǐn)?shù)(F_3.5)。如果F_3.5小于0.10，那么拒絕小滴。如果F_3.5小于0.15且N_3.5小于20，那么拒絕小滴。

將此實例的程序應(yīng)用于圖1中的圖像。在圖6A中示出此方法的中間結(jié)果，且在圖6B中示出被接受的小滴的最佳擬合圓。

實例6

用于識別小滴的組合式反向分水線與圓檢測方法

此實例描述根據(jù)本公開的一方面的用于執(zhí)行組合式反向分水線與圓檢測方法的示范性過程。

根據(jù)此方面，使用反向分水線方法確定ROI、像素群組和外部邊界像素，此后將圓Hough變換應(yīng)用于邊界像素。通過組合地執(zhí)行這些方法，應(yīng)用額外準(zhǔn)則來將群組內(nèi)的ROI分類為小滴。針對此實例界定三個不同截止。如實例4中所描述而計算背景的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。這些在此實例中將被稱作初始平均值和初始標(biāo)準(zhǔn)偏差。此實例的SCT是初始平均值加上初始標(biāo)準(zhǔn)偏差的2.5倍?？椎慕刂故浅跏计骄导由铣跏紭?biāo)準(zhǔn)偏差的2.75倍。應(yīng)用一另外截止來確定哪些像素是背景的部分。背景截止是初始平均值和背景的初始標(biāo)準(zhǔn)偏差的2.3倍。使用較小截止來界定背景將會消除含有源自樣本中的其他焦平面的熒光的圖像的區(qū)域。其強度小于背景截止的所有像素被視為最終背景的部分。

另外，檢查具有大于背景截止的強度的所有4連接組的像素。如果所述組的區(qū)域小于10個像素，那么那些像素包含在最終背景中。最終背景中的像素用于計算最終平均背景強度，其用于獲得被減去背景的強度。

在此實例中，如實例5中一樣，首先應(yīng)用使用SCT的截止來界定群組。另外，檢查每個像素群組以尋找像素群組內(nèi)部的其強度低于孔截止(HT)的8連接組的像素。如果所述組含有九個或多于九個像素，那么將其標(biāo)示為孔。將像素群組內(nèi)的鄰近于孔的任何像素的列表添加到像素群組的外部邊界的列表。隨后將反向分水線方法應(yīng)用于圖像，如實例4中一樣。通過首先確定像素群組，隨后立即將通過反向分水線方法找到的任何ROI收集到它們所屬的像素群組中。這是出于記賬目的而進(jìn)行，且不是必需的。對ROI的外部邊界進(jìn)行修整以消除噪聲像素。經(jīng)修整的外部邊界像素的列表僅包含ROI的鄰近于至少一個內(nèi)部像素的那些外部邊界像素。內(nèi)部像素是作為像素群組的部分但不鄰近于非群組像素的像素。

經(jīng)修整的外部邊界的列表在下文被稱作特征像素的列表。與實例4的反向分水線方法相對比，在此階段不將每個ROI的經(jīng)修整的外部邊界像素擬合到圓。代替地，將圓Hough變換應(yīng)用于每個ROI的特征像素的列表。針對每個像素群組的范圍為從2個像素到60個像素的圓半徑執(zhí)行所述變換。由于圖像中的高噪聲水平，在此實例中使用用于執(zhí)行變換的經(jīng)修改方法。指派給像素的投票的數(shù)目在此方面中是指派給像素是半徑R的圓的中心的可能性的權(quán)重。一般來說，對于給定半徑R，指派給像素的投票的數(shù)目將代替地是像素的距離R內(nèi)的特征像素的數(shù)目。在此方法中，其為圓的中心的距離R-1、R或R+1內(nèi)的特征像素的數(shù)目。針對R的每個值來計算特定像素的投票的數(shù)目以及投票給每個像素的特征像素的列表。

如下減少針對每個ROI而產(chǎn)生的圓的列表：(i)如果被不是ROI所屬的像素群組的部分的像素(非像素群組像素)占據(jù)的圓的分?jǐn)?shù)超過30％，那么拒絕圓；(ii)如果圓內(nèi)部的非群組像素的數(shù)目對像素的圓周的比率超過0.40，那么拒絕圓；(iii)如果是非像素群組像素的圓的圓周的分?jǐn)?shù)超過70％，那么拒絕圓；以及(iv)如果圓內(nèi)部的非像素群組像素對圓內(nèi)部的像素群組像素的比率超過0.30，那么拒絕圓。

隨后檢查具有相同半徑的多對圓。如果圓的中心之間的距離小于半徑的50％(或在半徑＜5個像素的情況下小于2個像素)，那么比較投票給兩個圓中的每一者的像素的列表。如果存在多于30％的重疊(兩個圓共有的投票的數(shù)目是兩個列表中的任一者的30％或更多)，那么拒絕具有較小數(shù)目個投票的圓。

接下來，檢查可具有不同半徑的多對圓。如果圓的中心之間的距離小于較大圓的半徑的50％，那么比較投票給兩個圓中的每一者的像素的列表。如果存在多于30％的重疊(兩個圓共有的投票的數(shù)目是具有較小半徑的圓的列表的30％或更多)，那么拒絕具有較小半徑的圓。

按投票的數(shù)目對在那時與ROI相關(guān)聯(lián)的圓進(jìn)行分類，開始于最大投票數(shù)目。隨后比較每個圓與和具有較少投票的ROI相關(guān)聯(lián)的所有其他圓(在下文分別被稱作圓A和B)。如果圓B的50％或更多的投票也是圓A的投票，那么針對那對圓執(zhí)行兩個額外檢查。如果圓B內(nèi)的60％或更多的區(qū)域也在圓A內(nèi)部，那么拒絕圓B。如果任一圓與圖像的邊緣重疊，那么所考慮的區(qū)域僅為圖像中的圓的區(qū)域的那個部分。對于額外查詢，計算兩個圓的中心之間的距離。如果此距離小于兩個圓中較大者的半徑的89％，那么拒絕圓B。根據(jù)此方面的下一步驟是使用針對ROI而識別的圓將ROI分組為小滴。

如果像素群組此時僅具有單個ROI圓，那么使用那個圓來識別用于對小滴定大小的外部邊界像素。

如果存在兩個或多于兩個圓，那么隨后執(zhí)行一組測試。對于每個圓，計算從其中心到像素群組中的所有其他圓的中心的距離，且隨后除以第一圓的半徑(ΔC_scaled)。創(chuàng)建所有圓對的列表，且按ΔC_scaled進(jìn)行分類，開始于最小者。如果一對圓的ΔC_scaled小于0.10且兩個圓的半徑差對較小圓的半徑的比率小于0.20，那么將所述兩個圓(以及與它們相關(guān)聯(lián)的ROI)指派給同一小滴的部分。將在此階段尚未指派給小滴的任何剩余圓各自指派給單獨小滴。接下來，創(chuàng)建與小滴相關(guān)聯(lián)的投票的列表。投票的列表包含指派給小滴的圓的所有投票。隨后將此列表擬合到圓。

有可能的是，單個ROI可能已被指派給多于一個小滴。對此進(jìn)行檢查，且在那些實例中，計算從每個小滴的最佳擬合中心到與ROI相關(guān)聯(lián)的圓的中心的距離。將此距離為最小的ROI指派給小滴，且從指派給小滴的圓的列表移除此距離為最大的ROI。所述實例的此步驟假設(shè)通過反向分水線方法找到的每個ROI都僅為一個小滴的部分。如果此步驟留下不具有指派給其的任何ROI的小滴，那么拒絕那個小滴。創(chuàng)建與像素群組相關(guān)聯(lián)的小滴列表，且按半徑進(jìn)行分類，開始于最大半徑。隨后比較像素群組內(nèi)的所有對小滴。如果具有較小半徑的最佳擬合圓內(nèi)部的75％或更多的像素也在具有較大半徑的最佳擬合圓內(nèi)部，那么拒絕具有較小最佳擬合半徑的小滴，且將指派給被拒絕的小滴的任何ROI指派給具有較大半徑的小滴。

接下來，如果在像素群組中存在任何未指派ROI，那么對其進(jìn)行檢查以查看是否應(yīng)將它們指派給現(xiàn)有小滴。使用MATLAB的imdilate()函數(shù)以及由MATLAB表達(dá)strel(‘square’，3)界定的結(jié)構(gòu)化元素以產(chǎn)生掩模來擴大小滴的圓周的像素(通過將圓擬合到小滴的投票而確定)。對于每個未指派ROI，如果50％或更多的其經(jīng)修整的外部邊界像素在那個掩模內(nèi)，那么將那個ROI指派給小滴。將在掩模內(nèi)部的ROI的像素添加到那個小滴的投票。將其所指派的ROI的列表通過這些步驟而改變的任何小滴重新擬合到圓。如果隨后發(fā)現(xiàn)像素群組根本不具有與它們相關(guān)聯(lián)的小滴，那么將經(jīng)修整的外部邊界像素擬合到圓，且將整個像素群組看作一個小滴。

在其他方面中，可使用替代方法來定位圖像內(nèi)的額外小滴。如果像素群組具有不在小滴內(nèi)部的大量像素，那么可將尚未指派給小滴的任何ROI的外部邊界像素擬合到圓?？稍谄渲袘?yīng)用額外約束以作為與非群組像素不具有顯著重疊的補充，這些額外圓可被約束為與群組內(nèi)的現(xiàn)有小滴不具有顯著重疊。

通過使用圓Hough變換來減輕具有高像素強度的兩個小滴之間的區(qū)導(dǎo)致非圓形邊界的問題，這是因為其排斥了形成非圓形邊界的像素。

圖7A示出在將反向分水線方法和圓Hough變換方法應(yīng)用于圖1的圖像和被拒絕的非想要的圓之后產(chǎn)生的經(jīng)處理圖像。圖7B示出在對那些圓進(jìn)行分類以識別和定位小滴之后獲得的最終結(jié)果。

實例7

dPCR擴增和分析

此實例描述用于使用多分散小滴乳劑系統(tǒng)對核苷酸樣本進(jìn)行dPCR擴增和分析的方法。

為了將擴增產(chǎn)物在小滴內(nèi)的存在可視化，將熒光探測劑添加到特別地辨識擴增子的存在的反應(yīng)混合物。將小量(1-2μM)的紅色熒光染料6-羧基-X-若丹明(ROX)用作反應(yīng)混合物中的參考染料。ROX的光譜特征容易地與用于報告擴增的綠色熒光探測劑的光譜特征區(qū)別開。此外，ROX熒光信號對擴增或其他反應(yīng)或試劑條件不敏感。兩個強度(一個是從參考染料予以測量，且一個是從探測劑予以測量)的比率用于從每個所測量的小滴進(jìn)行二元測量。所述強度比率不受到由于融合或收縮而引起的小滴體積的改變或光激發(fā)功率的非想要的改變影響，這是因為這些改變中的每一者將同等地影響兩種染料的熒光強度，從而使所述比率不變。

為了建構(gòu)小滴大小的分布的輪廓，將乳劑轉(zhuǎn)移到96井板上，其表面被硅烷化，且覆蓋有過量的油-表面活性劑混合物。在PLAN APO 20X、0.75NA物鏡的情況下，在多跟蹤模式中使用Zeiss LSM 510共聚焦顯微鏡來使乳劑成像。使用543nm(LP 610)和488nm(BP 500-530)的激光源激發(fā)波長以從ROX和FAM染料收集熒光信號。對于每個視場，沿著z軸在不同深度處使一系列光學(xué)截面(z棧)成像，以建構(gòu)小滴尺寸的3D輪廓。

圖8A到圖8C說明用于在數(shù)據(jù)獲取期間驗證PCR擴增產(chǎn)物在小滴中的存在的快速方法。圖8A和圖8B中的圓指示所識別的小滴。在圖8A和圖8B右側(cè)的曲線圖沿著左側(cè)的圖像中所描繪的直線描繪熒光強度。橫越穿過紅色熒光(ROX)和綠色熒光(FAM)通道(分別在圖8A和圖8B中)中的具有類似直徑的兩個小滴的中心的線來測量熒光強度。還使用綠色熒光DNA報告來標(biāo)記一些但不是全部ROX標(biāo)記的小滴。兩種小滴具有類似的紅色熒光強度，而小滴(2)的綠色熒光強度比小滴(1)大大約2.5倍。小滴(1)的較低信號與由包括FAM熒光團的TaqMan探測劑產(chǎn)生的背景強度一致，從而指示在小滴(1)中不存在目標(biāo)DNA。在FAM通道中所觀察的小滴(2)中的較高信號指示在那個小滴中發(fā)生擴增。

圖8C示出在乳化之后使用ROX熒光信號測量的489個小滴的小滴直徑分布。

圖9示出針對以dsDNA的三種不同起始濃度(即，直方圖10A中的～2×10³dsDNA個副本/μL、直方圖10B中的～2×10⁶dsDNA個副本/μL，和直方圖10C中的～2×10⁷dsDNA個副本/μL)加載的多分散小滴的群體的綠色對紅色熒光強度的比率的頻率分布。在最低濃度下，在PCR之后，基本上沒有小滴含有經(jīng)擴增DNA樣本(直方圖10A)。此分布主要由缺少經(jīng)擴增產(chǎn)物的小滴組成，其中平均FAM/ROX比率為0.35(N＝1701個小滴)。在中等濃度下，在PCR之后，一些小滴含有經(jīng)擴增DNA樣本，而其他小滴不含有經(jīng)擴增DNA樣本(直方圖10B)。在此初始目標(biāo)分子濃度(～2×10⁶個分子/μL)下，可看到兩個清楚的分布(直方圖10C)，其對應(yīng)于類似于圖10A所示的小滴的非擴增小滴(白條)，和具有大于0.625的FAM/ROX比率的經(jīng)擴增小滴(黑條)。此值比非擴增小滴的均值大1.5倍以上，使得其為用于區(qū)別含有或不含有經(jīng)擴增樣本的小滴的適當(dāng)閾值。在最高濃度下，在PCR之后，基本上所有小滴都含有經(jīng)擴增DNA樣本(直方圖10C)。在甚至更高的初始目標(biāo)分子濃度(～2×10⁷個分子/μL)下，幾乎所有乳劑小滴都具有高于用于檢測經(jīng)擴增樣本的閾值的FAM/ROX比率(直方圖10C)。

實例8

用于dPCR之后的小滴分析的方法

此實例描述使用連續(xù)可變小滴體積的數(shù)字?jǐn)U增分析方法，例如，多分散小滴乳劑系統(tǒng)中的數(shù)字PCR。通過使用此方法，可借助多分散小滴而使用數(shù)字檢定準(zhǔn)確地確定目標(biāo)樣本濃度C_S。

樣本分布成具有可變大小的小滴，且目標(biāo)分子成為小滴的分布遵循Poisson統(tǒng)計。盡管此實例提供用于計算樣本濃度的方法，但應(yīng)理解，其他合適的方法可用于確定樣本濃度。在此實例中，初始樣本濃度(C_S)被表達(dá)為給定體積中的分子數(shù)。樣本分布成可變體積的離散分區(qū)或“小滴”，其中目標(biāo)分子成為小滴的分布遵循Poisson統(tǒng)計。對于數(shù)字檢定中的每個小滴，且如方程式(5)中所示，目標(biāo)的平均數(shù)取決于其體積V_i以及初始樣本濃度C_S：

P(n，C_SV_i)是針對溶液中的目標(biāo)分子的給定濃度C_S在體積V_i的小滴中找到n個分子的概率。擴增反應(yīng)將致使含有一或多個分子的小滴可通過報告(例如，實例7中所描述的熒光報告)而與空白小滴區(qū)別開。在此方法中，僅知曉小滴是空白(n＝0)還是被占據(jù)(n＞0)。在以下方程式(6)和(7)中示出關(guān)聯(lián)概率：

為了確定目標(biāo)分子的濃度C_S，可遍及具有相應(yīng)體積V_i的大量小滴而對P(n＞0，C_SV_i)進(jìn)行求和。

對于每個分析步驟，存在小滴的固定數(shù)目N_d，且那些小滴具有目標(biāo)分子的給定濃度C_S。小滴直徑隨機地變化且在圖10中示出那些小滴的大小分布。此分布可與在圖8C中所測量的實驗分布相當(dāng)。所述分布是對數(shù)正態(tài)分布，其中僅包含介于8微米與64微米之間的直徑。

各種小滴具有目標(biāo)分子的濃度C_S，且在一些情況下，濃度C_S可以為零，這指示在給定小滴中缺少目標(biāo)分析物。對被確定為含有目標(biāo)分析物的小滴的總數(shù)N_S進(jìn)行計數(shù)，且隨后與被占據(jù)小滴的預(yù)期數(shù)目N_E進(jìn)行比較，如以下方程式(8)中所描述：

對于C＝C_S，獲得N_E的最可能值。通過使用N_d個小滴的體積，可將方程式(8)擬合到N_S以獲得濃度的最佳擬合值，其中C是唯一可調(diào)整參數(shù)。使用Newton-Rhapson算法以找到N_S-N_E的零點。通過用分布的中值體積替換方程式(8)中的V_i且求解C而獲得C的初始值。所述算法隨后通常進(jìn)行5至11次迭代以使C的改變下降到低于十萬分之一。那時C的值被看作C的最佳擬合值。

這些計算設(shè)法確定此程序估計給定C_S的準(zhǔn)確程度，且如果兩個不同樣本得到C的不同最佳擬合值，那么嘗試計算樣本具有不同濃度的置信度。

此方法包含每個小滴的體積以及其關(guān)聯(lián)誤差的測量。小滴直徑的誤差可由高斯分布誤差近似，這適用于任何給定直徑測量。小滴直徑用于計算小滴體積，且因此小滴直徑的誤差引起小滴體積的對應(yīng)誤差將所述對應(yīng)誤差代入方程式(9)中以基于所測量的體積而得到被占據(jù)小滴的預(yù)期數(shù)目。

在此實例中，通過顯微術(shù)確定小滴直徑。此方法的準(zhǔn)確性可取決于所使用的接物鏡的數(shù)值孔徑(NA)以及成像系統(tǒng)的其他組件。為了將大量靜止小滴成像在表面上，NA將很可能小于1且直徑測量的誤差通常為0.5微米至1.0微米，而獨立于小滴的大小?？紤]測量誤差的兩個不同量值且將其標(biāo)示為E₁和E₂。對于E₁，加到小滴直徑的高斯分布誤差的標(biāo)準(zhǔn)偏差是1微米或所述小滴直徑的8％中的較大者。包含相對誤差，使得計算包含最大小滴的不可忽略的測量誤差。對于E₂，加到小滴直徑的高斯分布誤差的標(biāo)準(zhǔn)偏差是2微米或所述小滴直徑的15％中的較大者。在這兩種情況下，對于所測量的直徑存在一個極限。如果具有測量誤差的特定小滴直徑引起直徑小于0.5微米，那么丟棄所述測量誤差且針對所述小滴產(chǎn)生新直徑。結(jié)果是無偏測量誤差。

C_S是程序正嘗試確定的實際未知濃度，且s是由實驗者測量的體積。C變化，直到方程式(9)中的等于被占據(jù)小滴的所測量的數(shù)目以獲得最佳擬合濃度。

執(zhí)行計算，其中C_S＝4.4×10^-5個分子/fL且N_d在500到10000的范圍內(nèi)。從圖10所示的直徑分布中獲得小滴大小，圖10描繪用于驗證用于執(zhí)行數(shù)字檢定的方法的小滴直徑的截尾對數(shù)正態(tài)分布。對于小滴直徑的無測量誤差(“0誤差”)以及E₁和E₂測量誤差的情況重復(fù)計算。對于每個小滴數(shù)目以及誤差量，執(zhí)行1000次計算，且計算平均最佳擬合濃度以及最佳擬合濃度的分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

標(biāo)準(zhǔn)偏差對平均最佳擬合濃度的比率被稱為“測量可變性”且在圖11中針對小滴數(shù)目的范圍以及測量誤差的量予以標(biāo)繪。圖11示出測量可變性受到樣本大小(即，小滴的數(shù)目)的影響程度。針對以被設(shè)置為4.4×10^-5個分子/fL的樣本濃度執(zhí)行的數(shù)字檢定而產(chǎn)生數(shù)據(jù)。測量可變性反映數(shù)字檢定在估計樣本的實際濃度方面的準(zhǔn)確性，其中較多測量可變性暗示較低準(zhǔn)確性。對于此模擬，測量可變性(垂直軸)被定義為標(biāo)準(zhǔn)偏差除以估計濃度分布的均值的比率。針對不同小滴數(shù)目(從圖10所示出的小滴直徑分布獲得)以及針對小滴直徑的模擬測量中的三個不同誤差量計算測量可變性。在一組計算中，小滴直徑的測量無誤差(“0誤差”)。在另一組計算中，小滴直徑誤差分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差是1μm或?qū)嶋H小滴直徑的8％中的較大者(“E₁誤差”)。在第三組計算中，小滴直徑誤差分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差是2μm或?qū)嶋H小滴直徑的15％中的較大者(“E₂誤差”)。對于三個不同小滴直徑測量誤差量的測量可變性中的相似性表明任何給定樣本的測量可變性是由Poisson統(tǒng)計支配，這會控管目標(biāo)分子在小滴之中的分布。結(jié)果，由于小滴大小測量誤差引起的最佳擬合濃度的任何可變性對濃度確定具有小或可忽略的影響，只要所述可變性無偏即可。

可在置信度和功效方面描述能夠區(qū)別濃度差異的方法。此方面由Lieber，R.L.(1990年)的“假設(shè)測試中的統(tǒng)計顯著性和統(tǒng)計功效(Statistical Significance and Statistical Power in Hypothesis Testing)”(《整形外科研究雜志(J.Orthopaedic Research)》第8期，第304至309頁)描述。本發(fā)明的方法使能夠確定給定測量的置信水平，這在對兩個不同樣本的測量得到兩個不同最佳擬合濃度(C₁和C₂)時特別相關(guān)。因此，將有用的是了解斷定兩個樣本的濃度不同的置信度以及在得出濃度并非不同的結(jié)論時出現(xiàn)錯誤的概率。通過要求結(jié)果具有所需最小置信度來控制錯誤肯定結(jié)果(類型I誤差)的風(fēng)險，且通過要求方法具有所需功效來控制錯誤否定結(jié)果(類型II誤差)的風(fēng)險。

對于來自兩個不同樣本的兩個最佳擬合濃度的比較，虛假設(shè)將是兩個樣本具有相同(未知)濃度。如果α是具有相同濃度的兩個樣本可引起量值相差大于|C₁和C₂|的最佳擬合濃度的概率，那么(1-α)是與拒絕虛假設(shè)相關(guān)聯(lián)的置信度。選擇(1-α)的可接受最小值以限制錯誤肯定結(jié)果。下文描述防止錯誤否定的功效的使用。

一種用于估計置信水平的方法是如方程式(10)中所示的Z測試：

95％的置信水平是常見選擇且要求Z＞1.96。從方程式(9)的最佳擬合結(jié)果中導(dǎo)出C_n的值，且是與C_n的測量相關(guān)聯(lián)的方差。在此實例中，估計這是因為相信不存在此項的易處理分析表達(dá)式。執(zhí)行用于估計置信度的第二模擬方法且與Z方法結(jié)果進(jìn)行比較。在下文中，將兩種方法標(biāo)示為Z方法和對方法(或P方法)。

對于置信度的Z方法估計，使用C_S的兩個不同值(C_S1和C_S2)。對于C_S1，從截尾對數(shù)正態(tài)分布中隨機地選擇一組5000個小滴，且使用方程式(6)來計算被占據(jù)小滴的數(shù)目。使用測量誤差的E₁大小來產(chǎn)生體積使用如上文所描述的方程式(8)來獲得濃度C₁的最佳值。通過執(zhí)行N_Z＝1000個額外計算來估計標(biāo)準(zhǔn)偏差。對于每一者，通過獲取一組所測量的體積且使用方程式(6)以確定其中的被占據(jù)者來確定由于Poisson統(tǒng)計引起的可變性的量。隨后使用方程式(8)來擬合被占據(jù)數(shù)目以獲得每個額外計算的最佳擬合濃度。額外N_Z個計算的標(biāo)準(zhǔn)偏差用于方程式(9)中的₁。隨后針對C_S2重復(fù)此過程。可使用方程式(9)從最佳擬合濃度C_n以及所測量的小滴體積計算置信度的估計。

對于置信度的P方法估計，虛假設(shè)是各自從其實際濃度是兩個最佳擬合濃度的平均值的樣本獲得兩個最佳擬合結(jié)果(C₁和C₂)。確定小滴直徑的N_p＝500個額外組，且對于每一者，針對濃度確定被占據(jù)小滴的數(shù)目且使用測量誤差的E₁大小來產(chǎn)生所測量的體積。針對每個組獲得最佳擬合濃度隨后隨機地選擇M_p＝500對值，其中從均組進(jìn)行替換，且比較所述值的差的絕對值與ΔC＝C₂-C₁。均大于ΔC的分?jǐn)?shù)提供α的估計，即，從具有濃度均樣本進(jìn)行的兩個測量將彼此相差大于ΔC的概率。α的P方法估計用于計算置信度，其等于(1-α)。

對于多對C_S值重復(fù)100次用于獲得置信度的兩個估計的整個程序。對于每次重復(fù)，產(chǎn)生每個C_S的一組新體積，且使用方程式(6)和(7)來產(chǎn)生每個C_S的被占據(jù)小滴的數(shù)目。在方程式(9)中產(chǎn)生和使用所測量的體積以擬合結(jié)果且獲得一對新最佳擬合濃度(C₁和C₂)。針對一對給定測量通過Z方法和P方法計算的置信度之間的差通常小于1％，因此任一方法可用于計算功效。用于分析測量的Z方法的一個優(yōu)點是其不需要用于產(chǎn)生小滴分布的數(shù)值法。

P方法也可用于分析測量值。對于兩個不同濃度，功效是超過置信度(1-α)的所需值的結(jié)果的分?jǐn)?shù)。使用N_d＝5000個小滴和E₁測量誤差執(zhí)行在區(qū)別相差50％的兩個濃度時的功效的確定。在圖12中根據(jù)兩個濃度中的較小者而標(biāo)繪結(jié)果。在圖12中，小滴直徑測量誤差的標(biāo)準(zhǔn)偏差是1μm或小滴直徑的8％中的較大者(“E₁誤差”)。虛線標(biāo)記0.95的功效，其對應(yīng)于未能檢測兩個樣本濃度的差的5％可能性(錯誤否定，或類型II誤差)。實線是用于在置信水平(1-α)等于0.95時區(qū)別相差50％的兩個濃度的情況的功效。對于95％的置信水平(其排斥錯誤肯定或類型I誤差)，將動態(tài)范圍定義為最大和最小濃度的比率，對于所述動態(tài)范圍，類型2誤差(即，錯誤否定)為5％或更小(功效＞0.95)。在圖12中在實線和虛線相交位置的較大濃度除以實線和虛線相交位置的較小濃度的比率處看到這一點。

圖13是描繪當(dāng)在具有小滴直徑測量誤差(“E₁誤差”)的多分散小滴(灰色圓，從圖10中的分布獲得的直徑)上或在不具有小滴直徑測量誤差的單分散小滴(黑色三角形，所有直徑恰好是30μm)上執(zhí)行時樣本大小(小滴的數(shù)目，在水平軸上示出)與數(shù)字檢定的動態(tài)范圍(在垂直軸上示出)之間的關(guān)系的曲線圖。所述動態(tài)范圍描述可有效地使用檢定的濃度范圍的廣度。具體來說，在假設(shè)95％的置信水平(錯誤肯定或類型I誤差的5％可能性)的情況下，將動態(tài)范圍定義為最大和最小濃度的比率，對于所述動態(tài)范圍，統(tǒng)計功效大于0.95。與單分散小滴相比較，當(dāng)在多分散小滴上執(zhí)行時，數(shù)字檢定對廣得多的濃度范圍有效。如圖13所示，對于相同數(shù)目個小滴，當(dāng)使用多分散小滴的分布時數(shù)字檢定具有顯著地大于使用單分散小滴的分布可獲得的動態(tài)范圍。出于此原因，多分散小滴的使用在分析上優(yōu)于單分散小滴的使用。

圖1是使用共聚焦熒光顯微術(shù)獲得的示范性多分散小滴乳劑系統(tǒng)的灰度圖像。

圖5A和圖5B描繪如應(yīng)用于圖1中的圖像的反向分水線方法的初始步驟的結(jié)果，包含如圖5A所示的所關(guān)注區(qū)(ROI)的識別，以及如圖5B所示的具有優(yōu)化的圓形區(qū)的最終的經(jīng)處理圖像，可從其確定關(guān)于小滴大小和目標(biāo)分子存在的信息。

圖6A示出在執(zhí)行如應(yīng)用于圖1的圖像的圓檢測方法的初始步驟之后所產(chǎn)生的經(jīng)處理圖像。圖6B示出在對圖6A中的圓進(jìn)行分類以識別和定位小滴之后所獲得的最終結(jié)果。

實例9

小滴直徑改變的特性化

此實例描述在PCR條件下對多分散小滴乳劑系統(tǒng)中的小滴大小分布改變的分析以及用于最小化此類改變的影響的方法。

小滴大小可出于多個原因而改變，包含由于蒸發(fā)和小滴融合。乳劑系統(tǒng)中的小滴可經(jīng)歷顯著溫度波動，例如，在PCR熱循環(huán)中發(fā)生的溫度波動。蒸發(fā)可遍及熱循環(huán)的過程而在小滴內(nèi)發(fā)生，這可更改小滴直徑和體積的分布。此外，在一些情況下，位于彼此附近的小滴可由于減小含小滴系統(tǒng)的總表面張力的傾向而彼此融合。遍及數(shù)字檢定的過程的小滴直徑和體積的改變可在所述改變顯著的情況下導(dǎo)致測量誤差。此實例闡述用于特性化和優(yōu)化測量系統(tǒng)且確保大小分布測量的準(zhǔn)確性的步驟，包含調(diào)查加熱和機械操縱對小滴大小的影響。

小滴融合。使用一般PCR試劑的混合物制備兩種乳劑。第一乳劑排除DNA模板和綠色熒光探測劑(FAM)兩者，而另一乳劑排除DNA模板和紅色熒光染料(ROX)兩者。在后者中，將綠色熒光探測劑(FAM)的最終濃度增加到1.4μM。允許兩種乳劑均安定和穩(wěn)定10分鐘。隨后使兩種乳劑輕輕地重新懸浮且與管的緩慢傾斜運動進(jìn)行組合。最后，將組合的混合物等分到三個PCR管中。將第一管分到一側(cè)作為未加熱(對照)樣本。使剩余兩個管在標(biāo)準(zhǔn)條件下熱循環(huán)以下循環(huán)時間(包含熱啟動)：1或50個循環(huán)。同時地運行復(fù)制品組。

圖14示出在多分散小滴乳劑中自發(fā)地或由于熱循環(huán)而發(fā)生的小滴融合事件的頻率。乳劑混合物的ROX和FAM熒光強度用于識別融合事件。以含有ROX和綠色熒光探測劑兩者的小滴的百分比反映小滴融合事件的頻率。使用圓標(biāo)示的小滴含有兩種染料(圖像14A和圖像14B)。僅由于后乳化小滴不穩(wěn)定性、樣本處置和移液引起的FAM和ROX融合事件被示出為最小，即，處于6.2±2.1％的速率(圖表14C)。應(yīng)注意，此測量不包含含有相同染料的小滴之間的融合事件，但其將被預(yù)期為值是相當(dāng)?shù)?。在熱啟動和一個熱循環(huán)之后，施加到乳劑樣本上的加熱引起6.1±1.4％的相當(dāng)?shù)娜诤鲜录?圖表14C)。針對50個循環(huán)檢測到的FAM-ROX融合事件(5.8±1.5％)還類似于一個循環(huán)的融合事件(圖表14C)。兩個加熱條件正好在對照小份的誤差范圍內(nèi)。

重要的是應(yīng)注意，融合事件不會表現(xiàn)為相對于熱循環(huán)持續(xù)時間逐漸地增加。這表明熱循環(huán)加熱幾乎不會誘發(fā)小滴融合，且促成小滴不穩(wěn)定性的主要因素與兩種顏色乳劑的混合和樣本處置相關(guān)。這由于在熱循環(huán)之前或在熱循環(huán)期間早期出現(xiàn)的融合事件將不會使檢定的結(jié)果偏斜而顯著，這是因為含有至少一個目標(biāo)分子的合并小滴將經(jīng)歷擴增且提供肯定信號，而不經(jīng)歷擴增的合并小滴將提供否定信號。與此對比，在熱循環(huán)期間較晚發(fā)生的融合事件可引起合并小滴下降到低于檢定的二元檢測閾值，從而引起不正確地特性化小滴。實驗的結(jié)果指示融合使用此方法應(yīng)對樣本量化產(chǎn)生最小影響。另外，如果通過全部在同一裝置上執(zhí)行乳化和熱循環(huán)來從過程完全地消除樣本處置，那么融合可對檢定的結(jié)果產(chǎn)生甚至更小的影響。圖4中示出消除樣本處置后乳化的潛在工作流的實例。

小滴收縮。通過比較否定對照與熱循環(huán)乳劑樣本的小滴大小分布來執(zhí)行小滴收縮的分析。使用標(biāo)準(zhǔn)PCR混合物和乳化過程來制備乳劑。檢查與融合實驗相同的熱條件。將乳劑樣本的小滴直徑分布標(biāo)準(zhǔn)化且在圖15中予以標(biāo)繪，圖15比較經(jīng)受無加熱、1個或50個熱循環(huán)的多分散小滴乳劑中的小滴直徑分布。進(jìn)行此實驗以將由反復(fù)熱循環(huán)引起的小滴大小改變量化。對照組具有15.4±0.1μm的平均直徑(測量1857個小滴)。經(jīng)受一個熱循環(huán)的多分散小滴乳劑(圖15中的三角形)具有14.9±0.4μm的平均直徑(測量1952個小滴)。經(jīng)受50個熱循環(huán)的多分散小滴乳劑(圖14中的圓)具有15.8±0.5μm的平均直徑(測量1660個小滴)。三種條件的小滴直徑分布是不可區(qū)別的，此指示熱循環(huán)不會引起小滴體積的可觀改變。

實例10

最佳擬合濃度與通過UV吸收確定的濃度之間的比較

此實例描述在通過本公開的最佳擬合方法確定的樣本濃度與通過UV吸收測量的樣本濃度之間觀察到的良好一致性。

比較erbB2 dsDNA的連續(xù)稀釋的最佳擬合濃度與通過在260nm處的吸收測量確定的濃度。濃度跨越四個數(shù)量級的范圍(即，2×10³、2×10⁴、2×10⁵和2×10⁶dsDNA副本/μL)，其中每個濃度下有多個樣本。使用如本文中所描述的簡單邊界方法確定小滴直徑，且所述分析包含直徑在7到50μm(1到500pL體積)的范圍內(nèi)的小滴。額外PCR參數(shù)與實例7中所描述的參數(shù)一致。使用以下方程式(8)獲得最佳擬合濃度：

圖18是描繪針對上述erbB2 dsDNA樣本的在如通過最佳擬合方法(在垂直軸上示出)所確定的樣本濃度值與如通過在260nm處的吸收測量(在水平軸上示出)所確定的樣本濃度值之間的關(guān)系的曲線圖。圖18中的比較示出兩種方法之間的良好一致性，如通過兩者之間的線性關(guān)系所指示。

實例11

使用最大可能數(shù)方法的小滴分析

此實例描述使用最大可能數(shù)(MPN)方法來確定目標(biāo)樣本的濃度(與使用如實例8中所描述的方程式(8)相對比)。通過使用此方法，在不識別、定大小或枚舉未被占據(jù)小滴的情況下準(zhǔn)確地確定目標(biāo)樣本的濃度C_S。

對于涉及腔室和井的特定情況，首先確定含有目標(biāo)樣本的腔室或井的數(shù)目。在執(zhí)行檢定之前預(yù)確定腔室的數(shù)目。每個腔室的體積是一組離散大小中的一者，所述大小也是在執(zhí)行檢定之前預(yù)確定。

對于涉及腔室和井的特定情況，下文將方程式(8)的MPN等效者示出為方程式(11)：

在方程式(11)中，存在m個不同大小的腔室。對于第i個大小，每個腔室的體積是V_i，且存在那個大小的n_i個腔室。在運行反應(yīng)之后，b_i是未被占據(jù)的第i個大小的腔室的數(shù)目。方程式隨后經(jīng)擬合以獲得C(溶液的濃度)。

在涉及小滴的此方法中，方程式(11)中的左邊項是所有小滴的總體積。所述小滴全部具有不同大小，因此，n_i中的每一者等于1且所有n_i的總和等于小滴的總數(shù)。存在m個不同大小，且針對所有小滴執(zhí)行求和。因為b_i對于未被占據(jù)小滴是1且對于被占據(jù)小滴是0，所以(n_i-b_i)項致使方程式(11)左邊的總和等于遍及僅被占據(jù)小滴的總和，且因此方程式(11)可被簡化和標(biāo)示為以下方程式(12)：

其中O_i對于被占據(jù)小滴是1，且否則為0。還可針對C迭代地求解此方程式。使用方程式(12)和方程式(8)執(zhí)行的模擬得到幾乎相等的結(jié)果，其中差小于擬合中的統(tǒng)計誤差。

如上文所提及，方程式(12)的總和中的項對于未被占據(jù)小滴是0。因此，如果知曉樣本的總體積，那么有可能識別和確定樣本中的被占據(jù)小滴的大小，此后可使用方程式(12)來確定樣本濃度。根據(jù)此方法，不需要識別未被占據(jù)小滴的存在或大小。

在需要對被占據(jù)小滴和未被占據(jù)小滴兩者定大小的方法中使用兩種不同熒光染料。舉例來說，在所有小滴中為熒光的染料1用于對小滴定大小，且僅在被占據(jù)小滴中顯著地發(fā)熒光的染料2用于確定小滴是否被占據(jù)。然而，在所述實例的另外方面中，通過使用方程式(12)，有可能僅使用染料2來執(zhí)行此實例中所描述的方法。因此，染料2的熒光用于識別被占據(jù)小滴的存在和大小兩者。

當(dāng)濃度小時，被占據(jù)小滴的數(shù)目對應(yīng)地小。在那種情況下，掃描大量乳劑以尋找適度數(shù)目個被占據(jù)小滴。因為此方法僅要求需要對被占據(jù)小滴定大小，所以存在需要分析的顯著較少的小滴，這又顯著地減少所述方法的分析時間。另外，在低濃度下，兩個被占據(jù)小滴將不可能彼此觸碰。因為很少的被分析小滴會觸碰，所以需要區(qū)別那些小滴的較少計算。因此，使用此方法顯著地減少了計算要求，由此簡化了掃描較大的樣本體積以尋找小滴的過程。更容易地掃描較大體積的能力簡化了對低濃度樣本的分析，由此增加了所述方法的敏感性。

此實例中所描述的最大可能數(shù)(MPN)方法可與本文中所描述的其他方法進(jìn)行組合，其中修改如下：當(dāng)使用MPN方法時，不需要分析未被占據(jù)小滴的圖像。舉例來說，通過將閾值像素強度設(shè)置成排除缺少目標(biāo)樣本的小滴且僅分析含有目標(biāo)樣本的小滴，本公開中所描述的圖像處理算法中的任一者可與此實例的MPN方法組合地使用。

實例12

用于改進(jìn)成像深度的折射率匹配

在此實例中，描述出于對乳劑系統(tǒng)進(jìn)行光學(xué)成像的目的而匹配兩種或多于兩種不混溶流體的折射率的益處。

用于匹配構(gòu)成離散相和連續(xù)相的流體的折射率的能力可增強數(shù)據(jù)獲取能力。當(dāng)折射率不匹配時，可使照明(或成像)路徑偏轉(zhuǎn)或失真，從而導(dǎo)致在數(shù)據(jù)獲取期間丟失信號。乳劑小滴的彎曲表面變?yōu)檠苌浜蜕⑸湔彰鞯奈⑼哥R，且較深地成像到溶液中會增加所獲取的數(shù)據(jù)中的像差的嚴(yán)重度。實際上，隨著觀看平面較深地聚焦(Z維度)到樣本中，小滴邊界由于照明源必須行進(jìn)穿過的重疊小滴的數(shù)目增加而變得較不可辨別(圖16的A1到A5)。

圖16示出使用構(gòu)成多分散小滴乳劑的流體的折射率匹配實現(xiàn)的數(shù)據(jù)獲取能力的改進(jìn)。使用共聚焦顯微鏡從兩種不同乳劑(分別在圖16的A1到A5和圖16的B1到B5中描繪)在逐漸較深(從左到右)的焦平面處獲取熒光圖像。使用73％的Tegosoft DEC、20％的輕礦物油和7％的Abil WE09油混合物(折射率≈1.4)作為連續(xù)載體相來制成所述兩種乳劑。對于圖16的A1到A5，小滴是由溶解在含水溶液(折射率＝1.33)中的PCR試劑構(gòu)成。對于圖16的B1到B5，小滴是由溶解在水(50重量％)和甘油(50重量％)混合物(折射率＝1.398)中的PCR試劑構(gòu)成。在含水樣本(圖16的A1到A5)中，兩種不混溶流體組分的折射率不同，且小滴邊界在較深的焦平面處獲取的圖像中變得越來越不清楚，如圖16的A5中。在一個方面中，油混合物與水(n＝1.33)相比較的顯著較高的折射率(n≈1.4)導(dǎo)致涉及向PCR混合物添加高折射率組分(例如，甘油(100％(w/w)，n＝1.474)和蔗糖(65％(w/w)，n＝1.4532))的一系列折射率匹配測試。在混合的水和甘油樣本(圖16的B1到B5)中，兩種不混溶流體組分的折射率類似，且小滴邊界甚至在較深的焦平面處獲取的圖像中也仍然清楚，如圖16的B5中。

還調(diào)查碳氟油乳劑系統(tǒng)以嘗試更好地匹配它們的折射率。雖然礦物油系統(tǒng)具有顯著地高于水的折射率，但碳氟系統(tǒng)通常具有略微低于水的折射率(例如，全氟萘烷、全氟三丁胺FC-40、全氟三丁胺FC-70、Krytox，-參見上表1)。含有芳基的全氟化合物通常具有高于水的折射率，因此，在此系統(tǒng)中，可更改油的組成來改進(jìn)折射率匹配。調(diào)查含有45％(v/v)的全氟三丁胺FC-40與5％的Pico-Surf 1和55％(v/v)的與PCR水相混合的八氟甲苯的油相。在3000rpm下將所述混合物渦旋30s。由于水與碳氟油相相比較的較低密度(參見表1)，w/o小滴漂浮在油相上方。雖然這需要移除多余的油以在顯微鏡的工作距離內(nèi)使w/o小滴成像，但此組合改進(jìn)了在樣本中較深地獲取的z截面的圖像質(zhì)量。小滴的邊界失真得到了很大的減少，且在建構(gòu)小滴尺寸的3D輪廓時被允許較大范圍。

嘗試最小化任何油相組分的沸點的改變，所述組分應(yīng)在95℃的溫度下保持惰性。還努力減少或消除乳劑系統(tǒng)添加物對樣本或PCR試劑的影響。

實例13

用于控制密度和間距的多種乳劑

此實例描述使用多種乳劑以用于數(shù)字檢定的益處。

當(dāng)在乳劑系統(tǒng)組分之間存在折射率失配時，可需要在成像期間將小滴定位成盡可能地靠近顯微鏡物鏡。對于倒置顯微鏡，有可能允許將小滴安定在容器的底部上(假設(shè)小滴密度大于周圍流體的密度)。當(dāng)將礦物油用作連續(xù)載體相時，含水小滴比連續(xù)相更密集，這致使它們安定在底部上。然而，當(dāng)將碳氟基油用作連續(xù)載體相時，含水小滴將漂浮到流體的頂部。

可通過使用雙面乳劑來控制樣本小滴的位置。在水/油/水雙面乳劑系統(tǒng)中，可將碳氟油用作中間層，這致使含水小滴下沉到外部水相的底部。

針對次級水層的產(chǎn)生來測試兩種表面活性劑(例如，Tween 20和Span 80)。包含1％的Span 80的系統(tǒng)被發(fā)現(xiàn)為有效地得到次級水層。觀察到，為了折射率匹配而與純碳氟油(例如，F(xiàn)C-40)一起或與碳氟溶劑以某一組合形成的水/油/水乳劑具有在次級小滴中群聚的大量水/油小滴。添加例如Krytox GPL-107等高粘性碳氟油以增加FC-40的粘度，使得水/油乳劑不會立即上升且一起群聚在大塊油相上方。通過此方法，所產(chǎn)生的水/油/水乳劑不大可能具有群聚在次級小滴內(nèi)部的大量水/油小滴(圖17)?？赏ㄟ^變化油相的粘度來控制含水小滴的間距。

圖17示出在兩步驟乳化過程中制成的水/油/水雙面乳劑的熒光圖像：首先，使含有PCR試劑的含水溶液在由Krytox GPL-107、全氟三丁胺FC-40和Pico-Surf 1表面活性劑構(gòu)成的油混合物中乳化。隨后進(jìn)一步將所得的水/油乳劑乳化為由水和Span 80表面活性劑構(gòu)成的含水溶液，以產(chǎn)生水/油/水雙面乳劑。因為在此情況下油相比任一水相更密集，所以重力使雙面乳化的小滴降低成較緊密地接近成像物鏡。使用共聚焦顯微鏡在逐漸較深(從左到右)的焦平面(以3μm間隔)處獲取圖像。除了提供可引起改進(jìn)成像的更好地分離小滴的優(yōu)點之外，這些結(jié)果還證明雙面乳劑可有助于通過修改小滴的密度來最小化折射率失配的影響。

雖然本文中已示出和描述了本發(fā)明的優(yōu)選方面，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員將清楚，僅作為實例而提供此類方面。在不脫離本發(fā)明的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員現(xiàn)在將想到眾多變化、改變和取代。應(yīng)理解，可在實踐本發(fā)明的過程中采用對本文中所描述的本發(fā)明的各方面的各種替代方案。期望所附權(quán)利要求書界定本發(fā)明的范圍且由此涵蓋在這些權(quán)利要求書及其等效者的范圍內(nèi)的方法和結(jié)構(gòu)。