一種香豆素二聚體及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種香豆素二聚體及其制備方法和應(yīng)用。 (二)
【背景技術(shù)】
[0002] 蠟梅在我國已有1000多年的栽培歷史，作為一種香花植物，其葉和花具有揮發(fā)性 的芳香油，香氣怡人，常作為花卉盆景和鮮切花來觀賞，因此是我國著名觀賞植物之一。作 為觀賞植物，蠟梅不僅可以在公園、花地等地方孤植或者叢植，也可以栽培在建筑物前、草 坪中或者道路兩旁，還可作為盆景，栽培于室內(nèi)。
[0003] 蠟梅屬植物除了觀賞價值外還具有藥用價值?！顿F陽民間藥草》中記載，顯示蠟梅 花可沖泡為茶，作為一種治療咳嗽的藥茶，因此蠟梅也是一種中藥材，廣泛被人們利用，在 蘇南民間就是用蠟梅花來治療感冒咳嗽。蠟梅不僅可治療感冒咳嗽，還可以治療因風(fēng)寒引 起的腹痛、腹脹、消化不良，也可以治療傷食引起的胃炎、胃痛、泛酸。
[0004] 柳葉蠟梅(學(xué)名：Chimonanthus salicifolius S.Y.Hu)又名山蠟梅、亮葉蠟梅、毛 山茶、巖馬桑、香風(fēng)茶、石涼茶等，為蠟梅科蠟梅屬常綠灌木，是中國特有的屬、種，主要產(chǎn)于 安徽、江西、浙江。柳葉蠟梅也被應(yīng)用于醫(yī)藥研究，表明其具有抗病毒、止咳化痰、抗菌等療 效。其提取物對人宮頸癌ffiLA和人胃癌SGC-7901的生長有抑制作用。柳葉蠟梅葉具有濃郁 的香味，其精油成分不僅有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳、祛痰作用，還能抑制食欲，明顯減緩小鼠體重增長， 起到減肥作用。該藥使用歷史悠久、療效確切、副作用較少，是值得研究開發(fā)的藥茶多用品 種。經(jīng)國家有關(guān)科研單位測定，柳葉蠟梅含揮發(fā)油、槲皮素、堿、黃酮類等多種有效性成分， 鐵、鈣、鋅、鎂、硒等微量元素及維生素B1、維生素B2、維生素C等含量豐富，并含18種氨基酸。
[0005] 本發(fā)明以柳葉蠟梅枝干等器官為研究對象，進(jìn)行提取、分離、純化、結(jié)構(gòu)鑒定得到 7-羥基_6,8_二甲氧基甲氧基-7C香豆素酯），屬于香豆素的二聚體類化合物，該化 合物具有明顯的抗腫瘤活性。 (三)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明旨在提供一種香豆素二聚體7-羥基-6，8-二甲氧基- 3-(6'-甲氧基-香 豆素酯)及其制備方法和應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案為：
[0008] -種式（I)所示的香豆素二聚體：

[0010] -種式(I)所示的香豆素二聚體的制備方法，所述的制備方法按如下步驟進(jìn)行：
[0011] (1)將柳葉蠟梅的枝干進(jìn)行粉碎干燥后，用乙醇浸提提取，之后過濾除去不溶物， 取濾液減壓濃縮得到乙醇浸膏；
[0012] (2)將步驟（1)所得乙醇浸膏分散于水中，得到懸浮液，所得懸浮液先用石油醚萃 取，之后石油醚萃余液(水相)再用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯萃取液，將所得乙酸乙酯萃 取液進(jìn)行減壓濃縮，得到乙酸乙酯浸膏；
[0013] (3)用200~300目柱層析硅膠對步驟(2)所得乙酸乙酯浸膏進(jìn)行柱層析分離，以石 油醚/乙酸乙酯體積比為7 :1~1:7的混合液為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，收集含目標(biāo)化合物的 洗脫液，減壓濃縮后合并得粗品；
[0014] (4)對步驟(3)所得粗品進(jìn)行凝膠柱層析分離，以甲醇/氯仿體積比1:0.5~2的混 合液為洗脫劑，收集含目標(biāo)化合物的洗脫液，減壓蒸除溶劑得到所述的香豆素二聚體。
[0015] 本發(fā)明所述的制備方法，步驟(1)中，推薦用于浸提提取的乙醇為體積分?jǐn)?shù)95%的 乙醇;所述乙醇浸提提取的具體操作方法為:將粉碎干燥后的柳葉蠟梅枝干與乙醇以料液 質(zhì)量比1:0.8~1混合，常溫(20~30°C)浸提5~10天，過濾得到乙醇浸提提取液，重復(fù)浸提2 ~4次，合并每次所得乙醇浸提提取液，50°C減壓旋蒸回收乙醇，得到乙醇浸膏（粘稠狀，無 醇味）。
[0016] 步驟(2)中，將所述乙醇浸膏分散于水中時，推薦所述乙醇浸膏與水的質(zhì)量比為1: 2~4;所述懸浮液用石油醚進(jìn)行萃取時，推薦所述懸浮液用等體積的石油醚萃取3次，石油 醚萃取之后的萃余液(即下層水相)繼續(xù)用等體積的乙酸乙酯萃取3次。
[0017]步驟(3)中，用200~300目柱層析硅膠對乙酸乙酯浸膏進(jìn)行柱層析分離時，所述梯 度洗脫的具體操作方法為：以石油醚/乙酸乙酯體積比分別為7:1、5:1、3.5:1、2:1、1:1、1: 2、1: 3.5、1:5、1:7的混合液為洗脫劑，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫劑的流速為4~1 OmL/min (優(yōu)選 6mL/min)，每種不同比例洗脫劑的洗脫時間為200min~500min，收集含目標(biāo)化合物的洗脫 液，減壓濃縮后合并得粗品。
[0018]步驟(4)中，推薦采用Sephadex LH-60進(jìn)行凝膠柱層析分離，所述分離的方法具體 為：以甲醇/氯仿體積比1:0.5~2的混合液為洗脫劑，洗脫劑的流速為0.5~2mL/min(優(yōu)選 0.8mL/min)，洗脫時間為100~400min，收集含目標(biāo)化合物的洗脫液，減壓蒸除溶劑得到所 述的香豆素二聚體。
[0019]本發(fā)明中，所述的目標(biāo)化合物(香豆素二聚體)進(jìn)行薄層層析(TLC)時，通常以乙酸 乙酯：甲醇= 1:1為展開劑，其Rf值為0.4。所述的制備方法步驟(3)或步驟(4)中，可通過TLC 檢測收集含目標(biāo)化合物的洗脫液。
[0020] 本發(fā)明所述的香豆素二聚體在制備抗腫瘤藥物中具有應(yīng)用前景。實驗證明，本發(fā) 明香豆素二聚體對腫瘤細(xì)胞Hela、HL-60有較好的抑制作用，IC 5Q(yM)分別為18.3±0.3、 23.1 ±0.3，對PC-3的抗腫瘤活性較弱，IC5Q(yM)為76.1 ±0.6。由此可知，該化合物是潛在的 抗腫瘤藥物。
[0021] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0022] 本發(fā)明所述香豆素二聚體的提取、分離、純化方法簡單，化學(xué)結(jié)構(gòu)經(jīng)各種波譜學(xué)數(shù) 據(jù)得到確認(rèn)，不存在異構(gòu)體，抗腫瘤活性明確，具有潛在的工業(yè)化制備和開發(fā)為抗腫瘤藥物 的價值。 (四）【具體實施方式】
[0023]下面通過具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限 于此。
[0024]實施例1:香豆素的二聚體的制備
[0025]提取:將柳葉蠟梅的枝干進(jìn)行粉碎干燥，得到干燥的柳葉蠟梅粉末879g，用1.2L 95 %乙醇常溫浸提一周，過濾得到浸提液，重復(fù)浸提3次，合并每次所得浸提液，減壓蒸餾回 收乙醇，得到乙醇浸膏765g，將所得乙醇浸膏分散于3000mL水中，得到懸浮液，所得懸浮液 先用等體積的石油醚萃取3次，之后石油醚萃余液（即下層水相)再用等體積的乙酸乙酯萃 取3次，合并得到乙酸乙酯萃取液，將所得乙酸乙酯萃取液進(jìn)行減壓濃縮，得到乙酸乙酯浸 膏336g;
[0026]分離：用200~300目柱層析硅膠（500g)對乙酸乙酯浸膏進(jìn)行柱層析分離，以石油 醚/乙酸乙酯體積比分別為7:1、5:1、3.5:1、2:1、1:1、1: 2、1:3.5、1: 5、1:7的混合液為洗脫 劑，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫劑的流速為6ml/min，每種不同比例洗脫劑的洗脫時間為350min，收 集含目標(biāo)化合物的洗脫液，減壓濃縮得到粗品30.7g。
[0027] 提純:所得粗品通過Sephadex LH-60柱層析進(jìn)行分離，以甲醇：氯仿體積比1:1的 混合液進(jìn)行洗脫，流速為0.8ml/min，洗脫時間為300min，收集含目標(biāo)化合物的洗脫液，減壓 濃縮得到香豆素的二聚體22.5mg。
[0028]實施例2:香豆素的二聚體的制備
[0029]提取:將柳葉蠟梅的枝干進(jìn)行粉碎干燥，得到干燥的柳葉蠟梅粉末859g，用0.9L 95 %乙醇常溫浸提一周，過濾得到浸提液，重復(fù)浸提3次，合并每次所得浸提液，減壓蒸餾回 收乙醇，得到乙醇浸膏648g，將所得乙醇浸膏分散于2500mL水中，得到懸浮液，所得懸浮液 先用等體積的石油醚萃取3次，之后石油醚萃余液（即下層水相)再用等體積的乙酸乙酯萃 取3次，合并得到乙酸乙酯萃取液，將所得乙酸乙酯萃取液進(jìn)行減壓濃縮，得到乙酸乙酯浸 膏296g;
[0030]分離：用200~300目柱層析硅膠（500g)對乙酸乙酯浸膏進(jìn)行柱層析分離，以石油 醚/乙酸乙酯體積比分別為7:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1 :5、1:7的混合液為洗脫劑，進(jìn)行梯度洗 脫，洗脫劑的流速為7ml/min，每種不同比例洗脫劑的洗脫時間為300min，收集含目標(biāo)化合 物的洗脫液，減壓濃縮得到粗品28.6g。
[0031 ] 提純:所得粗品通過Sephadex LH-60柱層析進(jìn)行分離，以甲醇：氯仿體積比1:2的 混合液進(jìn)行洗脫，流速為0.6ml/min，洗脫時間為400min，收集含目標(biāo)化合物的洗脫液，減壓 濃縮得到香豆素的二聚體18.7mg。
[0032]實施例3:香豆素的二聚體的制備
[0033]提取:將柳葉蠟梅的枝干進(jìn)行粉碎干燥，得到干燥的柳葉蠟梅粉末867g，用1.0L 95 %乙醇常溫浸提一周，過濾得到浸提液，重復(fù)浸提3次，合并每次所得浸提液，減壓蒸餾回 收乙醇，得到乙醇浸膏699g，將所得乙醇浸膏分散于3000mL水中，得到懸浮液，所得懸浮液 先用等體積的石油醚萃取3次，之后石油醚萃余液（即下層水相)再用等體積的乙酸乙酯萃 取3次，合并得到乙酸乙酯萃取液，將所得乙酸乙酯萃取液進(jìn)行減壓濃縮，得到乙酸乙酯浸 膏273g;
[0034]分離：用200~300目柱層析硅膠(400g)對乙酸乙酯浸膏進(jìn)行柱層析分離，以石油 醚/乙酸乙酯體積比分別為7:1、5:1、3:1、1:1、1:3、1 :5、1:7的混合液為洗脫劑，進(jìn)行梯度洗 脫，洗脫劑的流速為5ml/min，每種不同比例洗脫劑的洗脫時間為400min，收集含目標(biāo)化合 物的洗脫液，減壓濃縮得到粗品19.7g。
[0035] 提純:所得粗品通過Sephadex LH-60柱層析進(jìn)行分離，以甲醇：氯仿體積比2:1的 混合液進(jìn)行洗脫，流速為0.9ml/min，洗脫時間為200min，收集含目標(biāo)化合物的洗脫液，減壓 濃縮得到香豆素的二聚體14.5mg。
[0036]實施例4:化合物測試 [0037]表1:實驗所用儀器

[0039]試劑:溶劑均為分析純試劑，未進(jìn)行處理。
[0040]對實施例1，實施例2或?qū)嵤├?制得的對稱的香豆素二聚體化合物進(jìn)行化合物測 試:1114.15〇-151°(：，￡51-]/^111/2:413[]/1+11] +，冊-￡51-]/^111/2:411.0726[021111609-11]-，計算 值為411.0722，可確定其分子式為C 21H16〇9，分子量為412。
[0041 ] 表2:香豆素二聚體化合物的NMR數(shù)據(jù)(DMS0)


[0044] 實施例5:抗腫瘤活性測試
[0045] 對實施例1~3制得的香豆素的二聚體化合物進(jìn)行了體外抗腫瘤活性測試。
[0046] 方法:用MTT法測定制得的香豆素二聚體對腫瘤細(xì)胞(He la，PC-3，HL-60)生長的影 響。用含有10%新生牛血清的DEME高糖型完全培養(yǎng)基，在37°C的C02孵育箱中培養(yǎng)3種腫瘤 細(xì)胞，待腫瘤細(xì)胞迅速生長時，將其配制成細(xì)胞懸浮液，細(xì)胞密度為1 X 105個/mL，以每孔 100此移接于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于37°C的⑶2孵育箱中培養(yǎng)24h。然后依次加入3個不同濃 度受試化合物，各l〇〇yL，以不同濃度的順鉑作為陽性對照組，受試化合物及順鉑的濃度設(shè) 定為:200、100、50、25、12.5yM，每個濃度設(shè)5個復(fù)孔，空白對照組加100yL DEME完全培養(yǎng)基， 再放置于37 °C的⑶2孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)。72小時以后每孔中加入5mg/mL MTT 20yL，繼續(xù)培 養(yǎng)4h。吸去上清液，每孔加入200yL DMS0，震蕩搖勻10min，使甲瓚完全溶解，用酶標(biāo)儀測定 490nm處的每孔內(nèi)溶液的0D值。重復(fù)3次試驗。藥物抑制率=(1-實驗組0D值/對照組0D值）X 100%，從而計算IC 5〇值。
[0047]結(jié)果:實施例制得的香豆素二聚體對腫瘤細(xì)胞Hela、HL_60有較好的抑制作用，IC50 (虛)分別為18.3±0.3、23.1±0.3;對卩(：-3的抗腫瘤活性較弱，1(：5()(虛)為76.1±0.6。這提 示該化合物可能是潛在的抗腫瘤藥物(如表3所示）。
[0048]表3:制得的香豆素的二聚體體外抗腫瘤活性


【主權(quán)項】
1. 一種式(I)所示的香豆素二聚體：2. -種式（I)所示的香豆素二聚體的制備方法，其特征在于，所述的制備方法按如下步 驟進(jìn)行： (1) 將柳葉蠟梅的枝干進(jìn)行粉碎干燥后，用乙醇浸提提取，之后過濾除去不溶物，取濾 液減壓濃縮得到乙醇浸膏； (2) 將步驟（1)所得乙醇浸膏分散于水中，得到懸浮液，所得懸浮液先用石油醚萃取，之 后石油醚萃余液再用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯萃取液，將所得乙酸乙酯萃取液進(jìn)行減 壓濃縮，得到乙酸乙酯浸膏； (3) 用200~300目柱層析硅膠對步驟（2)所得乙酸乙酯浸膏進(jìn)行柱層析分離，以石油 醚/乙酸乙酯體積比為7:1~1:7的混合液為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，收集含目標(biāo)化合物的洗 脫液，減壓濃縮后合并得粗品； (4) 對步驟(3)所得粗品進(jìn)行凝膠柱層析分離，以甲醇/氯仿體積比1:0.5~2的混合液 為洗脫劑，收集含目標(biāo)化合物的洗脫液，減壓蒸除溶劑得到所述的香豆素二聚體。3. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟（1)中，用于浸提提取的乙醇為體積 分?jǐn)?shù)95 %的乙醇。4. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟（1)中，所述乙醇浸提提取的具體操 作方法為:將粉碎干燥后的柳葉蠟梅枝干與乙醇以料液質(zhì)量比1:0.8~1混合，常溫浸提5~ 10天，過濾得到乙醇浸提提取液，重復(fù)浸提2~4次，合并每次所得乙醇浸提提取液，50°C減 壓旋蒸回收乙醇，得到乙醇浸膏。5. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述乙醇浸膏與水的質(zhì)量比 為1:2~4〇6. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述懸浮液用等體積的石油 醚萃取3次，石油醚萃取之后的萃余液繼續(xù)用等體積的乙酸乙酯萃取3次。7. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，所述梯度洗脫的具體操作方 法為：以石油醚/乙酸乙酯體積比分別為7 :1、5:1、3.5:1、2:1、1:1、1 :2、1:3.5、1:5、1:7的混 合液為洗脫劑，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫劑的流速為4~10mL/min，每種不同比例洗脫劑的洗脫 時間為200min~500min，收集含目標(biāo)化合物的洗脫液，減壓濃縮后合并得粗品。8. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟(4)中，采用Sephadex LH-60進(jìn)行凝 膠柱層析分離，所述分離的方法具體為：以甲醇/氯仿體積比1:0.5~2的混合液為洗脫劑， 洗脫劑的流速為0.5~2mL/min，洗脫時間為100~400min，收集含目標(biāo)化合物的洗脫液，減 壓蒸除溶劑得到所述的香豆素二聚體。9. 如權(quán)利要求1所述的香豆素二聚體在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種式(I)所示的香豆素二聚體及其制備方法，本發(fā)明所述香豆素二聚體的提取、分離、純化方法簡單，化學(xué)結(jié)構(gòu)經(jīng)各種波譜學(xué)數(shù)據(jù)得到確認(rèn)，不存在異構(gòu)體，抗腫瘤活性明確，具有潛在的工業(yè)化制備和開發(fā)為抗腫瘤藥物的價值；
【IPC分類】C07D311/16, A61P35/00, A61K31/37
【公開號】CN105712963
【申請?zhí)枴緾N201610046373
【發(fā)明人】王奎武, 李丹
【申請人】浙江工商大學(xué)