一種食蟹猴微衛(wèi)星位點(diǎn)的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及DNA分子標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種食蟹猴微衛(wèi)星位點(diǎn)的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 微衛(wèi)星標(biāo)記(microsatellite)，又稱為短串聯(lián)重復(fù)序列（sho;rt tandem repeats， STRs)或簡單重復(fù)序列（simple sequence repeats),是均勻分布于真核生物基因組中的簡 單重復(fù)序列，由2~6個(gè)核巧酸的串聯(lián)重復(fù)片段構(gòu)成，由于重復(fù)單位的重復(fù)次數(shù)在個(gè)體間呈 高度變異性并且數(shù)量豐富，因此微衛(wèi)星標(biāo)記的應(yīng)用非常廣泛。微衛(wèi)星位點(diǎn)通常通過PCR擴(kuò) 增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過電泳分析并根據(jù)大小分離等位基因進(jìn)行檢測。
[0003] 微衛(wèi)星標(biāo)記的不穩(wěn)定性是指微衛(wèi)星標(biāo)記的片段大小或位置發(fā)生變化，通常是由于 堿基錯(cuò)配所造成的，原因可能與多種因素有關(guān)，其中，基因突變是主要原因之一。而引起基 因突變的原因非常復(fù)雜，其中，放射線、環(huán)境污染、有毒物質(zhì)都是常見原因。研究基因突變的 發(fā)生機(jī)制，對于環(huán)境污染檢測，疾病診斷，預(yù)防和治療等，都具有重大意義。
[0004] 食蟹猴生命周期長，生物學(xué)特性與人類極其相似，是研究人類慢性疾病的最佳實(shí) 驗(yàn)材料，在藥理和毒理學(xué)研究中，用其建立的疾病動(dòng)物模型有利于觀察疾病及其并發(fā)癥的 發(fā)生發(fā)展規(guī)律。同時(shí)為治療藥物的療效檢驗(yàn)和安全性評估提供可靠的保證，已逐漸成為科 學(xué)研究和藥物研究中使用較多的一種靈長類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。然而，在現(xiàn)有研究中，還缺乏關(guān)于食 蟹猴微衛(wèi)星位點(diǎn)在藥理和毒理學(xué)研究中的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種食蟹猴微衛(wèi)星位點(diǎn)的應(yīng)用前景，將為藥物毒理學(xué)、藥 理學(xué)、致癌試驗(yàn)、生殖和遺傳毒理的研究提供新思路。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種食蟹猴微衛(wèi)星位點(diǎn)的應(yīng)用，其包括W各編 號對應(yīng)的食蟹猴微衛(wèi)星位點(diǎn)或各編號對應(yīng)的食蟹猴微衛(wèi)星位點(diǎn)的結(jié)合為祀點(diǎn)或依據(jù)，對食 蟹猴所進(jìn)行的毒理實(shí)驗(yàn)、生殖毒理實(shí)驗(yàn)、遺傳毒理實(shí)驗(yàn)、致癌實(shí)驗(yàn)；
[0007] 所述各編號為 XSZK611、XSZK950、XSZK841。
[000引與W往報(bào)道現(xiàn)相比，本發(fā)明的有益效果是初步證明了微衛(wèi)星位點(diǎn)在毒理學(xué)中的變 化，并且發(fā)現(xiàn)了=個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)可能具有重要關(guān)系，為微衛(wèi)星技術(shù)在生物醫(yī)藥，特別是藥物 毒理中的應(yīng)用提供了有力的證據(jù)。
【附圖說明】 圖1為本發(fā)明的給藥組食蟹猴中，服藥前，編號為XSZK611的食蟹猴微衛(wèi)星位點(diǎn)PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物電泳譜； 圖2為本發(fā)明的給藥組食蟹猴中，服藥30后，編號為XSZK611的食蟹猴微衛(wèi)星位點(diǎn)PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物電泳譜； 圖3為本發(fā)明的給藥組食蟹猴中，服藥3個(gè)月后，編號為XSZK611的食蟹猴微衛(wèi)星位點(diǎn) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳譜。
【具體實(shí)施方式】
[0009] 運(yùn)些實(shí)施方式并非對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)運(yùn)些實(shí)施方式所作 的功能、方法、或者結(jié)構(gòu)上的等效變換或替代，與本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)無關(guān)。
[0010] 本發(fā)明提供一種食蟹猴微衛(wèi)星位點(diǎn)的應(yīng)用，包括W各編號對應(yīng)的食蟹猴微衛(wèi)星位 點(diǎn)或各編號對應(yīng)的食蟹猴微衛(wèi)星位點(diǎn)的結(jié)合為祀點(diǎn)或依據(jù)，對食蟹猴所進(jìn)行的毒理實(shí)驗(yàn)、 生殖毒理實(shí)驗(yàn)、遺傳毒理實(shí)驗(yàn)、致癌實(shí)驗(yàn)；
[0011] 所述各編號為 XSZK611、XSZK950、XSZK841。
[0012] 現(xiàn)針對各編號XSZK611、XSZK950、XSZK841對應(yīng)的位點(diǎn)的篩選方法進(jìn)行介紹。所述 篩選方法主要包括動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和PCR擴(kuò)增。
[001引 1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
[0014] 健康食蟹猴50只，均為雄性，體重3-4KG，空白對照組40只，給藥組10只。給藥組口 服25 %阿維菌素螺蛾醋懸浮劑，1.5克/KG(半數(shù)致死量為2.5克/KG)體重，每日一次，共屯 天，空白對照組W相應(yīng)等體積溶媒(生理鹽水）。分別于給藥前和給藥后一周、兩周、30天和 S個(gè)月，抽取外周靜脈血，其余40只為空白對照組，取血時(shí)間同給藥組。動(dòng)物抗凝血分離 DNA化asyPure Genomic DNA Kit,hansgen company)，-80°C凍存?zhèn)溆?。給藥期內(nèi)，給藥組 動(dòng)物出現(xiàn)飲食量下降和體重輕度減輕，停藥一周后完全改善，未發(fā)現(xiàn)動(dòng)物中毒死亡現(xiàn)象?？?白對照組各種生命體征均無變化。
[00巧]2. PCR擴(kuò)增
[0016]設(shè)及的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：2xSG Green qPCR Mix(北京信諾金達(dá)生物科技有限 公司）12. ，primer F&R各0. ，DNA模板化L，d地20 6. ，總反應(yīng)體積25化。
[0017]擴(kuò)增條件為：95°。2111111，94°。153-55°(：~58°(：之間（根據(jù)不同引物時(shí)1設(shè)定）又6〇3-72°Cx30s，循環(huán)40次，最后一個(gè)循環(huán)后置72°C繼續(xù)延伸Imin。后接melting curve初步判斷 擴(kuò)增情況。
[0018] 基于上述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行4%瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為 80v，2小時(shí)，電泳結(jié)束后凝膠EB染色，用紫外凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行凝膠成像，并對其圖帶進(jìn)行 相關(guān)分析。
[0019] 根據(jù)參考文獻(xiàn)和GE肥BANK檢索，在36個(gè)引物中，經(jīng)過PCR篩選，瓊脂糖凝膠電泳，對 擴(kuò)增條帶分析，W篩選條件如下：
[0020] A.空白對照組中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)不穩(wěn)定條帶比率> 25 % (10/40)，認(rèn)為與口服藥 物無關(guān)，該位點(diǎn)淘汰。
[0021] B.給藥組中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)不穩(wěn)定條帶比率< 30% (3/10)，認(rèn)為與對照組無顯 著性差異，該位點(diǎn)淘汰。
[0022] 3.結(jié)果
[0023] 經(jīng)過上述A、B條件篩選后，獲得在空白對照組中出現(xiàn)不穩(wěn)定條帶比率<25%，在給 藥組中出現(xiàn)不穩(wěn)定條帶比率>30%的引物3對。引如表1所示：
[0024] 表1 口服農(nóng)藥導(dǎo)致的=個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)變化引物序列
[0025]

[0026]
[0027] 給藥后30天和=個(gè)月，均發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星位點(diǎn)擴(kuò)增條帶變化，主要表現(xiàn)為：片段減小， 增寬和雙帶出現(xiàn)。健康食蟹猴口服有毒農(nóng)藥后能夠?qū)е挛⑿l(wèi)星不穩(wěn)定性變化，提示W(wǎng)微衛(wèi) 星位點(diǎn)作為毒理學(xué)檢測指標(biāo)，為更加敏感和方便的指標(biāo)，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
[0028] 綜上所述，本發(fā)明創(chuàng)造性地提出了食蟹猴中對于藥理和毒理學(xué)的研究具有應(yīng)用價(jià) 值的=個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，其有利于藥理和毒理學(xué)的研究，為科學(xué)技術(shù)的研究提供了有力的工 具。
[00巧]本發(fā)明設(shè)及的參考文獻(xiàn)為：Atsunori Higashinol,化oki 0sada2，Yum;Lko Suto3， et al.Development of an integrative database with 499 novel microsatellite markers for Macacafascicularis.BMC Genetics 2009,10:24doi:10.1186/1471-2156-10-24。
[0030] 對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實(shí)施例的細(xì)節(jié)，而且在 不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠W其他的具體形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論 從哪一點(diǎn)來看，均應(yīng)將實(shí)施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán) 利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有 變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。不應(yīng)將權(quán)利要求中的任何附圖標(biāo)記視為限制所設(shè)及的權(quán)利要求。
[0031] 此外，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說明書按照實(shí)施方式加 W描述，但并非每個(gè)實(shí)施方式僅包 含一個(gè)獨(dú)立的技術(shù)方案，說明書的運(yùn)種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng) 將說明書作為一個(gè)整體，各實(shí)施例中的技術(shù)方案也可W經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員 可W理解的其他實(shí)施方式。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種食蟹猴微衛(wèi)星位點(diǎn)的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用包括以各編號對應(yīng)的食蟹猴 微衛(wèi)星位點(diǎn)或各編號對應(yīng)的食蟹猴微衛(wèi)星位點(diǎn)的結(jié)合為靶點(diǎn)或依據(jù)，對食蟹猴所進(jìn)行的毒 理實(shí)驗(yàn)、生殖毒理實(shí)驗(yàn)、遺傳毒理實(shí)驗(yàn)、致癌實(shí)驗(yàn)； 所述各編號為 XSZK611、XSZK950、XSZK841。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種食蟹猴微衛(wèi)星位點(diǎn)的應(yīng)用，其包括以三個(gè)食蟹猴微衛(wèi)星位點(diǎn)，編號為XSZK611、XSZK950、XSZK841，通過觀察該位點(diǎn)在藥物毒理學(xué)試驗(yàn)中的變化，提出該位點(diǎn)可能對食蟹猴的毒理實(shí)驗(yàn)、生殖毒理實(shí)驗(yàn)、遺傳毒理實(shí)驗(yàn)、致癌實(shí)驗(yàn)等具有密切關(guān)系。本發(fā)明創(chuàng)造性地提出微衛(wèi)星位點(diǎn)突變對于食蟹猴藥理和毒理學(xué)研究具有應(yīng)用價(jià)值，可能開辟藥理毒理學(xué)新的研究方向，為微衛(wèi)星位點(diǎn)技術(shù)的應(yīng)用提供了新鮮證據(jù)。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105713969
【申請?zhí)枴緾N201610120421
【發(fā)明人】張海鷹, 董文明
【申請人】蘇州西山中科實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司