本發(fā)明涉及植物學(xué)領(lǐng)域，更具體地涉及棉纖維顏色相關(guān)基因及其調(diào)控棉纖維顏色中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

棉花是世界上最主要的農(nóng)作物之一，產(chǎn)量大、生產(chǎn)成本低，使棉制品價(jià)格比較低廉。棉纖維能制成多種規(guī)格的織物，從輕盈透明的巴里紗到厚實(shí)的帆布和厚平絨，適于制作各類衣服、家具布和工業(yè)用布。棉織物堅(jiān)牢耐磨，能夠洗滌和在高溫下熨燙，棉布由于吸濕和脫濕快速而使穿著舒服，應(yīng)用廣泛。我國是世界上棉花產(chǎn)量最高的國家之一。

天然彩色棉花(簡稱“彩棉”)是一種棉纖維自身具有棕、綠等不同天然色彩的棉花的統(tǒng)稱。由于其本身帶有天然的顏色，在棉花紡織生產(chǎn)工業(yè)上，可以免去漂白、消毒、染色等過程，減輕了紡織過程的污染，成為真正意義上的綠色產(chǎn)品。天然彩色棉不但可以大大提高紡織工業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益，而且隨著科學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展和人民生活需求、環(huán)保意識(shí)、健康觀念的不斷提高，彩色棉將成為一個(gè)新興產(chǎn)業(yè)，為彩色棉育種的深入研究和產(chǎn)業(yè)化的實(shí)施創(chuàng)造良好的環(huán)境。然而，目前彩色棉纖維色素的形成機(jī)制還不清楚，通過基因工程手段來調(diào)控棉花顏色的研究還有很多不足，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)調(diào)控彩色棉纖維色素形成的新方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種棉纖維顏色相關(guān)基因及其在調(diào)控棉纖維顏色中的應(yīng)用。

在本發(fā)明的第一方面，提供了一種棉基因或其編碼蛋白的用途，其特征在于，所述的棉基因或其編碼蛋白用于選自下組的一種或多種用途：

(a)用于制備促進(jìn)棉纖維顏色變化的試劑或組合物；

(b)用于調(diào)控棉屬植物的棉纖維顏色；

(c)用作鑒別棉纖維顏色的標(biāo)志物；

(d)用于制備鑒別棉屬植物的棉纖維顏色的試劑或試劑盒；

(e)用于改良棉屬植物的棉纖維顏色性狀；

其中，所述的棉基因選自下組a：at3gt基因、ghchi基因、或其組合。

在另一優(yōu)選例中，所述的棉基因還包括選自下組b的基因：ghpal基因、ghc4h基因、ghchs基因、ghdfr基因、ghf3h基因、ghf3′h基因、ghf3'5′h基因、ghans基因、ghccr基因、gh3gt基因、ghhct基因、ghccoaomt基因、或其組合。

在另一優(yōu)選例中，所述的棉基因包括野生型和突變型。

在另一優(yōu)選例中，所述的突變型包括突變后編碼蛋白的功能未發(fā)生改變的突變形式(即功能與野生型編碼蛋白相同或基本相同)。

在另一優(yōu)選例中，所述的棉基因包括與野生型基因相比，同源性≥80％(較佳地≥90％，更佳地≥95％)的多核苷酸，只要其編碼的多肽與野生型基因所編碼的蛋白相同或基本相同。

在另一優(yōu)選例中，所述的棉屬植物為棉花。

在另一優(yōu)選例中，所述的棉基因具有調(diào)控棉纖維顏色的功能。

在另一優(yōu)選例中，所述的棉基因(即棉纖維顏色相關(guān)基因)選自下組：

(i)at3gt基因、ghchi基因、ghpal基因、ghc4h基因、ghchs基因、ghdfr基因、ghf3h基因、ghf3'h基因、ghf3'5′h基因、ghans基因、ghccr基因、gh3gt基因、ghhct基因、ghccoaomt基因、或其組合；

(ii)核苷酸序列與(i)所示的任一基因的同源性≥80％(較佳地≥90％，更佳地≥95％)的多核苷酸；和

(iii)在(i)所示的任一基因的5'端和/或3'端截短或添加1-60個(gè)(較佳地1-30，更佳地1-10個(gè))核苷酸的多核苷酸。

在另一優(yōu)選例中，所述的基因包括dna、cdna、和/或mrna。

在另一優(yōu)選例中，所述的at3gt基因的cds序列如seqidno.:1所示。

在另一優(yōu)選例中，所述的at3gt基因的編碼蛋白如seqidno.:2所示。

在另一優(yōu)選例中，所述的at3gt基因的基因組序列如seqidno.:3所示。

在另一優(yōu)選例中，所述的ghchi基因包括ghchi-1基因和ghchi-2基因。

在另一優(yōu)選例中，所述的ghchi-1基因的cds序列如seqidno.:4所示。

在另一優(yōu)選例中，所述的ghchi-1基因的編碼蛋白如seqidno.:5所示。

在另一優(yōu)選例中，所述的ghchi-2基因的cds序列如seqidno.:6所示。

在另一優(yōu)選例中，所述的ghchi-2基因的編碼蛋白如seqidno.:7所示。

在另一優(yōu)選例中，所述的棉纖維為棉屬(gossypium)植物的種籽纖維。

在另一優(yōu)選例中，所述的棉纖維顏色包括綠色、棕色、或白色。

在另一優(yōu)選例中，所述的調(diào)控棉纖維顏色包括調(diào)控棉纖維顏色為綠色、棕色、和/或白色。

在另一優(yōu)選例中，所述的調(diào)控棉纖維顏色包括調(diào)控棉纖維色素的形成。

在本發(fā)明的第二方面，提供了一種改良棉屬植物性狀的方法，其特征在于，包括步驟：

(a)將外源的構(gòu)建物導(dǎo)入植物細(xì)胞，其中所述的構(gòu)建物含有外源的棉基因序列、促進(jìn)棉基因表達(dá)的外源核苷酸序列、或抑制棉基因表達(dá)的外源核苷酸序列，從而獲得導(dǎo)入外源構(gòu)建物的植物細(xì)胞；

(b)將上一步驟獲得的所述導(dǎo)入外源構(gòu)建物的植物細(xì)胞，再生成植株：和

(c)任選地對(duì)所述再生的植株進(jìn)行性狀鑒定，從而獲得性狀改良的植物，

其中，所述植物性狀包括棉纖維的顏色性狀，

并且所述的棉基因選自下組a：at3gt基因、ghchi基因、或其組合。

在另一優(yōu)選例中，所述的棉基因還包括選自下組b的基因：ghpal基因、ghc4h基因、ghchs基因、ghdfr基因、ghf3h基因、ghf3′h基因、ghf3'5′h基因、ghans基因、ghccr基因、gh3gt基因、ghhct基因、ghccoaomt基因、或其組合。

在另一優(yōu)選例中，所述的外源核苷酸序列包括干擾所述棉基因表達(dá)的核苷酸序列。

在另一優(yōu)選例中，所述的外源核苷酸序列包括irna干擾序列。

在另一優(yōu)選例中，所述性狀改良包括改良棉纖維的顏色。

在另一優(yōu)選例中，所述性狀改良包括改良棉纖維顏色為綠色、棕色。

在另一優(yōu)選例中，所述外源的棉基因序列還包含與orf序列操作性連接的啟動(dòng)子。

在另一優(yōu)選例中，所述的啟動(dòng)子選自下組：組成型啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、或者強(qiáng)啟動(dòng)子。

在本發(fā)明的第三方面，提供了一種促進(jìn)棉屬植物的棉纖維的綠色性狀的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：在所述棉屬植物中，促進(jìn)at3gt基因的表達(dá)或促進(jìn)at3gt蛋白的活性。

在另一優(yōu)選例中，所述的棉屬植物包括棕色棉和白色棉。

在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)為棉纖維組織中的表達(dá)。

在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)為棉纖維組織發(fā)育期的表達(dá)。

在另一優(yōu)選例中，所述的棉纖維組織發(fā)育期的表達(dá)為棉纖維發(fā)育第1-30天，較佳地1-20天，更佳地1-15天的表達(dá)。

在另一優(yōu)選例中，所述方法包括給予植物at3gt基因或其編碼的多肽的促進(jìn)劑。

在另一優(yōu)選例中，當(dāng)棉屬植物為棕色棉時(shí)，所述方法還包括步驟：抑制ghchi基因的表達(dá)。

在另一優(yōu)選例中，當(dāng)棉屬植物為白色棉時(shí)，所述方法還包括步驟：促進(jìn)ghchi基因的表達(dá)。

在另一優(yōu)選例中，所述方法包括向植物中導(dǎo)入外源的at3gt基因、或ghchi基因。

在另一優(yōu)選例中，所述方法包括步驟：

(i)提供一植物或植物細(xì)胞；和

(ii)將at3gt基因序列導(dǎo)入所述植物或植物細(xì)胞，從而獲得轉(zhuǎn)基因的植物或植物細(xì)胞。

在另一優(yōu)選例中，所述方法包括步驟：

(a)提供攜帶at3gt基因序列的表達(dá)載體的農(nóng)桿菌；

(b)將植物細(xì)胞或組織或器官與步驟(a)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使at3gt的基因序列轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，并且整合到植物細(xì)胞的染色體上；

(c)選擇已轉(zhuǎn)入at3gt基因序列的植物細(xì)胞或組織或器官；和

(d)將步驟(c)中的植物細(xì)胞或組織或器官再生為植株。

在本發(fā)明的第四方面，提供了一種改變棉屬植物的棉纖維顏色變化的方法，所述顏色變化為從棕色變?yōu)榫G色，其特征在于，所述方法包括以下步驟：在所述棉屬植物中，抑制ghchi基因的表達(dá)或抑制ghchi蛋白的活性。

在另一優(yōu)選例中，所述方法包括給予棕色棉ghchi基因或其編碼的多肽的拮抗劑。

在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)為棉纖維組織中的表達(dá)。

在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)為棉纖維組織發(fā)育期的表達(dá)。

在另一優(yōu)選例中，所述的棉纖維組織發(fā)育期的表達(dá)為棉纖維發(fā)育第1-30天，較佳地1-20天，更佳地1-15天的表達(dá)。

在另一優(yōu)選例中，所述的拮抗劑包括小分子化合物、irna、sirna、shrna、或其組合。

在本發(fā)明的第五方面，提供了一種棉基因或其編碼蛋白的調(diào)控劑的用途，其特征在于，用于調(diào)控棉屬植物的棉纖維顏色變化，或用于制備調(diào)控棉纖維顏色變化的制劑或組合物。

在另一優(yōu)選例中，所述的調(diào)控劑包括促進(jìn)劑、抑制劑。

在另一優(yōu)選例中，所述的組合物包括農(nóng)用組合物。

在另一優(yōu)選例中，所述的顏色變化包括從棕色變?yōu)榫G色、從白色變?yōu)榫G色、從綠色變?yōu)樽厣?/p>

在另一優(yōu)選例中，所述的調(diào)控包括促進(jìn)所述顏色變化或抑制(減緩)所述顏色變化。

在另一優(yōu)選例中，所述的調(diào)控劑包括小分子化合物、或核酸類物質(zhì)。

在另一優(yōu)選例中，所述的核酸類物質(zhì)選自下組：mirna、shrna、sirna、或其組合。

在本發(fā)明的第六方面，提供了一種分離的棉纖維顏色相關(guān)多肽，其特征在于，所述的多肽具有調(diào)控棉纖維顏色的功能，并且，所述的多肽選自下組：

(i)本發(fā)明所述的棉纖維顏色相關(guān)多肽；

(ii)將(i)所示的任一多肽經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，控制棉纖維顏色功能的多肽；

(iii)氨基酸序列與(i)所示的任一多肽的同源性≥95％(較佳地≥98％，更佳地≥99％)，具有控制棉纖維顏色功能的多肽。

在另一優(yōu)選例中，所述的多肽包括：具有seqidno.:2、seqidno.:5、seqidno.:7所示氨基酸序列的多肽。

在本發(fā)明的第七方面，提供了一種編碼所述棉纖維顏色相關(guān)多肽的基因(即棉纖維顏色相關(guān)基因)。

在本發(fā)明的第八方面，提供了一種載體，其特征在于，所述載體含有本發(fā)明的第七方面所述的基因。

在本發(fā)明的第九方面，提供了一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞含有本發(fā)明的第八方面所述的載體或基因組中整合有本發(fā)明的第七方面所述的基因。

在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞選自下組：植物細(xì)胞、原核細(xì)胞。

在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞包括錦葵科植物細(xì)胞。

在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞包括棉屬植物細(xì)胞。

在本發(fā)明的第十方面，提供了一種制備本發(fā)明的第六方面所述多肽的方法，其特征在于，所述方法包含：

(a)在適合表達(dá)的條件下，培養(yǎng)本發(fā)明的第九方面所述的宿主細(xì)胞；和

(b)從培養(yǎng)物中分離出本發(fā)明的第六方面所述的多肽。

應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附圖說明

圖1顯示了白色棉、綠色棉和棕色棉的棉纖維實(shí)物圖。

圖2a顯示了白色棉和棕色棉的發(fā)育第0天、第12天棉纖維樣品與基因表達(dá)的熱圖(b代表棕色纖維brown，w代表白色纖維white，g代表綠色纖維green)。

圖2b顯示了白色棉和棕色棉的發(fā)育第0天、第12天棉纖維基因的差異表達(dá)分析(紅色點(diǎn)表示差異表達(dá)的基因)。

圖2c顯示了白色棉、綠色棉和棕色棉的發(fā)育第0天、第12天棉纖維的轉(zhuǎn)錄譜分析出的苯丙氨酸代謝中的類黃酮生物合成途徑差異表達(dá)基因。

圖2d顯示了白色棉和棕色棉在纖維發(fā)育12天時(shí)的基因差異共表達(dá)分析結(jié)果，其中顯示了苯丙氨酸途徑中基因集群。

圖2e顯示了白色棉和綠色棉在纖維發(fā)育12天時(shí)的基因差異共表達(dá)分析結(jié)果，其中顯示了苯丙氨酸途徑中基因的集群。

圖3a顯示了棕色棉纖維中chi-1和chi-2基因的表達(dá)情況。

圖3b顯示了棕色棉纖維中chi-1和chi-2核苷酸與rnai序列比對(duì)結(jié)果。

圖3c顯示了遺傳轉(zhuǎn)化棕色棉得到的4個(gè)t1代轉(zhuǎn)化子。

圖3d顯示了1#植株的nptii基因和hpt基因的鑒定結(jié)果。

圖3e顯示了1#植株的southernblot鑒定結(jié)果。

圖3f顯示了1#植株后代的棉纖維顏色情況。

圖3g顯示了t1代轉(zhuǎn)化子顏色表現(xiàn)仍為棕色的組1(t2-5#)和表現(xiàn)為白色的組2(t2-24#)和表現(xiàn)為深綠色的(t2-6#)植株的ghchi-1和ghchi-2的表達(dá)水平變化。

圖3h顯示了panda-chi-1載體的結(jié)構(gòu)圖。

圖4顯示了1#、2#和3#植株后代的棉纖維顏色情況。

圖4a顯示了2#植株的后代的棉纖維顏色情況。

圖4b顯示了3#植株的后代的棉纖維顏色情況。

圖4c顯示了4#植株的后代的棉纖維顏色情況。

圖5顯示了彩色棉和白色棉纖維質(zhì)量分析結(jié)果。

圖5a顯示了彩色棉(新彩棉1號(hào)-7號(hào)與白色棉新陸中18號(hào))的纖維長度，強(qiáng)度和馬克隆值的比較分析結(jié)果。

圖5b顯示了淺棕色(b3)和深棕色(b4)的纖維質(zhì)量分析結(jié)果。

圖5c顯示了淺綠色(g3)和深綠色(g4)的纖維質(zhì)量分析結(jié)果。

圖5d顯示了淺棕色(b3)和淺綠色(g3)的纖維質(zhì)量分析結(jié)果。

圖5e顯示了深棕色(b4)和深綠色(g4)的纖維質(zhì)量分析結(jié)果。

圖5f顯示了1#轉(zhuǎn)基因t2代纖維強(qiáng)度的分析結(jié)果。

圖5g顯示了1#轉(zhuǎn)基因t2代纖維馬克隆值的分析結(jié)果。

圖5h顯示了1#轉(zhuǎn)基因t2代纖維長度的分析結(jié)果。

圖6a顯示了5#、6#和24#植株的纖維顏色。

圖6b顯示了5#、6#和24#植株的類黃酮代謝途徑的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果。

圖6c顯示了通過轉(zhuǎn)擬南芥at3gt基因后，原本顏色為棕色的新彩5棉花纖維，改變?yōu)榫G色。

圖7a和圖7b顯示了構(gòu)建的過表達(dá)3gt基因的綠色植株的pcr鑒定結(jié)果以及2#，3#和4#的轉(zhuǎn)基因鑒定結(jié)果。

圖8顯示了1#轉(zhuǎn)基因t1代24株的nptii基因轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證結(jié)果和t1代5#，6#和24#的southernblot結(jié)果。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入地研究，首次意外地發(fā)現(xiàn)了與棉纖維顏色相關(guān)的多種棉基因(包括at3gt基因和ghchi基因等)，以及通過促進(jìn)或抑制所述棉基因的表達(dá)來改變棉纖維顏色的方法。以at3gt基因和ghchi基因?yàn)槔瑢?shí)驗(yàn)表明，通過增強(qiáng)at3gt基因的表達(dá)，可以調(diào)控棉纖維顏色為綠色；通過抑制棕色棉的ghchi基因的表達(dá)，可以生成綠色棉后代，在農(nóng)作物育種中具有應(yīng)用前景。此外，本發(fā)明的所述棉纖維顏色相關(guān)基因或蛋白還可用作鑒別棉纖維顏色的標(biāo)志物，用于預(yù)先或輔助性確定棉屬植物的棉纖維顏色。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。

術(shù)語

如本文所用，術(shù)語“棉基因”、“棉纖維顏色相關(guān)基因”、“本發(fā)明多核苷酸”、“本發(fā)明基因”、“編碼棉纖維顏色相關(guān)多肽的基因”可以互換使用，都是指具有調(diào)控棉纖維顏色功能的基因。較佳地，本發(fā)明基因包括表a所示的基因，尤其是at3gt基因和ghchi基因(包含或不包含其內(nèi)含子的序列)。

如本文所用，術(shù)語“棉纖維顏色相關(guān)多肽”、“本發(fā)明多肽”、“本發(fā)明蛋白”、“棉纖維相關(guān)基因編碼的多肽”可以互換使用，都是指來源于棉屬植物的、具有調(diào)控棉纖維顏色功能的多肽。較佳地，本發(fā)明多肽包括at3gt多肽(seqidno.:2)、ghchi-1多肽(seqidno.:5)、ghchi-2多肽(seqidno.:7)，或其衍生的具有相同功能的衍生多肽或活性片段。

如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。

如本文所用，術(shù)語“特異性表達(dá)”是指目的基因在植物中特定的時(shí)間和/或特定的組織的表達(dá)。

如本文所用，“外源的”或“異源的”是指不同來源的兩條或多條核酸或蛋白質(zhì)序列之間的關(guān)系。例如，如果啟動(dòng)子與目的基因序列的組合通常不是天然存在的，則啟動(dòng)子對(duì)于該目的基因來說是外源的。特定序列對(duì)于其所插入的細(xì)胞或生物體來說是“外源的”。

棉花

棉花是錦葵科棉屬植物的種子纖維，原產(chǎn)于亞熱帶。植株灌木狀，在熱帶地區(qū)栽培可長到6米高，一般為1到2米?；ǘ淙榘咨_花后不久轉(zhuǎn)成深紅色然后凋謝，留下綠色小型的蒴果，稱為棉鈴。棉鈴內(nèi)有棉籽，棉籽上的茸毛從棉籽表皮長出，塞滿棉鈴內(nèi)部。棉鈴成熟時(shí)裂開，露出柔軟的棉纖維。常見棉纖維白色至白中帶黃，長約2至4厘米，含纖維素約87～90％。棉花野生種特別是二倍體野生種纖維是棕色或者綠色,在進(jìn)化和人工馴化過程中出現(xiàn)了白色棉花。

天然彩色棉花(簡稱“彩棉”)是一種棉纖維自身具有棕、綠等不同天然色彩的棉花的統(tǒng)稱。棉纖維為綠色的即為綠色棉，棉纖維為棕色的即為棕色棉。由于彩棉本身帶有天然的顏色，在棉花紡織生產(chǎn)工業(yè)上，可以免去漂白、消毒、染色等過程，減輕了紡織過程的污染，成為真正意義上的綠色產(chǎn)品。

本發(fā)明的多核苷酸

在本發(fā)明中，相關(guān)的棉纖維顏色相關(guān)基因包括表a中所示的一種或多種基因。

表a

部分的棉纖維顏色相關(guān)基因的序列表信息如下

本發(fā)明的多核苷酸可以是dna形式或rna形式。dna形式包括cdna、基因組dna或人工合成的dna。

以at3gt為例，基因組dna可以與seqidno.:3所示的序列相同或者是簡并的變異體。本發(fā)明的dna可以是單鏈的或是雙鏈的，dna可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與seqidno.:1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有seqidno.:2的蛋白質(zhì)，但與seqidno.:1所示的編碼區(qū)序列或seqidno.:3所示的基因組序列有差別的核酸序列。對(duì)于ghchi-1或其它基因而言，依此類推。

編碼seqidno.:2的成熟多肽的多核苷酸包括：只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。

術(shù)語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。

本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。

本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個(gè)序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴(yán)格條件”是指:(1)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×ssc,0.1％sds,60℃；或(2)雜交時(shí)加有變性劑,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上,更好是95％以上時(shí)才發(fā)生雜交。并且,可雜交的多核苷酸編碼的多肽與seqidno.:2所示的成熟多肽有相同的生物學(xué)功能和活性。

本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含15個(gè)核苷酸，較好是至少30個(gè)核苷酸，更好是至少50個(gè)核苷酸，最好是至少100個(gè)核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如pcr)以確定和/或分離編碼棉纖維相關(guān)多肽的多聚核苷酸。

本發(fā)明多肽

本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。

本發(fā)明還包括棉纖維顏色相關(guān)多肽的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然棉纖維顏色相關(guān)多肽相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個(gè)或多個(gè)保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個(gè)化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。

在本發(fā)明中，術(shù)語“棉纖維顏色相關(guān)多肽”指具有棉纖維顏色相關(guān)多肽活性的seqidno.:2序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與棉纖維顏色相關(guān)多肽相同功能的、seqidno.:2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)：一個(gè)或多個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在c末端和/或n末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在c末端和/或n末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括棉纖維顏色相關(guān)多肽的活性片段和活性衍生物。

該多肽的變異形式包括：同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與棉纖維顏色相關(guān)多肽的dna雜交的dna所編碼的蛋白、以及利用抗棉纖維顏色相關(guān)多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含棉纖維顏色相關(guān)多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了棉纖維顏色相關(guān)多肽的可溶性片段。通常，該片段具有棉纖維顏色相關(guān)多肽序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。

本發(fā)明還提供棉纖維顏色相關(guān)多肽或多肽的類似物。這些類似物與天然棉纖維顏色相關(guān)多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然l-氨基酸的殘基(如d-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。

修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括：體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然Ｐ揎椷€包括糖基化。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。

在本發(fā)明中，“棉纖維顏色相關(guān)多肽保守性變異多肽”指與seqidno.:2的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)，最佳地至多3個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。在所述蛋白中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能，在c末端和/或\末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。

表1

重組技術(shù)和植物改良

本發(fā)明棉纖維顏色相關(guān)基因的全長序列或其片段通?？梢杂胮cr擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于pcr擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cdna庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cdna庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次pcr擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。

一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。

此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時(shí)。通常，通過先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。

目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的dna序列。然后可將該dna序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的dna分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。

本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或棉纖維顏色相關(guān)多肽編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。

通過常規(guī)的重組dna技術(shù)(science，1984；224：1431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來表達(dá)或生產(chǎn)重組的棉纖維顏色相關(guān)多肽。一般來說有以下步驟：

(1)用本發(fā)明的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；

(2)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；

(3)從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。

本發(fā)明的多核苷酸序列可插入到重組表達(dá)載體中。術(shù)語“重組表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒或其他載體?？傊?，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個(gè)重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含本發(fā)明多核苷酸和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組dna技術(shù)、dna合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的dna序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mrna合成。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。

此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(gfp)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。

包含上述的適當(dāng)dna序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。

宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如植物細(xì)胞(如農(nóng)作物和林業(yè)植物的細(xì)胞)。代表性例子有：大腸桿菌，鏈霉菌屬、農(nóng)桿菌；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞等。

本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，如果在載體中插入增強(qiáng)子序列時(shí)將會(huì)使轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是dna的順式作用因子，通常大約有10到300個(gè)堿基對(duì)，作用于啟動(dòng)子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄。

本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和宿主細(xì)胞。

用重組dna轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收dna的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲，用cacl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用mgcl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的dna轉(zhuǎn)染方法：磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。

轉(zhuǎn)化植物也可使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化或基因槍轉(zhuǎn)化等方法，例如葉盤法。對(duì)于轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或器官可以用常規(guī)方法再生成植株，從而獲得棉纖維顏色變化的植物。

獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。

在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于：常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超濾處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(hplc)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。

重組的棉纖維顏色相關(guān)多肽有多方面的用途。例如用于篩選具有調(diào)控棉纖維顏色功能的化合物、多肽或其它配體。用表達(dá)的重組棉纖維顏色相關(guān)多肽篩選多肽庫可用于尋找有價(jià)值的能抑制、或促進(jìn)棉纖維顏色相關(guān)多肽功能的多肽分子。

另一方面，本發(fā)明還包括對(duì)棉纖維顏色相關(guān)多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段、或嵌合抗體。

本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的棉纖維顏色相關(guān)多肽基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。本發(fā)明的各類抗體可以利用棉纖維顏色相關(guān)基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與棉纖維顏色相關(guān)基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如e.coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而獲得。抗棉纖維顏色相關(guān)多肽的抗體可用于檢測樣品中的棉纖維顏色相關(guān)多肽。

本發(fā)明還涉及定量和定位檢測棉纖維顏色相關(guān)多肽水平的測試方法。這些試驗(yàn)是本領(lǐng)域所熟知的。試驗(yàn)中所檢測的棉纖維顏色相關(guān)多肽水平，可用于解釋棉纖維顏色相關(guān)多肽調(diào)控棉纖維顏色的功能。

一種檢測樣品中是否存在棉纖維顏色相關(guān)多肽的方法是利用棉纖維顏色相關(guān)多肽的特異性抗體進(jìn)行檢測，它包括：將樣品與棉纖維顏色相關(guān)多肽特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在棉纖維顏色相關(guān)多肽。

本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或dna芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達(dá)分析。用棉纖維顏色相關(guān)多肽特異的引物進(jìn)行rna-聚合酶鏈反應(yīng)(rt-pcr)體外擴(kuò)增也可檢測棉纖維顏色相關(guān)多肽的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。

本發(fā)明還提供了一種調(diào)控棉屬植物的棉纖維顏色為綠色的方法，包括步驟：促進(jìn)at3gt基因的表達(dá)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，所述方法包括步驟：

(a)提供攜帶at3gt基因序列的表達(dá)載體的農(nóng)桿菌；

(b)將植物細(xì)胞或組織或器官與步驟(a)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使at3gt的基因序列轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，并且整合到植物細(xì)胞的染色體上；

(c)選擇已轉(zhuǎn)入at3gt基因序列的植物細(xì)胞或組織或器官；和

(d)將步驟(c)中的植物細(xì)胞或組織或器官再生為植株。

本發(fā)明多肽及其編碼序列的應(yīng)用

本發(fā)明提供了棉纖維顏色相關(guān)多肽及其編碼序列的用途，用于調(diào)控棉纖維的顏色。在本發(fā)明中，所述的棉纖維顏色相關(guān)多肽及其編碼序列還可用于制備調(diào)控棉纖維顏色為綠色的組合物。本發(fā)明還涉及棉纖維顏色相關(guān)多肽及其編碼序列的促進(jìn)劑或拮抗劑的用途。

任何可提高at3gt蛋白的活性、提高at3gt蛋白的穩(wěn)定性、促進(jìn)at3gt蛋白的表達(dá)、延長at3gt蛋白有效作用時(shí)間、或促進(jìn)at3gt的轉(zhuǎn)錄和翻譯的物質(zhì)均可用于本發(fā)明，作為at3gt的促進(jìn)劑。所述的促進(jìn)劑可用于調(diào)控棉纖維顏色為綠色。在得知了靶序列后，制備干擾特定基因表達(dá)的干擾分子的方法是本領(lǐng)域人員熟知的。

本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)包括：

(a)提供了棉纖維顏色相關(guān)基因及其所編碼的多肽。

(b)提供了一種有針對(duì)性地調(diào)控棉纖維顏色為綠色的方法。

(c)通過運(yùn)用類黃酮代謝途徑中的基因改變棉花纖維顏色。

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。

實(shí)施例1

轉(zhuǎn)錄譜分析彩色棉和白色棉纖維發(fā)育過程

分別對(duì)白色棉、綠色棉和棕色棉發(fā)育第0天、第12天的棉纖維進(jìn)行轉(zhuǎn)錄譜分析，結(jié)果如圖1所示，從聚類分析上可以看出，0天的樣本聚在一起，12天的樣本聚在一起，并且白色棉和棕色棉的整體基因表達(dá)模式是類似的(圖2a)，說明實(shí)驗(yàn)是可靠的。

分別對(duì)白色棉、綠色棉和棕色棉發(fā)育第0天、第12天的棉纖維進(jìn)行全基因組表達(dá)譜分析，結(jié)果如圖2b、圖2c所示，在彩色棉，尤其是棕色棉纖維中，苯丙氨酸代謝途徑中的類黃酮途徑眾多基因均表現(xiàn)出明顯的差異。與0天相比，纖維發(fā)育12天時(shí)，pal,c4h,chs,chi,dfr,f3'h,f3'5'h,3gt等均高表達(dá)。

分別對(duì)白色棉、綠色棉和棕色棉發(fā)育第12天的棉纖維進(jìn)行基因差異共表達(dá)分析，結(jié)果如圖2c所示，棕色棉纖維中的類黃酮途徑之中的pal,c4h,chs1，chs2，chs4，chs6，chi都較綠色棉和白色棉纖維中表達(dá)水平要高。綠色棉和白色棉表達(dá)較為相似，在木質(zhì)素合成途徑上，尤其是第一步關(guān)鍵酶hct的表達(dá)水平要比棕色棉纖維要高。并且在棕色棉和白色棉的差異表達(dá)基因中，苯丙氨酸代謝途徑中的基因主要被分在了兩個(gè)集群中，而綠色棉和白色棉差異的苯丙氨酸代謝途徑中的基因主要被分在了5個(gè)集群中，結(jié)果如圖2d、圖2e所示。

實(shí)施例2

構(gòu)建干擾類黃酮代謝途徑關(guān)鍵基因chi的載體并遺傳轉(zhuǎn)化棕色棉

通過實(shí)施例1中對(duì)棕色棉，綠色棉和白色棉纖維早期發(fā)育的表達(dá)譜分析表明，棕色棉具有顯著的類黃酮代謝途徑。因此，本實(shí)施例通過干擾pal途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)，研究纖維色素的合成情況。具體地，本實(shí)施例選擇chi這個(gè)關(guān)鍵基因進(jìn)行干擾。目前，棉花中有兩個(gè)chi基因表達(dá)，分別為chi-1和chi-2。chi-1和chi-2均在棕色棉纖維中表達(dá)，chi-2的表達(dá)水平要高于chi-1(圖3a)。氨基酸比對(duì)分析結(jié)果表明，chi-1和chi-2有一定的相似度，尤其在酶活性位點(diǎn)上較為保守(圖3b)。本實(shí)施例選擇chi-1編碼序列中一段特征性序列，相應(yīng)構(gòu)建干擾載體的rnai序列(seqidno.:8)，其長度為224bp。在cmv35啟動(dòng)子啟動(dòng)下，通過1kb的gus作為連接體構(gòu)成一個(gè)反向重復(fù)，誘導(dǎo)產(chǎn)生小rna，起到下調(diào)基因表達(dá)的作用。

通過農(nóng)桿菌侵染法，遺傳轉(zhuǎn)化3000朵棉花，t0當(dāng)代沒有看到纖維顏色發(fā)生改變，t1代獲得4個(gè)轉(zhuǎn)化子(圖3c)分別為1#，2#，3#和4#植株。

通過“1#植株”的nptii基因和hpt基因的鑒定，確認(rèn)1#為轉(zhuǎn)基因植株(圖3d)。進(jìn)一步通過southernblot對(duì)1#植株進(jìn)行再鑒定，發(fā)現(xiàn)了nptii雜交信號(hào)(圖3e)，再次確認(rèn)1#是轉(zhuǎn)基因植株。1#轉(zhuǎn)基因植株直接種植的后代共有24株，纖維顏色大致分為3種類型：淺棕色(與受體類似，第1組)、白色(帶有一點(diǎn)點(diǎn)棕色，第2組)和深綠色第3組(見圖3f)。

經(jīng)鑒定2#，3#和4#植株均是轉(zhuǎn)基因植株(見圖7)。對(duì)1#的t1代植株首先進(jìn)行了pcr驗(yàn)證它們都是轉(zhuǎn)基因(圖8)，接著進(jìn)行g(shù)hchi基因的定量檢測，從纖維發(fā)育的第0天到第5天，在淺棕色(與受體類似)和深綠色組中，ghchi-1基因的表達(dá)水平均比白色(帶有一點(diǎn)點(diǎn)棕色)組中的高，到了第10天，在淺棕色和深綠色組的ghchi-1基因的表達(dá)水平均有不同程度降低，在白色組中是略微升高(圖3g)。

對(duì)2#，3#和4#植株后代的纖維顏色進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果如圖4所示，纖維顏色主要分為3種類型，淺棕色、白色和深綠色，與1#轉(zhuǎn)基因植株后代表現(xiàn)一致。

同時(shí)針對(duì)部分轉(zhuǎn)基因樣品進(jìn)行纖維品質(zhì)的測定，在陸地棉中，通過比較白色棉，新陸中18號(hào)與彩色棉，新彩棉1號(hào)-7號(hào)的纖維長度，強(qiáng)度和馬克隆值，纖維質(zhì)量均比彩色棉要好(見圖5a)，接著比較了，不同顏色棕色棉(b，代表brown，棕色，b3代表纖維顏色等級(jí)，b4顏色比b3深，同理，g，代表green，綠色)(圖5b、圖5c、圖5d、圖5e)，發(fā)現(xiàn)，顏色越深，纖維長度和強(qiáng)度都變差。同時(shí)在轉(zhuǎn)基因后代中，發(fā)現(xiàn)深綠色(第3組)棉纖維在馬克隆值和纖維強(qiáng)度上都表現(xiàn)最差(見圖5f、圖5g、圖5h)。

實(shí)施例3

構(gòu)建過表達(dá)3gt基因的載體并遺傳轉(zhuǎn)化棕色棉

既然類黃酮代謝途徑在棕色棉和白色棉中存在顯著性差異，那么在轉(zhuǎn)基因后代中，是否依然存在差異。為研究該問題，通過轉(zhuǎn)錄組分析比較三種纖維顏色的轉(zhuǎn)基因后代：5#(b3)，6#(g4)和24#(b1)(圖6a)，發(fā)現(xiàn)類黃酮代謝途徑依舊存在差異(圖6b)，不過比野生型的bcf和wcf的差異要小。在這中間，又一次發(fā)現(xiàn)gh3gt基因仍然高表達(dá)在gcf中，與圖5中的結(jié)果保持一致。這就提示3gt可能是在gcf中特異性表達(dá)的，調(diào)控了綠色的形成。

為研究該問題，在生棕色的(b4)受體“xincaimian5#中過表達(dá)擬南芥中的3gt基因(at3gt,genbankaccessionno.at5g17050)，意外地發(fā)現(xiàn)：通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的柱頭侵染法，在t0代，有一個(gè)棉桃纖維顏色發(fā)生了改變，由棕色轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色(圖6c)。通過pcr鑒定其為轉(zhuǎn)基因植株(圖7)。說明類黃酮生物合成途徑確實(shí)調(diào)控了綠色纖維的形成。

在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。