一種扇貝抗氧化肽的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種利用扇貝加工廢棄物一一扇貝外套膜及加工碎肉，通過生物酶解技術(shù)制備抗氧化肽的方法，屬于食品科學(xué)高新技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]扇本發(fā)明主要利用生物酶解技術(shù)，利用扇貝加工廢棄物制備抗氧化肽，實現(xiàn)扇貝加工廢棄物的綜合利用的目的。
[0003]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下的技術(shù)方案實現(xiàn)的:
本發(fā)明是利用扇貝加工廢棄物一一扇貝外套膜及加工碎肉，利用蛋白酶進行水解，制備抗氧化肽的方法，其特點是:
1)將扇貝外套膜及加工碎肉速凍，搗碎備用；
2)稱取定量扇貝廢棄物，選取木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和菠蘿蛋白酶水解扇貝廢棄物，以水解度和抗氧化活性作為評價指標(biāo)，篩選出制備扇貝抗氧化肽的最佳蛋白酶；
3)通過響應(yīng)面法優(yōu)化酶解工藝條件；
4)酶解產(chǎn)物進一步經(jīng)過超濾、凝膠色譜層析、反向液相色譜等技術(shù)進行分離純化，獲得抗氧化肽，并利用質(zhì)譜儀測定其分子量范圍。
[0004]本發(fā)明具有明顯的優(yōu)點是:
I)產(chǎn)品活性強。通過此工藝可獲得扇貝抗氧化肽，其超氧陰離子的清除率達(dá)到70%以上。
[0005]2)工藝簡單易于實施。本發(fā)明只需要經(jīng)過原料處理和酶解過程即可。
[0006]3)產(chǎn)品實現(xiàn)了無廢棄物加工，通過本發(fā)明可以使扇貝廢棄物的附加值得到很大的提高，實現(xiàn)了扇貝無廢棄物加工。
[0007]【具體實施方式】:
下面通過實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步具體的說明。
[0008]實施例1:
1)將扇貝裙邊進行速凍后搗碎備用；
2)菠蘿蛋白酶酶解扇貝裙邊制備抗氧化肽的工藝研究。以DPPH清除率即抗氧化活性為評價指標(biāo)，通過單因素及響應(yīng)面法優(yōu)化試驗得到了菠蘿蛋白酶水解制備扇貝裙邊抗氧化肽的最佳工藝條件。該工藝條件為反應(yīng)溫度68.37°C，pH 9.35，底物濃度6.25%，加酶量6000U/g，反應(yīng)時間6 ho在此最優(yōu)酶解條件下測定DPPH的清除率達(dá)到70.32%。
[0009]3)利用超濾技術(shù)對扇貝裙邊酶解液進行初步分離，比較不同截留分子量膜包(10kDa、5kDa、3kDa、lkDa)獲得活性肽組分的體外抗氧化活性。結(jié)果表明:六種分子量多肽組分中，SSPH-n(l kDa?3 kDa)的組分清除DPPH自由基和羥自由基能力最強。
[0010]4)利用葡聚糖凝膠Sephadex G-25對SSPH-Π進行進一步純化得到兩個組分SSPH-n-F^SSPH-n-F2。測定其DPPH自由基清除能力得知SSPH-11士的抗氧化能力高于SSPH-Π-F2t3RH-HPLC 分離純化 SSPH-m-Fi 并得到單一組分 SSPH-m-F1-P。
[0011]5) RH-HPLC分離純化SSPH-11-F1，得到SSPH-Π-F沖含量相對較高并且分離效果較好的 SSPH-Π-F1-P7.6)海灣扇貝裙邊多肽的組分SSPH-11-F1-P7經(jīng)過在線凈化液相色譜-四級桿靜電場軌道阱串聯(lián)質(zhì)譜儀(Q Exative)分析鑒定可知該組份由7種多肽組成，它們的分子量1000 Da-1700 Da之間。
[0012]貝是一種海產(chǎn)貝類，屬于軟體動物門、瓣鰓綱、珍珠貝目、扇貝科。世界上共有扇貝60多種。在我國分布的扇貝主要有四種，即櫛孔扇貝、華貴櫛孔扇貝、海灣扇貝及蝦夷扇貝。目前我國沿海人工養(yǎng)殖量最大的是海灣扇貝。自20世紀(jì)80年代以來，隨著我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，扇貝的養(yǎng)殖量以及凍貝柱、干貝柱的加工和出口量也越來越大。在加工貝柱的過程中產(chǎn)生了大量的加工廢棄物，小部分扇貝加工廢棄物被作為飼料低價出售，大部分棄于海邊任其腐爛，造成極大的資源浪費和環(huán)境污染。扇貝外套膜及加工碎肉是加工扇貝柱時的加工廢棄物，其蛋白含量高、氨基酸組成齊全，綜合開發(fā)利用潛力巨大。
[0013]目前，制備活性肽的方法主要有以下幾種:酶解法，微生物發(fā)酵法，生物提取法，化學(xué)降解法，DNA重組法，化學(xué)合成法。(I)酶解法:采用商品蛋白酶對蛋白質(zhì)進行適度水解，產(chǎn)品安全性高，生產(chǎn)條件溫和，這是目前制備抗氧化肽的主要手段；(2)微生物發(fā)酵法:從產(chǎn)酶菌中篩選出抗氧化活性肽高產(chǎn)菌株，將其與原料混合，置于最適條件下發(fā)酵，發(fā)酵后對發(fā)酵產(chǎn)物進行分離純化得到抗氧化肽；(3)生物提取法:存在于細(xì)菌、真菌、動植物等生物體內(nèi)的激素、酶抑制劑等天然活性肽;(4)化學(xué)降解法:在密閉的容器里，將原料蛋白質(zhì)置于適宜濃度的強酸或強堿溶液中，加熱至適宜溫度并持續(xù)一段時間后終止反應(yīng)。該法操作簡單，成本低廉但會生成有毒物質(zhì)；(5)DNA重組法:獲得抗氧化肽的基因片段，采用分子生物技術(shù)使基因在其它生物體上表達(dá)，以達(dá)到大規(guī)模生產(chǎn)；(6)化學(xué)合成法:采用液相或固相化學(xué)合成法制取，但該法生產(chǎn)成本高，副產(chǎn)物及殘留化合物多等因素而制約其發(fā)展。
[0014]本發(fā)明采用扇貝加工廢棄物作為主要原料，通過篩選優(yōu)良的蛋白酶，優(yōu)化酶解工藝，制備具有較強抗氧化活性的扇貝裙邊酶解產(chǎn)物，進一步分離純化得到活性最強的抗氧化組分，得到抗氧化肽產(chǎn)品，使原料變廢為寶達(dá)到綜合利用資源的目的。
[0015]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016]本發(fā)明主要利用生物酶解技術(shù)，利用扇貝加工廢棄物制備抗氧化肽，實現(xiàn)扇貝加工廢棄物的綜合利用的目的。
[0017]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下的技術(shù)方案實現(xiàn)的:
本發(fā)明是利用扇貝加工廢棄物一一扇貝外套膜及加工碎肉，利用蛋白酶進行水解，制備抗氧化肽的方法，其特點是:
1)將扇貝外套膜及加工碎肉速凍，搗碎備用；
2)稱取定量扇貝廢棄物，選取木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和菠蘿蛋白酶水解扇貝廢棄物，以水解度和抗氧化活性作為評價指標(biāo)，篩選出制備扇貝抗氧化肽的最佳蛋白酶；
3)通過響應(yīng)面法優(yōu)化酶解工藝條件； 4)酶解產(chǎn)物進一步經(jīng)過超濾、凝膠色譜層析、反向液相色譜等技術(shù)進行分離純化，獲得抗氧化肽，并利用質(zhì)譜儀測定其分子量范圍。
[0018]本發(fā)明具有明顯的優(yōu)點是:
I)產(chǎn)品活性強。通過此工藝可獲得扇貝抗氧化肽，其超氧陰離子的清除率達(dá)到70%以上。
[0019]2)工藝簡單易于實施。本發(fā)明只需要經(jīng)過原料處理和酶解過程即可。
[0020]3)產(chǎn)品實現(xiàn)了無廢棄物加工，通過本發(fā)明可以使扇貝廢棄物的附加值得到很大的提高，實現(xiàn)了扇貝無廢棄物加工。
[0021]【具體實施方式】:
下面通過實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步具體的說明。
[0022]實施例1:
1)將扇貝裙邊進行速凍后搗碎備用；
2)菠蘿蛋白酶酶解扇貝裙邊制備抗氧化肽的工藝研究。以DPPH清除率即抗氧化活性為評價指標(biāo)，通過單因素及響應(yīng)面法優(yōu)化試驗得到了菠蘿蛋白酶水解制備扇貝裙邊抗氧化肽的最佳工藝條件。該工藝條件為反應(yīng)溫度68.37°C，pH 9.35，底物濃度6.25%，加酶量6000U/g，反應(yīng)時間6 ho在此最優(yōu)酶解條件下測定DPPH的清除率達(dá)到70.32%。
[0023]3)利用超濾技術(shù)對扇貝裙邊酶解液進行初步分離，比較不同截留分子量膜包(10kDa、5kDa、3kDa、lkDa)獲得活性肽組分的體外抗氧化活性。結(jié)果表明:六種分子量多肽組分中，SSPH-n(l kDa?3 kDa)的組分清除DPPH自由基和羥自由基能力最強。
[0024]4)利用葡聚糖凝膠Sephadex G-25對SSPH-Π進行進一步純化得到兩個組分SSPH-Π-F^SSPH-n-F2。測定其DPPH自由基清除能力得知SSPH-Π 士的抗氧化能力高于SSPH-Π-F2t3RH-HPLC 分離純化 SSPH-m-Fi 并得到單一組分 SSPH-m-F1-P。
[0025]5) RH-HPLC分離純化SSPH-Π -F1，得到SSPH-Π -F沖含量相對較高并且分離效果較好的 SSPH-Π-F1-P7.6)海灣扇貝裙邊多肽的組分SSPH-11-F1-P7經(jīng)過在線凈化液相色譜-四級桿靜電場軌道阱串聯(lián)質(zhì)譜儀(Q Exative)分析鑒定可知該組份由7種多肽組成，它們的分子量1000 Da-1700 Da之間。
【主權(quán)項】
1.一種扇貝抗氧化肽的制備方法，其特征在于包括以下制備過程: (1)將扇貝外套膜及加工碎肉速凍，搗碎備用；以DPPH清除率即抗氧化活性為評價指標(biāo)，通過單因素及響應(yīng)面法優(yōu)化試驗得到了菠蘿蛋白酶水解制備扇貝裙邊抗氧化肽的最佳工藝條件，在最優(yōu)酶解條件下DPPH的清除率達(dá)到70%以上； (2)利用超濾技術(shù)對扇貝裙邊酶解液進行初步分離，比較不同截留分子量膜包獲得活性肽組分的體外抗氧化活性;利用葡聚糖凝膠Sephadex G_25和反相HPLC分離純化抗氧化肽，對抗氧化活性最高的組分進行在線凈化液相色譜-四級桿靜電場軌道阱串聯(lián)質(zhì)譜儀(QExative)分析鑒定，抗氧化肽由7種多肽組成，它們的分子量1000 Da?1700 Da之間。
【專利摘要】一種扇貝抗氧化肽的制備方法，本發(fā)明選用扇貝加工廢棄物——扇貝外套膜及加工碎肉為主要原料，通過生物酶解技術(shù)制備抗氧化肽的方法。以DPPH清除率即抗氧化活性為評價指標(biāo)，設(shè)定反應(yīng)溫度，pH值，底物濃度為三個待優(yōu)化因素，利用響應(yīng)面分析法進行優(yōu)化分析，得到菠蘿蛋白酶水解制備扇貝裙邊抗氧化肽的最佳工藝條件，在此最優(yōu)酶解條件下測定DPPH的清除率達(dá)到70.32%。所得產(chǎn)品可作為功能食品直接食用或作為附加材料添加到其他食品中，增強保健作用，實現(xiàn)廢棄物綜合環(huán)保利用。
【IPC分類】C12P21/06, C07K1/16, C07K1/36, C07K1/34, C07K1/20
【公開號】CN105713945
【申請?zhí)枴緾N201610271264
【發(fā)明人】桑亞新, 王向紅, 李榮喬, 李彩, 劉衛(wèi)華, 韓軍
【申請人】河北農(nóng)業(yè)大學(xué)