一種假微型海鏈藻的高活力細(xì)胞保藏方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微藻保藏方法，具體涉及一種餌料微藻假微型海鏈藻高密度高活力保藏方法。
【背景技術(shù)】
[0002]餌料微藻營(yíng)養(yǎng)全面，最適宜作為水產(chǎn)動(dòng)物的鮮活餌料;能夠提高水產(chǎn)動(dòng)物存活率，降低育苗成本，滿(mǎn)足育苗特殊階段的營(yíng)養(yǎng)和生長(zhǎng)需求;并能夠凈化水質(zhì)，實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)養(yǎng)殖的可持續(xù)發(fā)展，因此成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中不可替代的角色。水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物育苗中，往往需要保障大量?jī)?yōu)質(zhì)餌料微藻的供給。但人工培育微藻時(shí)，常會(huì)面臨生長(zhǎng)繁殖緩慢，且易被競(jìng)爭(zhēng)性浮游生物超越其增殖優(yōu)勢(shì)，如受雜藻污染或被捕食，造成繁育失敗。其中一個(gè)重要的原因是繁育起始階段餌料藻的細(xì)胞數(shù)少，缺乏競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。如何實(shí)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)餌料的優(yōu)勢(shì)增殖是一個(gè)函待解決的問(wèn)題。受季節(jié)、氣候、養(yǎng)殖生物生長(zhǎng)差異等條件的影響，適時(shí)、足量提供能夠迅速?gòu)?fù)壯并能快速增殖的高密度高活力起始藻源是養(yǎng)殖成功的重要工藝。其中之一是餌料微藻的高活力高密度保藏方法。
[0003]假微型海鏈藻是第一個(gè)被用來(lái)進(jìn)行全基因組測(cè)序的真核浮游硅藻，之后作為模式生物被廣泛應(yīng)用于代謝、遺傳、毒理、生態(tài)以及能源微藻篩選等眾多領(lǐng)域的研究;此藻營(yíng)養(yǎng)豐富，并能夠在陰雨天氣繁育，是水產(chǎn)養(yǎng)殖育苗中的一種重要優(yōu)質(zhì)餌料微藻。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種假微型海鏈藻的高活力高密度保藏方法，采用逐級(jí)降溫、降光，在最佳密度下進(jìn)行高活力保藏。本發(fā)明方法的微藻成活率高，復(fù)壯能力強(qiáng)，不易污染，且操作簡(jiǎn)便易行。
[0005]本發(fā)明的方法，包括如下的步驟:
[0006]I)將微藻接種于培養(yǎng)基中，使微藻細(xì)胞數(shù)增殖達(dá)16-1O7個(gè)/ml，
[0007]2)將培養(yǎng)后的藻液進(jìn)行梯度降溫處理；
[0008]所述的梯度降溫處理，是將培養(yǎng)溫度從培養(yǎng)環(huán)境溫度起，每24小時(shí)后降低5°C;直至降低到4-5°C;
[0009]3)在降溫同時(shí)降低光照時(shí)的光照強(qiáng)度，降低幅度為1000-20001x/天。
[0010]4)將藻液置于4_5°C黑暗條件保存。
[0011 ] 其中步驟I)的培養(yǎng)條件，溫度23-25°C，光照強(qiáng)度4000-5000Ix，光照周期:12h:12h；
[0012]其中步驟I)培養(yǎng)基:20mg/LNa2EDTA,2.5mg/L FeSO4.7H20,100mg/L KNO3j1mg/L K2HPO4l0.25mg/L MnS04，0.5 X 10—3mg/L維生素B12，5 X 10—3mg/L維生素Bi。
[0013]利用上述方法，可以實(shí)現(xiàn)假微型海鏈藻在2-6個(gè)月中保持高的存活率及快速?gòu)?fù)壯增殖能力，為生產(chǎn)實(shí)踐中適時(shí)提供高活力高密度的餌料藻源。
【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1:保種2月后的復(fù)壯細(xì)胞增殖過(guò)程圖；
[0015]圖2:保種2月后的復(fù)壯細(xì)胞的光合活力變化圖。
【具體實(shí)施方式】
[0016]本發(fā)明的高活力高密度保藏方法，將假微型海鏈藻培養(yǎng)至平臺(tái)初期，進(jìn)行梯度降溫降光后進(jìn)行懸浮藻液活體保藏。一定時(shí)間后，對(duì)其存活率進(jìn)行檢測(cè)，并將保藏藻液重新活化，利用血球計(jì)數(shù)板對(duì)其細(xì)胞增殖密度進(jìn)行計(jì)數(shù);利用水樣熒光儀對(duì)其光合參數(shù)Fv/Fm進(jìn)行跟蹤監(jiān)測(cè)。根據(jù)保藏后藻液重新活化后增殖速率、熒光參數(shù)Fv/Fm結(jié)果，以確定假微型海鏈藻活力、存活率以及復(fù)壯能力。
[0017]對(duì)于本發(fā)明說(shuō)明書(shū)中涉及的術(shù)語(yǔ)描述如下:
[0018]1、微藻平臺(tái)初期:指假微型海鏈藻生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定，藻液密度數(shù)量級(jí)為16-1O7個(gè)/ml;本步驟的增殖過(guò)程以及此培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件可保障保藏期藻液中細(xì)胞具有高的活力。
[0019]2、梯度降溫，指將處于適宜培養(yǎng)溫度下藻液在20°C環(huán)境中降溫24小時(shí)，然后逐次進(jìn)行環(huán)境溫度降溫處理；
[0020]3、重新活化，指將保藏藻液定量取出重新接種于培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)；
[0021]4、存活率，指藻液中保藏后完整活細(xì)胞數(shù)與保藏前細(xì)胞數(shù)比值；
[0022]5、生長(zhǎng)狀況與細(xì)胞活力，指重新活化后藻液細(xì)胞增殖速率以及增殖密度，葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm(即光合潛能)，反應(yīng)了細(xì)胞活力。
[0023]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。
[0024]實(shí)施例1
[0025]保藏過(guò)程:
[0026]I)將假微型海鏈藻接種于盛有培養(yǎng)液(其含量如下:20mg/L乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)，2.5mg/L七水硫酸亞鐵(FeSO4.7H20)，100mg/L硝酸鉀(KNO3)，10mg/L磷酸氫二鉀(K2HPO4)，0.25mg/L硫酸錳(MnS04)，0.5X 10—3mg/L維生素Β12，5Χ 10—3mg/L維生素B1)的錐形瓶中，放置于培養(yǎng)室(溫度23°C，光照強(qiáng)度50001x，光照周期12h:12h)中培養(yǎng)；
[0027]2)待假微型海鏈藻增殖至16-1O7個(gè)/ml。分別兩組:維持此藻液密度，或?qū)⒋嗽鍧饪s至19個(gè)/ml數(shù)量級(jí)。將藻液置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行梯度降溫(20-15-10-5 °C各24小時(shí))、降光(降低幅度為1000-20001x/天)，直至避光處理；
[0028]3)在4-5 °C避光條件保存；
[0029]存活率和復(fù)壯增殖檢測(cè):
[0030]I)分別將經(jīng)過(guò)2-6月的4-5 V避光條件下保藏的部分藻液取出，利用I_KI試劑染色法進(jìn)行存活率檢測(cè)。(1-ΚΙ試劑配制方法:碘化鉀3g;蒸餾水100ml;碘Ig，先將碘化鉀溶于蒸餾水中，待全部溶解后再加碘，振蕩溶解。注:將此液保存在棕色玻璃瓶?jī)?nèi));
[0031]2)取保藏藻液進(jìn)行重新活化:培養(yǎng)于250ml三角錐形瓶中，定容150ml，初始活藻細(xì)胞密度約14-1O5個(gè)/ml，各設(shè)置3平行；
[0032]3)利用血球計(jì)數(shù)板對(duì)藻細(xì)胞計(jì)數(shù)，利用葉綠素?zé)晒鈨x檢測(cè)Fv/Fm參數(shù)。
[0033]存活率及復(fù)壯增殖檢測(cè)結(jié)果:
[0034]藻密度為16-1O7個(gè)/ml的保藏藻液經(jīng)2月的存活率為100%，經(jīng)6月存活率為60%。細(xì)胞活力高，復(fù)壯增殖迅速，可迅速進(jìn)入細(xì)胞增殖;藻密度為19個(gè)/ml數(shù)量級(jí)的保藏藻液經(jīng)2月的存活率不到1%，經(jīng)6月的存活率為0.01%。細(xì)胞活力低，復(fù)壯增殖緩慢，能達(dá)到的最大細(xì)胞數(shù)低。
[0035]圖1顯示了保種2月后的復(fù)壯細(xì)胞增殖過(guò)程。圖2顯示了保種2月后的復(fù)壯細(xì)胞的光合活力變化。由結(jié)果可見(jiàn)，細(xì)胞密度數(shù)量級(jí)為16-1O7個(gè)/ml的保藏組，存活率高、細(xì)胞增殖迅速、細(xì)胞活力高，為適宜高活力保藏密度。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種假微型海鏈藻的高活力細(xì)胞保藏方法，其特征在于，所述方法包括如下的步驟: 1)將微藻接種于培養(yǎng)基中，使微藻細(xì)胞數(shù)增殖達(dá)16-1O7個(gè)/ml， 2)將培養(yǎng)后的藻液進(jìn)行梯度降溫處理； 3)在降溫同時(shí)降低光照時(shí)的光照強(qiáng)度，降低幅度為1000-20001x/天； 4)將藻液置于4-5°C黑暗條件保存。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟I)的培養(yǎng)條件如下:溫度23-250C，光照強(qiáng)度4000-50001x，光照周期:12h:12h03.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟I)中培養(yǎng)基組成如下:20mg/LNa2EDTA,2.5mg/L FeSO4.7H20,100mg/L KN03，10mg/L K2HPO4j0.25mg/L MnSO4j0.5 X 10"3mg/L 維生素 Bi2，5X 10—3mg/L 維生素 Bi。4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟2)的梯度降溫處理，是將培養(yǎng)溫度從培養(yǎng)環(huán)境溫度起，每24小時(shí)降低5°C;直至降低到4-5°C。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種假微型海鏈藻的高活力細(xì)胞保藏方法，包括以下步驟：1)將微藻接種于培養(yǎng)基中，使微藻細(xì)胞數(shù)增殖達(dá)106?107個(gè)/ml，2)將培養(yǎng)后的藻液進(jìn)行梯度降溫處理；3)在降溫同時(shí)降低光照時(shí)的光照強(qiáng)度，降低幅度為1000?2000lx/天；4)將藻液置于4?5℃黑暗條件保存。本發(fā)明為優(yōu)質(zhì)餌料微藻假微型海鏈藻的高活力細(xì)胞保存方法，采用逐級(jí)降溫、避光、懸浮藻液高活力活細(xì)胞保藏，微藻成活率高，復(fù)壯能力強(qiáng)，不易污染，且操作簡(jiǎn)便易行。
【IPC分類(lèi)】C12N1/04, C12N1/12, C12R1/89
【公開(kāi)號(hào)】CN105713838
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610294363
【發(fā)明人】耿沙沙, 周成旭, 嚴(yán)小軍, 駱其君, 徐繼林, 馬斌, 蔣瑩
【申請(qǐng)人】寧波大學(xué)