本發(fā)明涉及生物工程
技術領域：
，具體涉及一種枯草芽孢桿菌、其篩選方法和用途及生物防腐劑、其制備方法以及果蔬防腐方法。
背景技術：
：農業(yè)生產中，植物病害是導致作物產量損失和品質下降的主要原因之一，其中大部分由真菌引起。據報道，發(fā)達國家每年有10％-30％的新鮮水果損失于采后腐爛，而在缺乏冷藏貯運設施的發(fā)展中國家，果實腐爛率則超過40％，而引起果實腐爛的大多為真菌。在實際生產過程中，植物病害防治主要依賴于化學農藥，化學農藥在保護農業(yè)生產方面起到重大作用。但其長期普遍使用會導致病原菌產生抗藥性、產品農藥殘留超標、環(huán)境污染等系列問題，同時也使本身具有優(yōu)良品質的農產品因農藥的過渡而受影響。所以，保證農產品優(yōu)質高產、保護生態(tài)環(huán)境的病害防治技術的研究勢在必行。而生物防治，作為有望代替化學藥劑的一種安全、高效的新方法成為當前的研究熱點。目前植物病害生防微生物已涉及真菌、放線菌、細菌乃至病毒(噬菌體)等很多生物群類，其中枯草芽孢桿菌在生物防治中應用較為廣泛。枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是一種嗜熱、好氧、產芽孢的G+桿狀細菌。對人畜無毒無害，不污染環(huán)境，能產生多種抗菌素和酶，具有廣譜抗菌活性和極強的抗逆能力。在自然界中分布廣泛，不僅可以在土壤、植物根際、體表等外界環(huán)境中生長，還是植物體內常見的內生細菌。其突出特點是生長快、營養(yǎng)簡單，有利于生防菌劑的生產、劑型加工及在環(huán)境中的存活、定殖與繁殖，且批量生產工藝簡單，成本較低，施用方便，儲存期長，是一種理想的生防微生物。目前國內外已有關于芽孢桿菌作為生防菌應用于多種植物生長病害和貯藏病害防治中的研究報道。例如申請公布號為CN101870959A的發(fā)明專利公開了一種枯草芽孢桿菌、其菌劑、以及其制劑在水果保鮮領域的應用，涉及的枯草芽孢桿菌命名為BacillussubstilisJ18，現保藏在中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號為CGMCCNo：3665，菌株經過發(fā)酵培養(yǎng)后，制成發(fā)酵劑，發(fā)酵劑分別與氯化鈣和殼聚糖溶液混合制成干粉劑和被膜劑，其對梨采后黑斑病同時對梨輪紋病、葡萄灰霉病、西瓜枯萎病等都有顯著的防治效果。但其僅對梨采后病原菌一黑斑病有顯著拮抗效果，并不具有對其他易腐爛水果產生有效防腐的作用效果，并且其具有廣譜性不佳的缺點，同時該菌株對果蔬所產生的呼吸抑制效果不明顯，進一步降低了防腐效果。由此可見，能否基于現有技術中的不足，篩選出一種具有高效廣譜性、防腐效果好，同時能夠有效的抑制采摘后果蔬的呼吸作用，成為本領域技術人員亟待解決的技術難題。技術實現要素：本發(fā)明為了解決上述技術問題，提供了一種來源于土壤的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)Cy-29，最初來源于果園的土壤樣本，樣本經過梯度稀釋，分離純化之后得到對植物病原真菌有抑制作用的菌株，并對菌株進行鑒定，最終得到的菌株具有高效廣譜性，防腐效果好，同時能夠有效抑制采摘后果蔬的呼吸作用。為了達到上述技術效果，本發(fā)明包括以下技術方案：一種枯草芽孢桿菌，所述的枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)Cy-29，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏日期為2013年7月12日，保藏編號為CGMCC7916。本發(fā)明在土壤中提取并篩選出一種枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)Cy-29，最初來源于果園的土壤樣本，樣本經過梯度稀釋，分離純化之后得到對植物病原真菌有抑制作用的菌株，并對菌株進行鑒定得到?？莶菅挎邨U菌(Bacillussubtilis)Cy-29及其發(fā)酵產生的抑菌物質具有較強的廣譜抗真菌作用，對于多種植物生長病原真菌和果蔬貯藏真菌有較好的抑制作用，為植物生長病害和果蔬貯藏病害的生物防治提供了依據?？莶菅挎邨U菌Cy-29發(fā)酵所產生的抑菌物質具有以下性質：耐熱性良好，能耐受121℃的高溫；在pH在3-10內能保持較高的活性，作用范圍較廣；短時間紫外線照射對其影響較??；經木瓜蛋白酶處理后仍有部分活性。進一步的，所述枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)Cy-29的細胞呈短桿狀，革蘭氏染色為陽性，存在芽孢。在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，菌落表明粗糙，低凸起，邊緣不規(guī)則，無光澤不透明。進一步的，所述枯草芽孢桿菌的16SrDNA序列長1589bp，其序列如SEQIDNo.1所示。同源比對結果表明：該序列與序列號為序號為FR729926的枯草芽孢桿菌ZWQ-1的16SrDNA序列同源性最高，相似性為99％，結合菌體形態(tài)特征，生理生化鑒定結果確定Cy-29屬于芽孢桿菌(Bacillus)，為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。一種上述枯草芽孢桿菌在制備植物生長抗菌劑或果蔬防腐劑中的應用。一種上述的枯草芽孢桿菌的篩選方法，包括以下步驟：取土壤置于無菌水中振蕩均勻，與恒溫水浴保溫后進行梯度稀釋，取土壤稀釋液涂布于指示板，挑選出對指示菌指狀青霉有抑制作用的菌落置于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)平板上純化，將純化后的拮抗菌株進行抑菌效果檢測，篩選得到枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)Cy-29。進一步的，所述指示板的制備方法包括以下步驟：配制指狀青霉孢子懸液，將指狀青霉孢子懸液加入PDA固體培養(yǎng)基中傾注含指示菌孢子的指示平板中；所述牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)平板中的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的制備方法包括以下步驟：取以下重量份數1～10份的牛肉膏、5～20份的蛋白胨和3～15份的NaCl作為原料組分，加入去蒸餾水至總重量份數為1000份，調節(jié)pH值至7.0～7.2，滅菌處理得到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；所述PDA固體培養(yǎng)基的制備方法包括以下步驟：取重量份數為100～400份的馬鈴薯、10～35份的葡萄糖和10～25份的瓊脂粉，加入去蒸餾水至總重量份數為1000份，調節(jié)pH值至7.0～7.2，滅菌處理得到PDA固體培養(yǎng)基。上述的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和PDA固體培養(yǎng)基配方成分設計合理，且該配方成分的培養(yǎng)基能夠篩選得到本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌Cy-29。一種生物防腐劑，包括上述的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)Cy-29的發(fā)酵產物。本發(fā)明的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)Cy-29產生的發(fā)酵產物，其對多種植物病原真菌具有較強的抑制作用，有效抑制果實的呼吸作用，明顯降低果實冷藏期間的腐爛率。進一步的，所述的發(fā)酵產物為菌懸液和/或發(fā)酵上清液，所述菌懸液的菌體濃度為107CFU/mL。優(yōu)選地，所述的菌懸液為對數期的枯草芽孢桿菌Cy-29菌懸液，所述發(fā)酵上清液為穩(wěn)定期的枯草芽孢桿菌Cy-29的發(fā)酵上清液。一種上述的生物防腐劑的制備方法，包括以下步驟：步驟一：枯草芽孢桿菌Cy-29的活化：取枯草芽孢桿菌Cy-29于牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)平板進行劃線，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，挑取單菌落再次在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)平板劃線，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)得到活化的枯草芽孢桿菌Cy-29單菌落；步驟二：枯草芽孢桿菌Cy-29的發(fā)酵產物的制備：取活化的枯草芽孢桿菌Cy-29單菌落于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)制得種子液，將所述種子液接種于LNB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)獲得枯草芽孢桿菌Cy-29的發(fā)酵產物。進一步的，所述的發(fā)酵產物為菌懸液和/或發(fā)酵上清液，振蕩培養(yǎng)獲得枯草芽孢桿菌Cy-29的發(fā)酵產物的方法為：37℃條件下于180r/min振蕩培養(yǎng)14h后，獲得對數期的枯草芽孢桿菌Cy-29菌懸液；繼續(xù)培養(yǎng)30h后，將菌懸液離心處理，取上清液即獲得穩(wěn)定期的枯草芽孢桿菌Cy-29的發(fā)酵上清液。一種果蔬防腐方法，包括以下步驟：將采摘的果蔬經散熱處理后噴灑生物防腐劑，所述生物防腐劑為上述的生物防腐劑。采用上述技術方案，包括以下有益效果：本發(fā)明提供一種枯草芽孢桿菌、其篩選方法和用途及生物防腐劑、其制備方法以及果蔬防腐方法，通過枯草芽孢桿菌Cy-29的定植，生長和/或其產生的抑菌物質的拮抗作用，有效抑制果實的呼吸作用，明顯降低果實冷藏期間的腐爛率且對多種植物病原真菌具有較強的抑制作用，本發(fā)明提供的篩選方法科學合理，有效篩選出抑菌效果更優(yōu)，且使篩選的枯草芽孢桿菌Cy-29能夠有效降低過時腐爛率；同時本發(fā)明提供的生物防腐劑廣譜高效、無毒的然微生物活菌防腐保鮮劑，其噴涂于果蔬表面，能夠有效抑制果實的呼吸作用，同時具有很強的生物拮抗作用，在果蔬的表面形成一道有力的生物屏障，抵御和防止其他腐敗細菌的侵染和繁殖，達到防治果蔬腐爛變質的目的，增加果蔬的保鮮期和貨架壽命，減少經濟損失，另外本發(fā)明提供的生物防腐劑的制備方法工藝合理簡便，適合批量工業(yè)化生產。本發(fā)明提供的果蔬防腐方法，采用枯草芽孢桿菌Cy-29的發(fā)酵產物，針對果蔬防腐效果明顯，通過降低果蔬的呼吸作用和對腐敗細菌的抑制作用，雙重作用方式明顯的降低了果蔬的腐爛率，與現有的篩選得到的枯草芽孢桿菌相比，其防腐效果更佳，大大延長了果蔬的保鮮期，尤其是針對獼猴桃、木瓜或芒果等易腐爛水果，防腐效果更佳明顯，且無任何危害。附圖說明圖1為本發(fā)明對數期的枯草芽孢桿菌Cy-29菌懸液處理獼猴桃對其呼吸強度的影響；圖2為本發(fā)明對數期的枯草芽孢桿菌Cy-29菌懸液處理獼猴桃對其腐爛率的影響；圖3為本發(fā)明穩(wěn)定期的枯草芽孢桿菌Cy-29發(fā)酵上清液處理獼猴桃對其呼吸強度的影響；圖4為本發(fā)明穩(wěn)定期的枯草芽孢桿菌Cy-29發(fā)酵上清液處理獼猴桃對其腐爛率的影響；圖5枯草芽孢桿菌Cy-29與相近菌株16SrDNA序列進行同源比對構建的系統(tǒng)發(fā)育樹。具體實施方式下面通過具體的實施例對本發(fā)明做進一步的詳細描述。實施例一：一種枯草芽孢桿菌，所述的枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)Cy-29，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會微生物中心，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏日期為2013年7月12日，保藏編號為CGMCC7916。本發(fā)明在土壤中提取并篩選出一種枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)Cy-29，最初來源于果園的土壤樣本，樣本經過梯度稀釋，分離純化之后得到對植物病原真菌有抑制作用的菌株，并對菌株進行鑒定得到。枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)Cy-29及其發(fā)酵產生的抑菌物質具有較強的廣譜抗真菌作用，對于多種植物生長病原真菌和果蔬貯藏真菌有較好的抑制作用，為植物生長病害和果蔬貯藏病害的生物防治提供了依據?？莶菅挎邨U菌Cy-29發(fā)酵所產生的抑菌物質具有以下性質：耐熱性良好，能耐受121℃的高溫；在pH在3-10內能保持較高的活性，作用范圍較廣；短時間紫外線照射對其影響較??；經木瓜蛋白酶處理后仍有部分活性。采用牛津杯法進行抑菌實驗，每個含菌平板內放置一個滅菌牛津杯，在牛津杯中加入250μL無菌發(fā)酵液，每株供試菌含菌平板做3個平行，同時準備空白對照平板一個，牛津杯中加入250μL無菌水，30℃培養(yǎng)4-5d，觀察枯草芽孢桿菌Cy-29抑菌效果，結果表1所示。表1枯草芽孢桿菌Cy-29的酵上清液對真菌的抑制效果病原菌抑菌效果病原菌抑菌效果禾谷鐮刀病菌-葡萄座腔菌+土豆早疫病菌-桃褐腐病菌+西瓜枯萎病菌+尖孢炭疽菌+玉米大斑病菌-擴展青霉+萵苣灰霉病菌-指狀青霉+注：“+”表示有抑菌效果，“-”表示無抑菌效果試驗結果表明，枯草芽孢桿菌Cy-29對多種植物病原真菌具有較強的抑制作用。相對比現有技術中篩選得到的枯草芽孢桿菌本發(fā)明的枯草芽孢桿菌Cy-29對植物病原真菌的抑菌范圍更廣，大大優(yōu)于現有技術中的枯草芽孢桿菌。實施例二：一種枯草芽孢桿菌，所述的枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)Cy-29，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏日期為2013年7月12日，保藏編號為CGMCC7916。所述枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)Cy-29的細胞呈短桿狀，革蘭氏染色為陽性，存在芽孢。在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，菌落表明粗糙，低凸起，邊緣不規(guī)則，無光澤不透明。實施例三：一種枯草芽孢桿菌，所述的枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)Cy-29，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏日期為2013年7月12日，保藏編號為CGMCC7916。所述枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)Cy-29的細胞呈短桿狀，革蘭氏染色為陽性，存在芽孢。在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，菌落表明粗糙，低凸起，邊緣不規(guī)則，無光澤不透明。所述枯草芽孢桿菌的16SrDNA序列長1589bp，其序列如SEQIDNo.1所示。實施例四：一種枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)Cy-29在制備植物生長抗菌劑或果蔬防腐劑中的應用?？莶菅挎邨U菌Cy-29的發(fā)酵液進行抑菌活性測定：具體步驟如下：枯草芽孢桿菌Cy-29活化：從保種斜面挑取枯草芽孢桿菌Cy-29，在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)平板進行劃線，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48h；再次挑取單菌落在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)平板劃線，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15h?？莶菅挎邨U菌Cy-29發(fā)酵液制備：挑取活化的Cy-29單菌落接種于5mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，37℃、180r/min振蕩培養(yǎng)15h制備種子液；再將種子液按10％接種量接種于50mLNB培養(yǎng)基中，37℃、180r/min振蕩培養(yǎng)32h后，于4℃、8000r/min離心20min取上清液沸水浴處理30min。指示平板制備：調整10株供試真菌孢子懸液濃度，制備帶菌PDA指示平板。采用牛津杯法進行抑菌實驗，每個含菌平板內放置一個滅菌牛津杯，在牛津杯中加入250μL無菌發(fā)酵液，每株供試菌含菌平板做3個平行，同時準備空白對照平板一個，牛津杯中加入250μL無菌水，30℃培養(yǎng)4-5d，觀察抑菌效果，結果表2所示。表2枯草芽孢桿菌Cy-29的發(fā)酵上清液對真菌的抑制效果注：“+”表示有抑菌效果，“-”表示無抑菌效果試驗結果表明，枯草芽孢桿菌Cy-29對多種植物病原真菌具有較強的抑制作用。相對比現有技術中篩選得到的枯草芽孢桿菌本發(fā)明的枯草芽孢桿菌Cy-29對植物病原真菌的抑菌范圍更廣，大大優(yōu)于現有技術中的枯草芽孢桿菌。針對獼猴桃防腐作用效果實驗：具體包括以下步驟：以紅陽獼猴桃為實驗材料，采于四川省雅安市。(1)采摘獼猴桃后選擇無病害、無損傷的果實16℃散熱12h；(2)散熱后的獼猴桃分為三組，第一組不做任何處理，直接放置于0-2℃冷藏；第二組用實施例十三的枯草芽孢桿菌Cy-29對數期菌懸液噴灑，晾干后置于0-2℃冷藏；第三組用實施例十三的枯草芽孢桿菌Cy-29穩(wěn)定期發(fā)酵上清液噴灑，晾干后0-2℃冷藏。定期測定果實的呼吸強度和腐爛率。每個實驗組設置3個平行。檢測標準：果實呼吸強度：采用靜置法對鮮果進行測定，結果以CO2mg/kg.h表示。果實腐爛率：腐爛果實占檢查果實的百分數。實驗結果：觀察用枯草芽孢桿菌Cy-29對數期菌懸液處理果實與對照組呼吸強度實驗結果，顯示在貯藏的第14d對照組的呼吸強度達到了最大值235.35mg/kg.h，然后迅速下降，而實驗組果實呼吸強度21d才達到最大值102.58mg/kg.h，說明經過枯草芽孢桿菌Cy-29對數期菌懸液處理的實驗組則較好地抑制了果實呼吸強度，參見圖1。觀察用枯草芽孢桿菌Cy-29對數期菌懸液處理果實與對照腐爛率實驗結果，顯示實驗組果實腐爛速度明顯較慢，到貯藏結束，對照組腐爛率達30％，實驗組腐爛率只有13％。整個貯藏期，未經處理的對照組腐爛率始終高于實驗組，參見圖2。觀察用枯草芽孢桿菌Cy-29穩(wěn)定期發(fā)酵上清液處理果實與對照組呼吸強度實驗結果，顯示實驗組呼吸強度在整個試驗期間均低于對照組，峰值出現在第14d，為168.9mg/kg.h，明顯低于對照組235.35mg/kg.h，說明枯草芽孢桿菌Cy-29穩(wěn)定期發(fā)酵上清液處理較好地降低了果實呼吸強度，參見圖3。觀察用枯草芽孢桿菌Cy-29穩(wěn)定期發(fā)酵上清液處理果實與對照組腐爛率實驗結果，顯示實驗組果實腐爛速度明顯較慢，到貯藏結束，對照組腐爛率達33％，實驗組腐爛率只有18％。整個貯藏期，未經處理的對照組腐爛率始終高于實驗組，參見圖4。本發(fā)明以獼猴桃為例來證明包括枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)Cy-29的發(fā)酵產物對果實具有呼吸抑制性和防腐性，能夠用戶制備生物防腐劑，但本發(fā)明的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)Cy-29所適用的果蔬范圍不局限于獼猴桃，針對常規(guī)食用且常見的果蔬均具有呼吸抑制性和防腐性，本領域技術人員基于上述實驗方法和實驗結論能夠直接得到本發(fā)明草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)Cy-29的發(fā)酵產物對其他果蔬的呼吸抑制性和防腐性。實施例五：一種枯草芽孢桿菌的篩選方法，包括以下步驟：取土壤置于無菌水中振蕩均勻，與恒溫水浴保溫后進行梯度稀釋，取土壤稀釋液涂布于指示板，挑選出對指示菌指狀青霉有抑制作用的菌落置于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)平板上純化，將純化后的拮抗菌株進行抑菌效果檢測，篩選得到枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)Cy-29。實施例六：一種枯草芽孢桿菌的篩選方法，包括以下步驟：一種枯草芽孢桿菌的篩選方法，包括以下步驟：取土壤置于無菌水中振蕩均勻，與恒溫水浴保溫后進行梯度稀釋，取土壤稀釋液涂布于指示板，挑選出對指示菌指狀青霉有抑制作用的菌落置于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)平板上純化，將純化后的拮抗菌株進行抑菌效果檢測，篩選得到枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)Cy-29。所述指示板的制備方法包括以下步驟：配制指狀青霉孢子懸液，將指狀青霉孢子懸液加入PDA固體培養(yǎng)基中傾注含指示菌孢子的指示平板中。所述牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)平板中的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的制備方法包括以下步驟：取以下重量份數10份的牛肉膏、5份的蛋白胨和15份的NaCl作為原料組分，加入去蒸餾水至總重量份數為1000份，調節(jié)pH值至7.0-7.2，滅菌處理得到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；所述PDA固體培養(yǎng)基的制備方法包括以下步驟：取重量份數為100份的馬鈴薯、35份的葡萄糖和10份的瓊脂粉，加入去蒸餾水至總重量份數為1000份，調節(jié)pH值至7.0-7.2，滅菌處理得到PDA固體培養(yǎng)基。實施例七：一種枯草芽孢桿菌的篩選方法，包括以下步驟：取土壤樣品2g于10mL無菌水中，振蕩均勻后于80℃恒溫水浴保溫40min；然后對樣品進行梯度稀釋；取適宜濃度梯度的土壤稀釋液涂布指示平板；于25℃培養(yǎng)2-3d后觀察，挑出對指示菌指狀青霉有抑制作用的菌落在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)平板上反復劃線純化；純化后的拮抗菌株，對比抑菌效果，選擇抑菌效果最佳的純化菌株保留，即得枯草芽孢桿菌Cy-29。所述指示板的制備方法包括以下步驟：配制指狀青霉孢子懸液，孢子濃度為106cfu/mL，將孢子懸液按照每100mL培養(yǎng)基中加入1mL孢子液的比例加入到50℃左右的PDA固體培養(yǎng)基中傾注含指示菌孢子的指示平板。本實施方式枯草芽孢桿菌Cy-29在本實施方式枯草芽孢桿菌Cy-29可在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(1000mL)由3.0g牛肉膏、10.0g蛋白胨、5.0gNaCl，15g瓊脂粉，加去蒸餾水至1000mL，調節(jié)pH值至7.0-7.2，121℃高壓滅菌30min。指示菌指狀青霉可在PDA瓊脂培養(yǎng)基上生長，PDA瓊脂培養(yǎng)基(1000mL)由200g馬鈴薯、20g葡萄糖、15g瓊脂粉，加去蒸餾水至1000mL，121℃高壓滅菌30min。實施例八：一種枯草芽孢桿菌的篩選方法，包括以下步驟：一種枯草芽孢桿菌的篩選方法，包括以下步驟：取土壤置于無菌水中振蕩均勻，與恒溫水浴保溫后進行梯度稀釋，取土壤稀釋液涂布于指示板，挑選出對指示菌指狀青霉有抑制作用的菌落置于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)平板上純化，將純化后的拮抗菌株進行抑菌效果檢測，篩選得到枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)Cy-29。所述指示板的制備方法包括以下步驟：配制指狀青霉孢子懸液，將指狀青霉孢子懸液加入PDA固體培養(yǎng)基中傾注含指示菌孢子的指示平板中。所述牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)平板中的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的制備方法包括以下步驟：取以下重量份數1份的牛肉膏、20份的蛋白胨和3份的NaCl作為原料組分，加入去蒸餾水至總重量份數為1000份，調節(jié)pH值至7.0-7.2，滅菌處理得到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；所述PDA固體培養(yǎng)基的制備方法包括以下步驟：取重量份數為400份的馬鈴薯、10份的葡萄糖和25份的瓊脂粉，加入去蒸餾水至總重量份數為1000份，調節(jié)pH值至7.0-7.2，滅菌處理得到PDA固體培養(yǎng)基。將實施例五～實施例八所制備的枯草芽孢桿菌Cy-29進行鑒定：實驗方法：參照《伯杰細菌鑒定手冊》第八版和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》對枯草芽孢桿菌Cy-29進行生理生化鑒定結果如表3所示。表3枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)Cy-29生理生化特征+：陽性反應：-：陰性反應對篩選得到的枯草芽孢桿菌Cy-29進行分子鑒定，按以下步驟進行：提取菌株基因組DNA，利用細菌16SrDNA通用引物，以基因組DNA為模板進行PCR擴增；然后利用膠回收試劑盒回收PCR產物，進行克隆、轉化，篩選陽性克隆，經擴大培養(yǎng)后委托南京金斯瑞公司對核苷酸序列測序?？莶菅挎邨U菌Cy-29的16SrDNA序列長1589bp，其序列如SEQIDNo.1所示，經測序結果與Genbank中16SrDNA序列進行同源比對，然后用MEGA軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖5所示，以確定菌株的種屬關系。同源比對結果表明：該序列與序列號為序號為FR729926的枯草芽孢桿菌ZWQ-1的16SrDNA序列同源性最高，相似性為99％，結合菌體形態(tài)特征，生理生化鑒定結果確定Cy-29屬于芽孢桿菌(Bacillus)，為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。PCR引物由上海生工生物技術有限公司合成，膠回收試劑盒購自Axygen公司，亞克隆載體pMD18-T試劑盒購自TaKaRa公司。實施例九：一種生物防腐劑，包括實施例一至四所述的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)Cy-29的發(fā)酵產物。本申請的生物防腐劑尤其針對易腐爛水果的防腐作用更佳，下述以獼猴桃為例，進行防腐效果實驗，通過降低果蔬的呼吸作用和對腐敗細菌的抑制作用，雙重作用方式明顯的降低了果蔬的腐爛率，與現有的篩選得到的枯草芽孢桿菌相比，其防腐效果更佳，大大延長了果蔬的保鮮期，明顯降低了腐爛率。針對獼猴桃防腐作用效果實驗：具體包括以下步驟：以紅陽獼猴桃為實驗材料，采于四川省雅安市。(1)采摘獼猴桃后選擇無病害、無損傷的果實16℃散熱12h；(2)散熱后的獼猴桃分為三組，第一組不做任何處理，直接放置于0-2℃冷藏；第二組用枯草芽孢桿菌Cy-29對數期菌懸液噴灑，晾干后置于0-2℃冷藏；第三組用枯草芽孢桿菌Cy-29穩(wěn)定期發(fā)酵上清液噴灑，晾干后0-2℃冷藏。所述枯草芽孢桿菌Cy-29對數期菌懸液的制備方法如實施例十三所述內容，所述枯草芽孢桿菌Cy-29穩(wěn)定期發(fā)酵上清液的制備方法如實施例十三所述內容。定期測定果實的呼吸強度和腐爛率。每個實驗組設置3個平行。檢測標準：果實呼吸強度：采用靜置法對鮮果進行測定，結果以CO2mg/kg.h表示。果實腐爛率：腐爛果實占檢查果實的百分數。實驗結果：觀察用枯草芽孢桿菌Cy-29對數期菌懸液處理果實與對照組呼吸強度實驗結果，顯示在貯藏的第14d對照組的呼吸強度達到了最大值235.35mg/kg.h，然后迅速下降，而實驗組果實呼吸強度21d才達到最大值102.58mg/kg.h，說明經過枯草芽孢桿菌Cy-29對數期菌懸液處理的實驗組則較好地抑制了果實呼吸強度，參見圖1。觀察用枯草芽孢桿菌Cy-29對數期菌懸液處理果實與對照腐爛率實驗結果，顯示實驗組果實腐爛速度明顯較慢，到貯藏結束，對照組腐爛率達30％，實驗組腐爛率只有13％。整個貯藏期，未經處理的對照組腐爛率始終高于實驗組，參見圖2。觀察用枯草芽孢桿菌Cy-29穩(wěn)定期發(fā)酵上清液處理果實與對照組呼吸強度實驗結果，顯示實驗組呼吸強度在整個試驗期間均低于對照組，峰值出現在第14d，為168.9mg/kg.h，明顯低于對照組235.35mg/kg.h，說明枯草芽孢桿菌Cy-29穩(wěn)定期發(fā)酵上清液處理較好地降低了果實呼吸強度，參見圖3。觀察用枯草芽孢桿菌Cy-29穩(wěn)定期發(fā)酵上清液處理果實與對照組腐爛率實驗結果，顯示實驗組果實腐爛速度明顯較慢，到貯藏結束，對照組腐爛率達33％，實驗組腐爛率只有18％。整個貯藏期，未經處理的對照組腐爛率始終高于實驗組，參見圖4。獼猴桃原產于我國長江流域，因其風味獨特，營養(yǎng)豐富尤其Vc含量高而被人們譽為果中珍品和Vc之王，但其屬于呼吸躍變型果實，在常溫下難以長久貯藏，極易腐爛變質，導致其貨架期嚴重縮短?？莶菅挎邨U菌(Bacillussubtilis)Cy-29是一種嗜熱、好氧、產芽孢的G+桿狀細菌，對人畜無毒無害，不污染環(huán)境，能產生多種抗菌素和酶，具有廣譜抗菌活性和極強的抗逆能力。本發(fā)明以獼猴桃為例來證明包括枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)Cy-29的發(fā)酵產物的生物防腐劑對果實具有呼吸抑制性和防腐性，但本發(fā)明的生物防腐劑所適用的果蔬范圍不局限于獼猴桃，針對常規(guī)食用且常見的果蔬均具有呼吸抑制性和防腐性，本領域技術人員基于上述實驗方法和實驗結論能夠直接得到本發(fā)明生物防腐劑對其他果蔬的呼吸抑制性和防腐性。實施例十：一種生物防腐劑，包括為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)Cy-29的菌懸液和/或發(fā)酵上清液。由上述實施例九實驗數據可知，所述的菌懸液為對數期的枯草芽孢桿菌Cy-29菌懸液，所述發(fā)酵上清液為穩(wěn)定期的枯草芽孢桿菌Cy-29的發(fā)酵上清液。實施例十一：一種實施例八和實施例九所述的生物防腐劑的制備方法，包括以下步驟：步驟一：枯草芽孢桿菌Cy-29的活化：取枯草芽孢桿菌Cy-29于牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)平板進行劃線，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，挑取單菌落再次在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)平板劃線，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)得到活化的枯草芽孢桿菌Cy-29單菌落；步驟二：枯草芽孢桿菌Cy-29的發(fā)酵產物的制備：取活化的枯草芽孢桿菌Cy-29單菌落于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)制得種子液，將所述種子液接種于LNB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)獲得枯草芽孢桿菌Cy-29的發(fā)酵產物。進一步的，所述牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)平板中的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基的制備方法包括以下步驟：取以下重量份數10份的牛肉膏、5份的蛋白胨、15份的NaCl和10份的瓊脂粉作為原料組分，加入去蒸餾水至總重量份數為1000份，調節(jié)pH值至7.0-7.2，滅菌處理得到牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基。實施例十二：一種實施例八和實施例九所述的生物防腐劑的制備方法，包括以下步驟：步驟一：枯草芽孢桿菌Cy-29的活化：取枯草芽孢桿菌Cy-29于牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)平板進行劃線，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，挑取單菌落再次在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)平板劃線，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)得到活化的枯草芽孢桿菌Cy-29單菌落；步驟二：枯草芽孢桿菌Cy-29的發(fā)酵產物的制備：取活化的枯草芽孢桿菌Cy-29單菌落于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)制得種子液，將所述種子液接種于LNB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)獲得枯草芽孢桿菌Cy-29的發(fā)酵產物。所述的發(fā)酵產物為菌懸液和/或發(fā)酵上清液，振蕩培養(yǎng)獲得枯草芽孢桿菌Cy-29的發(fā)酵產物的方法為：37℃條件下于180r/min振蕩培養(yǎng)14h后，獲得對數期的枯草芽孢桿菌Cy-29菌懸液；繼續(xù)培養(yǎng)30h后，將菌懸液離心處理，取上清液即獲得穩(wěn)定期的枯草芽孢桿菌Cy-29的發(fā)酵上清液。進一步的，所述牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)平板中的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基的制備方法包括以下步驟：取以下重量份數1份的牛肉膏、20份的蛋白胨、3份的NaCl和30份的瓊脂粉作為原料組分，加入去蒸餾水至總重量份數為1000份，調節(jié)pH值至7.0-7.2，滅菌處理得到牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基。實施例十三：一種實施例八和實施例九所述的生物防腐劑的制備方法，包括以下步驟：步驟一：枯草芽孢桿菌的活化：從保種斜面挑取枯草芽孢桿菌Cy-29，在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)平板進行劃線，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48h；再次挑取單菌落在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)平板劃線，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15h；步驟二：挑取活化的Cy-29單菌落接種于5mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，37℃、180r/min振蕩培養(yǎng)15h制備種子液；再將種子液按10％接種量接種于50mLNB培養(yǎng)基中，37℃、180r/min振蕩培養(yǎng)14h后，獲得枯草芽孢桿菌Cy-29對數期菌懸液；培養(yǎng)30h后，將菌懸液8000rpm離心5min，取上清液即獲得枯草芽孢桿菌Cy-29穩(wěn)定期發(fā)酵上清液。其中牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(1000mL)由3.0g牛肉膏、10.0g蛋白胨、5.0gNaCl，15g瓊脂粉加去蒸餾水至1000mL，調節(jié)pH值至7.0-7.2，121℃高壓滅菌30min；以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領域的技術人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。當前第1頁1 2 3