本發(fā)明涉及生物技術領域，具體涉及一種重組腫瘤壞死因子相關細胞凋亡誘導配體蛋白的制備方法與應用。

背景技術：

腫瘤已成為人類生命健康的嚴重威脅之一，以手術為主的綜合治療雖然取得了很好的療效，但術后復發(fā)轉移仍是影響生存率和死亡率的主要因素。近年來，生物技術給腫瘤的治療開辟了新的途徑。

腫瘤壞死因子(TNF)相關的細胞凋亡誘導配體(TRAIL)是TNF超家族的一個成員，可以通過激活外源性凋亡通路誘導凋亡。TRAIL可與兩個包含死亡結構域的受體(TRAILR1/DR4和TRAILR2/DR5)結合，從而引發(fā)細胞死亡，此外TRAIL也可與兩個誘騙受體(TRAILR3/DcR1和TRAILR4/DcR2)結合，起到保護作用。近來，由于TRAIL顯著的選擇性誘導腫瘤細胞凋亡的特性(不殺傷正常細胞)而被認為是一種潛在的腫瘤治療藥物。TRAIL可以有效的誘導多種腫瘤細胞的凋亡，目前正在進行和已完成的I期和II期臨床試驗表明TRAIL是一種安全有效的藥物。

但單體結構的TRAIL不能誘導細胞凋亡，為實現(xiàn)TRAIL誘導細胞凋亡的目的，現(xiàn)有技術中通過重組TRAIL形成二聚體或多聚體后，與死亡受體相結合而發(fā)揮細胞凋亡的作用。但目前已報道的重組TRAIL蛋白的制備過程均存在穩(wěn)定性差、包涵體復性率不高、易沉淀等問題。

技術實現(xiàn)要素：

針對上述現(xiàn)有技術，本發(fā)明的目的是提供一種重組腫瘤壞死因子相關細胞凋亡誘導配體蛋白及其制備方法。本發(fā)明將帶有His₆-Myc標簽的氨基酸序列插入到位于人TRAIL蛋白的95-281個氨基酸序列之后，得到的重組蛋白稱為His₆-Myc-TRAIL，簡稱HM-TRAIL。制備得到的重組人HM-TRAIL蛋白具有顯著的誘導細胞凋亡的作用；而且制備過程穩(wěn)定性好，包涵體復性率高，不易沉淀。

本發(fā)明的另一個目的是提供上述重組人HM-TRAIL蛋白在制備抗腫瘤藥物中的應用。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術方案：

本發(fā)明的第一方面，提供一種重組人HM-TRAIL蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本發(fā)明的第二方面，提供一種編碼上述重組人HM-TRAIL蛋白的序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本發(fā)明的第三方面，提供一種重組表達載體，其是由上述核苷酸序列經(jīng)雙酶切插入到pQE16表達載體的多克隆位點中制備而成。

本發(fā)明的第四方面，提供一種重組細菌，其是由上述重組表達載體轉化至E.coli TOP10感受態(tài)細菌中制備而成。

本發(fā)明的第五方面，提供一種重組人HM-TRAIL蛋白的制備方法，包括如下步驟：

(1)將上述重組細菌接種于LB培養(yǎng)基上，進行過夜培養(yǎng)；

(2)將過夜培養(yǎng)的菌種用含氨芐霉素和卡那霉素的LB培養(yǎng)基進行稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)至菌液的OD值在600nm處為0.6-0.8；

(3)加入IPTG作為誘導劑，使其終濃度為40μg/ml，誘導培養(yǎng)，使重組細菌表達重組人HM-TRAIL蛋白。

上述方法中：

步驟(1)中，過夜培養(yǎng)的條件為：37℃搖床培養(yǎng)，搖床轉速為225-250rpm。

步驟(2)中，所述稀釋操作具體為：將過夜培養(yǎng)的菌種用含1：1000氨芐霉素和卡那霉素的LB培養(yǎng)基進行200倍稀釋。

步驟(3)中，所述誘導培養(yǎng)的條件為：20-22℃、225-250rpm，培養(yǎng)16-20h。若遇到溶解等問題，可以在18℃環(huán)境中進行培養(yǎng)，以提高蛋白的表達量。

上述方法還包括表達產(chǎn)物的分離及純化的步驟；

所述分離步驟為：將誘導培養(yǎng)后的細菌6000rpm離心15min，收集細菌沉淀；向細菌沉淀中加入細菌裂解液，混勻，得細胞懸液；將得到的細菌懸液進行超聲裂解，室溫14,000rpm離心15min，分離含有可溶性蛋白的上清，通過用緩沖液進行稀釋，或通過截留值為10KD的微孔離心管進行交換，上清用0.22μm的濾器過濾。

所述純化的步驟為：采用GE HiTrap層析螯合柱，將分離出的含有可溶性蛋白的上清上樣，用2-5倍于螯合柱體積的洗脫緩沖液洗脫目標蛋白；

所述洗脫緩沖液的組成為：1MTris-HCl(pH＝7.4)10ml，氯化鈉8.19g，β-巰基乙醇0.39065g，咪唑34.0385g，ddH₂O至1L。

上述純化步驟中，在用洗脫緩沖液洗脫目標蛋白之前，還包括：用5倍于螯合柱體積的蒸餾水潤洗柱子和用至少5倍于螯合柱體積的結合緩沖液平衡柱子的步驟；

所述結合緩沖液的組成為：1MTris-HCl(pH＝7.4)10ml，氯化鈉29.25g，β-巰基乙醇0.39065g，ddH₂O至1L。

上述純化步驟中，在用洗脫緩沖液洗脫目標蛋白之后，還包括：用5倍于螯合柱體積的再生緩沖液重新平衡柱子，然后用5-10倍于螯合柱體積的蒸餾水潤洗柱子的步驟；

所述再生緩沖液的組成為：1MTris-HCl(pH＝7.4)10ml，氯化鈉29.25g，EDTA14.612g，ddH₂O至100ml。

上述重組人HM-TRAIL蛋白在制備抗腫瘤藥物中的應用也是本發(fā)明的保護范圍；優(yōu)選的，上述重組人HM-TRAIL蛋白在制備治療乳腺癌的藥物中的應用。

本發(fā)明的第六方面，提供一種抗腫瘤藥物，其含有上述重組人HM-TRAIL蛋白。

本發(fā)明的有益效果：

(1)本發(fā)明制備的重組人HM-TRAIL蛋白具有穩(wěn)定性好、溶解度高的特點，可明顯誘導腫瘤細胞的凋亡，應用前景良好。

(2)本申請在制備重組人HM-TRAIL蛋白時所插入的His₆-Myc標簽位于人HM-TRAIL蛋白的95-281個氨基酸序列之后，既能提高重組人HM-TRAIL蛋白的穩(wěn)定性及可復性，又能為后續(xù)的實驗同時提供兩種蛋白標簽，便于純化及檢測，應用前景良好。

(3)大腸桿菌表達系統(tǒng)是目前較為常用的外源蛋白表達系統(tǒng)，但大腸桿菌的不同菌株在相同的條件下，表現(xiàn)出的特性卻迥然不同，因此，為使外源基因得到最佳的表達，需要對大腸桿菌表達系統(tǒng)中的宿主菌和表達載體進行篩選和優(yōu)化。本發(fā)明以重組人HM-TRAIL蛋白的表達量為考察指標，對大腸桿菌表達系統(tǒng)中的多種表達載體和宿主菌進行了篩選，結果發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明所選用的表達載體pQE16，其分子量相對較小，在細胞內(nèi)進行擴增時對細胞造成的負荷會小一些，進而載體上所連接的外源基因的拷貝數(shù)也相對多，因此，重組蛋白的表達量也會相對增多；另外，菌株與菌株之間重組人HM-TRAIL蛋白的表達量也差異顯著，與大腸桿菌表達系統(tǒng)中的其他宿主菌相比，本發(fā)明所采用的宿主菌E.coli TOP10感受態(tài)細菌，其重組人HM-TRAIL蛋白的表達量明顯增加。

(4)誘導方式對重組人HM-TRAIL蛋白的表達也有影響，IPTG的加入量、誘導培養(yǎng)的溫度和時間是影響重組人HM-TRAIL蛋白表達的關鍵工藝參數(shù)。其中，IPTG在一定濃度范圍內(nèi)能夠促進基因的表達，但是，IPTG具有潛在的毒性，且價格較高，IPTG的加入量也不宜過多；本發(fā)明對IPTG的加入量進行了優(yōu)化，結果發(fā)現(xiàn)，IPTG的終濃度為40μg/ml時，重組人HM-TRAIL蛋白的表達量最高，而且工藝成本和IPTG潛在的毒性也得到了較好的控制。

誘導培養(yǎng)的溫度也是一個關鍵參數(shù)，其對基因表達的調(diào)控作用可發(fā)生在復制、轉錄、翻譯分子水平和細胞水平。溫度較低的條件下進行目標蛋白的誘導將有利于可溶性蛋白的生產(chǎn)，但蛋白的合成速度比較慢；溫度較高則加快蛋白的合成速度，但若蛋白折疊速度跟不上蛋白合成速度，則將導致大量包涵體蛋白的形成。本發(fā)明對誘導培養(yǎng)的溫度進行了考察，綜合平衡刻蛋白的合成速度和可溶性蛋白的含量，最終確定的誘導培養(yǎng)的溫度為20-22℃。

誘導培養(yǎng)時間的長短一方面影響外源蛋白的產(chǎn)量，另一方面也會影響發(fā)酵周期；本發(fā)明考察了不同的誘導時間對表達重組人HM-TRAIL蛋白的變化規(guī)律，從而確定了最佳的誘導培養(yǎng)時間為16-20h。

(5)本發(fā)明通過對表達載體、宿主菌以及蛋白誘導表達條件的優(yōu)化，先提高了總的重組人HM-TRAIL蛋白(包括包涵體及可溶性形式的重組人HM-TRAIL蛋白)的表達量，在此基礎上再提高可溶性HM-TRAIL蛋白的表達量，從而達到提高單位細胞中重組可溶性HM-TRAIL蛋白產(chǎn)量的目的。采用本發(fā)明的方法，總的重組人HM-TRAIL蛋白的表達量最高可達32.6％，可溶性HM-TRAIL蛋白的表達量可達21.4％(本發(fā)明中的表達量是指表達的重組人HM-TRAIL蛋白占菌體總蛋白的質量百分數(shù))。

(6)重組蛋白的純化一直是重組蛋白制備的難點所在，本發(fā)明采用GE HiTrap層析螯合柱對制備的重組人HM-TRAIL蛋白進行了純化，通過對純化步驟，以及洗脫緩沖液、結合緩沖液和再生緩沖液的優(yōu)化，提高了制備的重組蛋白的純度。

附圖說明

圖1：重組人HM-TRAIL蛋白的SDS-PAGE及考馬斯亮藍染色的結果；其中，WCL：全細胞裂解產(chǎn)物；FL：未結合流出產(chǎn)物；W：10mM咪唑洗滌液；E1：咪唑洗脫液第一遍；E2：咪唑洗脫液第二遍；

圖2：MTT法檢測重組人HM-TRAIL誘導各種乳腺細胞系凋亡的作用。

具體實施方式

結合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，應該說明的是，下述說明僅是為了解釋本發(fā)明，并不對其內(nèi)容進行限定。

本發(fā)明實施例中所用到的試劑、酶、表達載體等均為現(xiàn)有技術中的常規(guī)產(chǎn)品。

實施例1：重組人源HM-TRAIL蛋白的制備

1.pQE16-HM-TRAIL表達載體的構建

將帶有His₆-Myc標簽的氨基酸序列(MRGSHHHHHHGSEQKLISEEDLNLQ)插入到位于人TRAIL蛋白的95-281個氨基酸序列后(序列如SEQ ID NO.1)，PCR擴增編碼上述重組人HM-TRAIL蛋白的核苷酸序列(序列如SEQ ID NO.2)，并雙酶切連接插入到pQE16表達載體的多克隆位點中，并測序驗證序列。

2.pQE16-HM-TRAIL表達載體的轉化(重組細菌的構建)

(1)將保存于-80℃的E.coli TOP10感受態(tài)細菌(100ul)取出置于冰上融化。

(2)將連接產(chǎn)物(約20ul)加入感受態(tài)細菌中，輕彈EP管底部，混勻后冰浴30min。

(3)將EP管放于42℃水浴中熱休克90s，插入冰上速冷2-3min。

(4)每管中加900ul不含抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃，220rpm振蕩1h。

(5)1h后，室溫3,000rpm離心5min，棄去950ul上清后，用剩余的50ulLB培養(yǎng)基重懸細菌涂于含抗生素的平板上。

(7)將LB瓊脂平板正置于37℃培養(yǎng)箱中，至表面液體被吸收，約0.5-1h。

(8)將平板倒置于37℃培養(yǎng)箱，過夜培養(yǎng)，次日觀察平板上菌落的生長情況，能夠在平板上生長的細菌克隆為轉化子，即轉化成功的細菌。

3.菌液擴增及保存

向搖菌管中每管加入約5～8ml的含抗生素(1/1000的氨芐霉素和卡那霉素)的LB培養(yǎng)基，用20ul滅菌槍頭尖端挑取LB平板上的單克隆于試管中，37℃，220rpm振蕩12～16h，直至菌液OD值為0.4-0.6。得到的菌液可分裝至1.5ml EP管中-80℃長期保存。

4.菌種的復蘇

為了復蘇菌種，用滅菌的接種環(huán)輕輕刮取稍微融化的凍存菌株的上表面，然后立即將接種環(huán)上蘸取的細菌在含有抗生素的LB平板上劃線，將平板放在37℃過夜培養(yǎng)。

5.細菌培養(yǎng)和蛋白誘導

(1)從第4步培養(yǎng)的細菌平板上用滅菌槍頭挑取一個單克隆，打入5ml含有LB培養(yǎng)基的試管中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加入合適的抗生素，本實驗中加入1/1000的氨芐霉素和卡那霉素，過夜培養(yǎng)于37℃搖床(225-250rpm)。

(2)過夜培養(yǎng)的菌種用含1：1000氨芐霉素和卡那霉素的LB培養(yǎng)基進行200倍稀釋，將1L的滅菌燒瓶作為搖菌容器，37℃搖3h，待600nm處OD值為0.6-0.8。

(3)用IPTG誘導蛋白表達，往搖好的菌液里加入100mg/ml的IPTG，使其終濃度為40μg/ml。誘導需20-22℃培養(yǎng)18h(225-250rpm)。若遇到溶解等問題，可在18℃環(huán)境進行，可提高可溶性蛋白的表達量。

6.目標蛋白提取

(1)將誘導好的細菌6000rpm離心15min。此步細菌沉淀可以直接進行下步或者凍存于-80℃。

(2)準備細菌裂解液：每1ml細菌裂解液(Thermo Fisher)加入2μlDNA酶I+2μl溶菌酶，裂解液中需要加入適量的無EDTA的蛋白酶抑制劑。

(3)稱取細菌沉淀，按每1mg細菌沉淀加入4ml細菌裂解液的比例裂解細菌沉淀，渦旋震蕩或者用移液器混成均一的細菌懸液，混勻后繼續(xù)輕柔震蕩10min。

(4)將步驟(3)得到的細菌懸液進行超聲裂解，以充分破壞細菌細胞壁，進一步提高可溶性蛋白的濃度。超聲裂解的具體過程為：將細菌懸液置于冰上，將超聲探針插入懸液液面以下，以中等頻率進行超聲，每次持續(xù)20s，間歇10s，連續(xù)10個循環(huán)。

(5)室溫14,000rpm離心15min，分離含有可溶性蛋白的上清(非可溶性蛋白在離心沉淀里)，將上清收集到新的離心管中。(注：通常情況下，一般收集大概90％的可溶性蛋白質。再次提取或許能增加產(chǎn)量，但一般沒有必要。)

(6)為了減少溶液中的混雜成分，樣品應調(diào)整緩沖液的組成。可以通過用緩沖液進行稀釋，或通過截留值為10KD的微孔離心管進行交換。(注：試劑采用的是特定溫和pH值為7.5的20mM TrisHCl的非離子型洗滌劑，沒有酶的成分存在。根據(jù)特定的蛋白質類型，可添加如鹽，溶菌酶，蛋白酶抑制劑，還原劑和螯合劑等成分。)

(7)上清用0.22μm的濾器過濾，等待純化。

7.目標蛋白純化(GE HiTrap層析螯合柱)

(1)在10ml注射器中裝滿蒸餾水，去除螯合柱的停止閥，連接好注射器和螯合柱，連接時避免產(chǎn)生氣泡。用10倍于螯合柱體積的蒸餾水潤洗柱子。

(2)將0.1M NiSO₄溶液2.5ml注入蒸餾水潤洗過的5ml層析柱中。

(3)用5倍于螯合柱體積的蒸餾水潤洗柱子。

(4)用至少5倍于螯合柱體積的結合緩沖液平衡柱子。

(5)將需純化的蛋白上柱，推薦的流量是5ml/min。

(6)用至少2倍于螯合柱體積的洗滌緩沖液-1潤洗柱子，接著用至少2倍于螯合柱體積的潤洗緩沖液-2潤洗柱子，留取每步流出液跑PAGE膠。

(7)用2-5倍于螯合柱體積的洗脫緩沖液洗脫目標蛋白，從每一步驟中留取40μl跑PAGE膠。

(8)用5倍于螯合柱體積的再生緩沖液重新平衡柱子，然后用5-10倍于螯合柱體積的蒸餾水潤洗柱子。螯合柱可以加20％的乙醇儲存于+4～+30℃。

(9)純化的蛋白需要在含有10mMβ-巰基乙醇的PBS中透析，選用的透析袋截留值為15kD；蛋白存儲于-80℃，避免反復凍融。

8.蛋白純化所需溶液

(1)1MTris-HCl溶液

(2)0.1M硫酸鎳溶液

(3)洗滌緩沖液-1

(4)洗滌緩沖液-2

(5)洗脫緩沖液

(6)結合緩沖液

(7)再生緩沖液

重組人HM-TRAIL蛋白的SDS-PAGE及考馬斯亮藍染色的結果如圖1所示。

對比例：重組人源TRAIL蛋白的制備

以pQE9作為表達載體，M15pRep4感受態(tài)細菌作為宿主細菌，His₆-Myc標簽同實施例1，以常規(guī)方法構建重組細菌。對構建的重組細菌進行培養(yǎng)和蛋白誘導，以及對目標蛋白進行純化。

采用SDS-PAGE及島津薄層掃描儀對實施例1和對比例的重組蛋白的表達效率進行檢測，結果為：采用實施例1的方法，總的重組人TRAIL蛋白的表達量為32.6％，可溶性TRAIL蛋白的表達量為21.4％。而采用對比例的方法，總的重組人TRAIL蛋白的表達量為27.1％，可溶性TRAIL蛋白的表達量為16.5％。結果表明，采用本發(fā)明的重組蛋白的制備方法，明顯提高了目的蛋白和可溶性蛋白的表達量。

實施例2：體外實驗

為了研究重組人HM-TRAIL蛋白的在體外對腫瘤細胞凋亡的誘導作用，我們在眾多乳腺癌細胞系及正常乳腺上皮細胞系MCF-10A中利用MTT法檢測了各種細胞系對HM-TRAIL的敏感性。

1.細胞培養(yǎng)與培養(yǎng)條件

人乳腺癌細胞株MCF-7、MDA-MB-231及MDA-MB-468細胞株培養(yǎng)于含10％胎牛血清、100U/ml青霉素及100μg/ml鏈霉素的DMEM(Dulbecco's改良MEM培養(yǎng)基)高糖培養(yǎng)基中。人乳腺癌細胞株SK-BR-3和ZR-75-1培養(yǎng)于含10％胎牛血清及抗生素的RPMI 1640培養(yǎng)基中。T47D乳腺癌細胞株培養(yǎng)于含10μg/ml牛胰島素及10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中。所有的細胞均在37℃和5％CO₂條件下常規(guī)培養(yǎng)。

2.MTT法檢測HM-TRAIL對腫瘤細胞凋亡的影響

(1)在96孔板每孔中加100ul含1×10³～3×10³個靶細胞的細胞懸液，設3-5個復孔，在37℃，5％CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。

(2)培養(yǎng)1-5天后，每孔加20ul MTT染液(5mg/ml溶在PBS里)，在37℃、5％CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6h。

(3)緩緩吸出上清培養(yǎng)基，盡量不要吸起紫色沉淀，吸凈上清后每孔加入100ul的DMSO溶解紫色沉淀，待沉淀充分溶解后，用酶標儀檢測490nm和550nm波長下每孔的吸光度值。

(4)以吸光度值對時間(天數(shù))作圖，繪制細胞增殖曲線。

重組人HM-TRAIL處理48h后用MTT法檢測各種乳腺癌細胞的存活率，結果如圖2所示。表明本發(fā)明合成的重組人HM-TRAIL可以顯著的誘導腫瘤細胞凋亡。

上述雖然結合附圖對本發(fā)明的具體實施方式進行了描述，但并非對本發(fā)明保護范圍的限制，所屬領域技術人員應該明白，在本發(fā)明的技術方案的基礎上，本領域技術人員不需要付出創(chuàng)造性勞動即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護范圍以內(nèi)。