本發(fā)明涉及制備β-胡蘿卜素晶體的方法，尤其是一種微生物來(lái)源的β-胡蘿卜素晶體的制備方法。
背景技術(shù)：
類(lèi)胡蘿卜素是一種廣泛存在于植物、動(dòng)物、微生物中，與人體的健康密切相關(guān)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，它主要包括β-胡蘿卜素、番茄紅素、葉黃素等。類(lèi)胡蘿卜素不僅具有抗癌、抗氧化等很高的藥用價(jià)值，而且還是人體維生素A的重要來(lái)源。類(lèi)胡蘿卜素作為食品添加劑和營(yíng)養(yǎng)增強(qiáng)劑，已經(jīng)得到FDA、歐洲共同體、WHO等國(guó)際組織的認(rèn)可，近年來(lái)更是被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、保健品及化妝品等領(lǐng)域。
天然的類(lèi)胡蘿卜素主要來(lái)自于植物。但是，植物性原料存在供應(yīng)不足，含量低等缺點(diǎn)，無(wú)法在工業(yè)上進(jìn)行大規(guī)模利用。微生物具有生長(zhǎng)繁殖快、含量高、不受季節(jié)性影響等優(yōu)點(diǎn)，因此，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素是一種理想的方法。
目前，提取三孢布拉霉菌中的類(lèi)胡蘿卜素的主要工藝包括：濕菌體與水混合經(jīng)高壓均質(zhì)提取，濕、干菌體與有機(jī)溶劑提取。得到粗提物后，分離純化等步驟得到高含量的晶體。中國(guó)專利第01804173.6號(hào)公開(kāi)了一種類(lèi)胡蘿卜素晶體的分離，采用濕菌體與水混合后經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)均質(zhì)破碎提取類(lèi)胡蘿卜素的混合物，再用乙醇、鹽水洗滌混合物。此方法提取類(lèi)胡蘿卜素時(shí)的溫度高，極易造成類(lèi)胡蘿卜素氧化降解，且分離純化困難，收率極低。中國(guó)專利申請(qǐng)第201210180281.4號(hào)公開(kāi)了一種采用高壓蒸汽破壁提取β-胡蘿卜素的方法。但是，此方法使用的溫度和壓力都較高，容易使β-胡蘿卜素氧化，造成產(chǎn)品收率低，且影響產(chǎn)品的品質(zhì)。
現(xiàn)有的以微生物發(fā)酵的方式制備β-胡蘿卜素晶體大都存在以下缺點(diǎn)：干燥或提取過(guò)程中需要經(jīng)高溫處理，極易造成類(lèi)胡蘿卜素的見(jiàn)光、氧化降解，造成收率低，產(chǎn)品品質(zhì)差。因此，需要考慮一種改良的方式來(lái)避免類(lèi)胡蘿卜素在制備過(guò)程中的損失。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種能降低β-胡蘿卜素氧化、提高收率和品質(zhì)的制備β-胡蘿卜素晶體的方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的制備β-胡蘿卜素晶體的方法，包括如下步驟：
(1) 將微生物菌種接種發(fā)酵，
(2) 將發(fā)酵液進(jìn)行固液分離，得到濕菌體；
(3) 將濕菌體干燥后得到干菌體；
(4) 使用有機(jī)溶劑對(duì)干菌體進(jìn)行萃取
(5) 固液分離后得到萃取液；
(6) 萃取液經(jīng)蒸發(fā)結(jié)晶得到結(jié)晶母液；
(7) 結(jié)晶母液經(jīng)過(guò)固液分離，得到粗濕晶體；
(8) 粗濕晶體經(jīng)有機(jī)溶劑洗滌后，真空干燥得到β-胡蘿卜素晶體；
步驟(3)、(4)、(6)的至少一個(gè)步驟中，加入抗氧化劑。
如前所述的制備β-胡蘿卜素晶體的方法，步驟(1)中，微生物菌種為三孢布拉霉、杜氏鹽藻或酵母。
如前所述的制備β-胡蘿卜素晶體的方法，步驟(3)中，抗氧化劑的添加量為濕菌體重量的0.1%～5%。
如前所述的制備β-胡蘿卜素晶體的方法，步驟(4)或(6)中，抗氧化劑的添加量為干菌體重量的0.1%～5%。
如前所述的制備β-胡蘿卜素晶體的方法，步驟(4)中，干菌體與有機(jī)溶劑質(zhì)量體積比為1:3-1:30。
如前所述的制備β-胡蘿卜素晶體的方法，步驟(4)中，萃取同時(shí)使用機(jī)械破碎的工藝，機(jī)械破碎后菌體的平均粒徑不高于300μm。
如前所述的制備β-胡蘿卜素晶體的方法，步驟(4)中，有機(jī)溶劑為己烷、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯或丙酮。
本發(fā)明制備β-胡蘿卜素的方法具有以下有益效果：由于β-胡蘿卜素氧化降解主要生成一系列揮發(fā)性致香物質(zhì)，如β-紫羅蘭酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯、異佛爾酮、氧化異佛爾酮等。這些氧化降解產(chǎn)物的大量存在對(duì)β-胡蘿卜素的純化存在較大影響，會(huì)影響β-胡蘿卜素的純度，因此在干燥、固液分離和蒸發(fā)結(jié)晶的過(guò)程中，部分或者全部添加抗氧化劑，既降低了提取過(guò)程中β-胡蘿卜素的損失，提升了β-胡蘿卜素的收率，又能制得純度更高，品質(zhì)更好的β-胡蘿卜素晶體。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。
收率計(jì)算及檢測(cè)純度的標(biāo)準(zhǔn)或者方法
1、菌體重β-胡蘿卜素含量的的檢測(cè)方法：準(zhǔn)確稱取0.01～0.03g樣品，精確0.0001g，
經(jīng)玻璃勻漿器破壁后，用乙酸乙酯提取，反復(fù)抽提至樣品完全無(wú)色，定容到25ml。再用
移液管取1ml稀釋至一定的倍數(shù)后定容。以乙酸乙酯為參比，將定容后的溶液倒入比色
皿中，在455 nm±2 nm 范圍內(nèi)的最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，然后根據(jù)β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)
曲線計(jì)算出菌體中的β-胡蘿卜素含量。
2、β-胡蘿卜素提取率的計(jì)算方法：
提取率(%)=m1/ (m2* w)
式中：m1：得到β-胡蘿卜素晶體重量；
m2：β-胡蘿卜素干菌體的重量；
w：β-胡蘿卜素干菌體中β-胡蘿卜素的含量。
3、β-胡蘿卜素晶體純度的檢測(cè)方法：參照GB 28310-2012 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑 β-胡蘿卜素(發(fā)酵法) 。
實(shí)施例1
以杜氏鹽藻為發(fā)酵菌種，依次按下列步驟操作：
1)將杜氏鹽藻接種發(fā)酵，將發(fā)酵液離心得到水量為75.7%濕菌體，
2)取1kg濕菌體，向濕菌體中加入1g二丁基羥基甲苯(抗氧化劑)，并混合均勻，真空干燥得到269.3g干菌體，真空干燥條件為：溫度80℃，負(fù)壓-0.085MPa。
3)取200g上述干燥的菌體，加入到3L的四頸燒瓶中，并加入600mL二氯甲烷，用高速剪切機(jī)破碎至菌體平均粒徑為181um，抽濾得到一萃萃取液和濕菌渣，濕菌渣用2L二氯甲烷進(jìn)行二次萃取，抽濾得到二萃萃取液。
4)合并兩次萃取液，在50℃，-0.08MPa條件下蒸發(fā)結(jié)晶，得到結(jié)晶母液。
5)將結(jié)晶母液抽濾得到濕晶體，濕晶體用20ml乙酸乙酯洗滌，再次抽濾得到濕晶體，濕晶體在80℃，-0.085MPa條件下，真空干燥2h，得到成品類(lèi)胡蘿卜素晶體。經(jīng)檢測(cè)，β-胡蘿卜素晶體的提取率為66.1%，經(jīng)檢測(cè)β-胡蘿卜素純度為97.3%。
6)按上述相同的工藝，不添加抗氧化劑進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)，經(jīng)計(jì)算β-胡蘿卜素晶體的提取率為60.9%，經(jīng)檢測(cè)β-胡蘿卜素純度為95.9%。
實(shí)施例2
以酵母為發(fā)酵菌種，依次按下列步驟操作：
1)將酵母接種發(fā)酵，將發(fā)酵液離心得到含水量為80.3%的濕菌體；
2)取上述10kg濕菌體，濕菌體重加入75g維生素E(抗氧化劑)，充分混合攪拌均勻，經(jīng)冷凍干燥得到2.17kg干菌體，冷凍干燥條件為：真空20Pa，捕集器溫度為-40℃，干燥18h。
3)取1kg干菌體，投入到50L的反應(yīng)釜中，再加入30L正己烷，用砂磨機(jī)循環(huán)破碎至菌體平均粒徑為217um，離心分離得到一萃萃取液和濕菌渣，濕菌渣繼續(xù)加入30L正己烷，在55℃萃取1h，離心得到二萃萃取液和濕菌渣。
4)合并一萃和二萃萃取液，在43℃，-0.085MPa的條件下蒸發(fā)結(jié)晶，得到結(jié)晶母液。
5)將上述結(jié)晶母液離心分離得到濕晶體，濕晶體用500ml正己烷攪拌洗滌，再次離心得到濕晶體，濕晶體在80℃，-0.085MPa條件下真空干燥2h得到成品類(lèi)胡蘿卜素晶體。經(jīng)計(jì)算類(lèi)胡蘿卜晶體收率為69.1%，經(jīng)檢測(cè)β-胡蘿卜素純度為97.7%。
6)按上述相同的工藝，不添加抗氧化劑進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)，經(jīng)計(jì)算β-胡蘿卜素晶體的收率為62.1%，經(jīng)檢測(cè)β-胡蘿卜素純度為96.1%。
實(shí)施例3
以酵母為發(fā)酵菌種，依次按下列步驟操作：
1)將酵母接種發(fā)酵，將發(fā)酵液離心得到含水量為80.1%的濕菌體；
2)取上述50kg濕菌體，濕菌體重加入150g維生素C棕櫚酸酯(抗氧化劑)，充分混合攪拌均勻，進(jìn)行噴霧干燥得到20.78kg干菌體，噴霧干燥條件為：熱風(fēng)溫度130℃，物料溫度65℃，風(fēng)機(jī)頻率為45Hz，進(jìn)料速度為5kg/h。
3)取5kg干菌體，投入到100L的反應(yīng)釜中，再加入50L正己烷，用砂磨機(jī)循環(huán)破碎至菌體平均粒徑為193um，離心分離得到一萃萃取液和濕菌渣，濕菌渣繼續(xù)加入50L正己烷，在55℃萃取1h，離心得到二萃萃取液和濕菌渣。
4)合并一萃和二萃萃取液，在43℃，-0.085MPa的條件下蒸發(fā)結(jié)晶，得到結(jié)晶母液。
5)將上述結(jié)晶母液離心分離得到濕晶體，濕晶體用250ml乙醇攪拌洗滌，再次離心得到濕晶體，濕晶體在80℃，-0.085MPa條件下真空干燥2h得到成品類(lèi)胡蘿卜素晶體。經(jīng)計(jì)算類(lèi)胡蘿卜晶體收率為69.1%，經(jīng)檢測(cè)β-胡蘿卜素純度為97.7%。
6)按上述相同的工藝，不添加抗氧化劑進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)，經(jīng)計(jì)算β-胡蘿卜素晶體的收率為61.7%，經(jīng)檢測(cè)β-胡蘿卜素純度為96.1%。
實(shí)施例4
以三孢布拉霉菌種作為發(fā)酵菌種，依次按下列步驟操作：
1)將三孢布拉霉接種發(fā)酵，將發(fā)酵液經(jīng)板框壓濾后得到含水量為55.1%濕菌體，
2)取500kg濕菌體用粉碎機(jī)破碎，加入25kg對(duì)羥基苯甲酸乙酯(抗氧化劑)混合均勻，再經(jīng)沸騰干燥得241.1kg干菌體，沸騰干燥條件為：熱風(fēng)溫度120℃，物料溫度55℃，風(fēng)機(jī)頻率50Hz。
3)取5kg上述干燥的菌體，投入到200L反應(yīng)釜中，并加入100L二氯甲烷，用高剪切膠體磨循環(huán)破碎至菌體平均粒徑為300um，升溫至55℃攪拌萃取1h，經(jīng)沉降分離后，上層萃取液用5um袋式過(guò)濾器和0.5um濾棒過(guò)濾器過(guò)濾得到一萃萃取液，下層濕菌渣繼續(xù)加入100L石油醚，在55℃萃取1.5h，萃取混合液用5um袋式過(guò)濾器和0.5um濾棒過(guò)濾器過(guò)濾得到二萃萃取液和濕菌渣。
4)合并兩次萃取液，在48℃，-0.08MPa條件下蒸發(fā)結(jié)晶，得到結(jié)晶母液。
5)將結(jié)晶母液抽濾得到粗濕晶體，粗濕晶體用500ml石油醚洗滌，再次抽濾得到濕晶體，濕晶體在80℃，-0.085MPa條件下，真空干燥2h，得到成品類(lèi)胡蘿卜素晶體。經(jīng)計(jì)算類(lèi)胡蘿卜素晶體的提取率為73.3%，經(jīng)檢測(cè)β-胡蘿卜素純度為98.1%。
6)按上述相同的工藝，不添加抗氧化劑進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)，經(jīng)計(jì)算β-胡蘿卜素晶體的提取率為62.9%，經(jīng)檢測(cè)β-胡蘿卜素純度為96.9%。
實(shí)施例5
以杜氏鹽藻為發(fā)酵菌種，依次按下列步驟操作：
1)將杜氏鹽藻接種發(fā)酵，將發(fā)酵液離心得到水量為75.7%濕菌體，
2)取1kg濕菌體，真空干燥得到269.3g干菌體，真空干燥條件為：溫度80℃，負(fù)壓-0.085MPa。
3)取200g上述干燥的菌體，向其中加入0.2g維生素E(抗氧化劑)，加入到3L的四頸燒瓶中，并加入600mL乙酸乙酯，用高速剪切機(jī)破碎至菌體平均粒徑為151um，抽濾得到一萃萃取液和濕菌渣，濕菌渣用2L乙酸乙酯進(jìn)行二次萃取，抽濾得到二萃萃取液。
4)合并兩次萃取液，在50℃，-0.08MPa條件下蒸發(fā)結(jié)晶，得到結(jié)晶母液。
5)將結(jié)晶母液抽濾得到濕晶體，濕晶體用20ml乙醇洗滌，再次抽濾得到濕晶體，濕晶體在80℃，-0.085MPa條件下，真空干燥2h，得到成品類(lèi)胡蘿卜素晶體。經(jīng)檢測(cè)，β-胡蘿卜素晶體的提取率為64.1%，經(jīng)檢測(cè)β-胡蘿卜素純度為97.3%。
6)按上述相同的工藝，不添加抗氧化劑進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)，經(jīng)計(jì)算β-胡蘿卜素晶體的提取率為60.9%，經(jīng)檢測(cè)β-胡蘿卜素純度為95.9%。
實(shí)施例6
以酵母為發(fā)酵菌種，依次按下列步驟操作：
1)將酵母接種發(fā)酵，將發(fā)酵液離心得到含水量為80.5%的濕菌體；
2)取上述10kg濕菌體，充分混合攪拌均勻，經(jīng)冷凍干燥得到2.07kg干菌體，冷凍干燥條件為：真空20Pa，捕集器溫度為-40℃，干燥20h。
3)取1kg干菌體，投入到30L的反應(yīng)釜中，加入50g二丁基羥基甲苯(抗氧化劑)，再加入30L正己烷，用砂磨機(jī)循環(huán)破碎至菌體平均粒徑為133um，離心分離得到一萃萃取液和濕菌渣，濕菌渣繼續(xù)加入30L正己烷，在55℃萃取1h，離心得到二萃萃取液和濕菌渣。
4)合并一萃和二萃萃取液，在43℃，-0.085MPa的條件下蒸發(fā)結(jié)晶，得到結(jié)晶母液。
5)將上述結(jié)晶母液離心分離得到濕晶體，濕晶體用250ml正己烷攪拌洗滌，再次離心得到濕晶體，濕晶體在80℃，-0.085MPa條件下真空干燥2h得到成品類(lèi)胡蘿卜素晶體。經(jīng)計(jì)算類(lèi)胡蘿卜晶體收率為69.1%，經(jīng)檢測(cè)β-胡蘿卜素純度為97.7%。
6)按上述相同的工藝，不添加抗氧化劑進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)，經(jīng)計(jì)算β-胡蘿卜素晶體的收率為63.3%，經(jīng)檢測(cè)β-胡蘿卜素純度為96.1%。
實(shí)施例7
以酵母為發(fā)酵菌種，依次按下列步驟操作：
1)將酵母接種發(fā)酵，將發(fā)酵液離心得到含水量為80.1%的濕菌體；
2)取上述50kg濕菌體，充分混合攪拌均勻，進(jìn)行噴霧干燥得到20.78kg干菌體，噴霧干燥條件為：熱風(fēng)溫度130℃，物料溫度65℃，風(fēng)機(jī)頻率為45Hz，進(jìn)料速度為5kg/h。
3)取5kg干菌體，投入到100L的反應(yīng)釜中，加入100g維生素C棕櫚酸酯(抗氧化劑)，再加入50L正己烷，用砂磨機(jī)循環(huán)破碎至菌體平均粒徑為153um，離心分離得到一萃萃取液和濕菌渣，濕菌渣繼續(xù)加入50L正己烷，在55℃萃取1h，離心得到二萃萃取液和濕菌渣。
4)合并一萃和二萃萃取液，在43℃，-0.085MPa的條件下蒸發(fā)結(jié)晶，得到結(jié)晶母液。
5)將上述結(jié)晶母液離心分離得到濕晶體，濕晶體用250ml乙酸乙酯攪拌洗滌，再次離心得到濕晶體，濕晶體在80℃，-0.085MPa條件下真空干燥2h得到成品類(lèi)胡蘿卜素晶體。經(jīng)計(jì)算類(lèi)胡蘿卜晶體收率為69.1%，經(jīng)檢測(cè)β-胡蘿卜素純度為97.7%。
6)按上述相同的工藝，不添加抗氧化劑進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)，經(jīng)計(jì)算β-胡蘿卜素晶體的收率為63.3%，經(jīng)檢測(cè)β-胡蘿卜素純度為96.1%。
實(shí)施例8
以三孢布拉霉菌種作為發(fā)酵菌種，依次按下列步驟操作：
1)將三孢布拉霉接種發(fā)酵，將發(fā)酵液經(jīng)板框壓濾后得到含水量為55.1%濕菌體，
2)取500kg濕菌體用粉碎機(jī)破碎，經(jīng)沸騰干燥得233.1kg干菌體，沸騰干燥條件為：熱風(fēng)溫度120℃，物料溫度55℃，風(fēng)機(jī)頻率50Hz。
3)取50kg上述干燥的菌體，投入到1000L反應(yīng)釜中，加入1kg迷迭香(抗氧化劑)，并加入500L石油醚，用高剪切膠體磨循環(huán)破碎至菌體平均粒徑為231um，升溫至55℃攪拌萃取1h，經(jīng)沉降分離后，上層萃取液用5um袋式過(guò)濾器和0.5um濾棒過(guò)濾器過(guò)濾得到一萃萃取液，下層濕菌渣繼續(xù)加入500L石油醚，在55℃萃取1.5h，萃取混合液用5um袋式過(guò)濾器和0.5um濾棒過(guò)濾器過(guò)濾得到二萃萃取液和濕菌渣。
4)合并兩次萃取液，在48℃，-0.08MPa條件下蒸發(fā)結(jié)晶，得到結(jié)晶母液。
5)將結(jié)晶母液抽濾得到粗濕晶體，粗濕晶體用5L乙醇，再次抽濾得到濕晶體，濕晶體在80℃，-0.085MPa條件下，真空干燥2h，得到成品類(lèi)胡蘿卜素晶體。經(jīng)計(jì)算類(lèi)胡蘿卜素晶體的提取率為73.3%，經(jīng)檢測(cè)β-胡蘿卜素純度為98.1%。
6)按上述相同的工藝，不添加抗氧化劑進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)，經(jīng)計(jì)算β-胡蘿卜素晶體的提取率為62.9%，經(jīng)檢測(cè)β-胡蘿卜素純度為96.9%。
實(shí)施例9
以杜氏鹽藻為發(fā)酵菌種，依次按下列步驟操作：
1)將杜氏鹽藻接種發(fā)酵，將發(fā)酵液離心得到水量為75.9%濕菌體，
2)取1kg濕菌體，真空干燥得到267.3g干菌體，真空干燥條件為：溫度80℃，負(fù)壓-0.085MPa。
3)取200g上述干燥的菌體，加入到3L的四頸燒瓶中，并加入600mL二氯甲烷，用高速剪切機(jī)破碎至菌體平均粒徑為181um，抽濾得到一萃萃取液和濕菌渣，濕菌渣用2L二氯甲烷進(jìn)行二次萃取，抽濾得到二萃萃取液。
4)合并兩次萃取液，向其中加入0.2g維生素E(抗氧化劑)，在50℃，-0.08MPa條件下蒸發(fā)結(jié)晶，得到結(jié)晶母液。
5)將結(jié)晶母液抽濾得到濕晶體，濕晶體用50ml乙醇洗滌，再次抽濾得到濕晶體，濕晶體在80℃，-0.085MPa條件下，真空干燥2h，得到成品類(lèi)胡蘿卜素晶體。經(jīng)檢測(cè)，β-胡蘿卜素晶體的提取率為64.1%，經(jīng)檢測(cè)β-胡蘿卜素純度為97.3%。
6)按上述相同的工藝，不添加抗氧化劑進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)，經(jīng)計(jì)算β-胡蘿卜素晶體的提取率為60.9%，經(jīng)檢測(cè)β-胡蘿卜素純度為95.9%。
實(shí)施例10
以酵母為發(fā)酵菌種，依次按下列步驟操作：
1)將酵母接種發(fā)酵，將發(fā)酵液離心得到含水量為80.3%的濕菌體；
2)取上述10kg濕菌體，充分混合攪拌均勻，經(jīng)冷凍干燥得到2.1kg干菌體，冷凍干燥條件為：真空20Pa，捕集器溫度為-40℃，干燥20h。
3)取1kg干菌體，投入到30L的反應(yīng)釜中，再加入30L正己烷，用砂磨機(jī)循環(huán)破碎至菌體平均粒徑為300um，離心分離得到一萃萃取液和濕菌渣，濕菌渣繼續(xù)加入30L正己烷，在55℃萃取1h，離心得到二萃萃取液和濕菌渣。
4)合并一萃和二萃萃取液，加入50g二丁基羥基甲苯(抗氧化劑)，在43℃，-0.085MPa的條件下蒸發(fā)結(jié)晶，得到結(jié)晶母液。
5)將上述結(jié)晶母液離心分離得到濕晶體，濕晶體用250ml乙酸乙酯攪拌洗滌，再次離心得到濕晶體，濕晶體在80℃，-0.085MPa條件下真空干燥2h得到成品類(lèi)胡蘿卜素晶體。經(jīng)計(jì)算類(lèi)胡蘿卜晶體收率為69.1%，經(jīng)檢測(cè)β-胡蘿卜素純度為97.7%。
6)按上述相同的工藝，不添加抗氧化劑進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)，經(jīng)計(jì)算β-胡蘿卜素晶體的收率為63.3%，經(jīng)檢測(cè)β-胡蘿卜素純度為96.1%。
實(shí)施例11
以酵母為發(fā)酵菌種，依次按下列步驟操作：
1)將酵母接種發(fā)酵，將發(fā)酵液離心得到含水量為80.9%的濕菌體；
2)取上述50kg濕菌體，充分混合攪拌均勻，進(jìn)行噴霧干燥得到20.78kg干菌體，噴霧干燥條件為：熱風(fēng)溫度130℃，物料溫度65℃，風(fēng)機(jī)頻率為45Hz，進(jìn)料速度為5kg/h。
3)取5kg干菌體，投入到100L的反應(yīng)釜中，再加入50L正己烷，用砂磨機(jī)循環(huán)破碎至菌體平均粒徑為300um，離心分離得到一萃萃取液和濕菌渣，濕菌渣繼續(xù)加入50L正己烷，在55℃萃取1h，離心得到二萃萃取液和濕菌渣。
4)合并一萃和二萃萃取液，加入100g維生素C棕櫚酸酯(抗氧化劑)，在43℃，-0.085MPa的條件下蒸發(fā)結(jié)晶，得到結(jié)晶母液。
5)將上述結(jié)晶母液離心分離得到濕晶體，濕晶體用250ml正己烷攪拌洗滌，再次離心得到濕晶體，濕晶體在80℃，-0.085MPa條件下真空干燥2h得到成品類(lèi)胡蘿卜素晶體。經(jīng)計(jì)算類(lèi)胡蘿卜晶體收率為69.1%，經(jīng)檢測(cè)β-胡蘿卜素純度為97.7%。
6)按上述相同的工藝，不添加抗氧化劑進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)，經(jīng)計(jì)算β-胡蘿卜素晶體的收率為63.3%，經(jīng)檢測(cè)β-胡蘿卜素純度為96.1%。
實(shí)施例12
以三孢布拉霉菌種作為發(fā)酵菌種，依次按下列步驟操作：
1)將三孢布拉霉接種發(fā)酵，將發(fā)酵液經(jīng)板框壓濾后得到含水量為55.1%濕菌體，
2)取500kg濕菌體用粉碎機(jī)破碎，經(jīng)沸騰干燥得233.1kg干菌體，沸騰干燥條件為：熱風(fēng)溫度120℃，物料溫度55℃，風(fēng)機(jī)頻率50Hz。
3)取50kg上述干燥的菌體，投入到2000L反應(yīng)釜中，并加入1000L石油醚，用高剪切膠體磨循環(huán)破碎至菌體平均粒徑為231um，然后升溫至55℃，萃取1h，經(jīng)沉降分離后，上層萃取混合液用5um袋式過(guò)濾器和0.5um濾棒過(guò)濾器過(guò)濾得到一萃萃取液，向下層濕菌渣中繼續(xù)加入600L石油醚，在55℃萃取1.5h，萃取混合液用5um袋式過(guò)濾器和0.5um濾棒過(guò)濾器過(guò)濾得到二萃萃取液和濕菌渣。
4)合并兩次萃取液，加入2kg迷迭香(抗氧化劑)，在48℃，-0.08MPa條件下蒸發(fā)結(jié)晶，得到結(jié)晶母液。
5)將結(jié)晶母液抽濾得到粗濕晶體，粗濕晶體用10L乙酸乙酯洗滌，再次抽濾得到濕晶體，濕晶體在80℃，-0.085MPa條件下，真空干燥2h，得到成品類(lèi)胡蘿卜素晶體。經(jīng)計(jì)算類(lèi)胡蘿卜素晶體的提取率為73.1%，經(jīng)檢測(cè)β-胡蘿卜素純度為98.1%。
6)按上述相同的工藝，不添加抗氧化劑進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)，經(jīng)計(jì)算β-胡蘿卜素晶體的提取率為61.9%，經(jīng)檢測(cè)β-胡蘿卜素純度為96.9%。
實(shí)施例13
以三孢布拉霉菌種作為發(fā)酵菌種，依次按下列步驟操作：
1)將三孢布拉霉接種發(fā)酵，將發(fā)酵液經(jīng)板框壓濾后得到含水量為55.1%濕菌體，
2)取500kg濕菌體用粉碎機(jī)破碎，經(jīng)沸騰干燥得233.1kg干菌體，沸騰干燥條件為：熱風(fēng)溫度120℃，物料溫度55℃，風(fēng)機(jī)頻率50Hz。
7)取200kg上述干燥的菌體，投入到5000L反應(yīng)釜中，并加入2000L石油醚，用高剪切膠體磨循環(huán)破碎至菌體平均粒徑為231um，然后升溫至55℃，萃取1h，經(jīng)沉降分離后，上層萃取混合液用5um袋式過(guò)濾器和0.5um濾棒過(guò)濾器過(guò)濾得到一萃萃取液，向下層濕菌渣中繼續(xù)加入2000L石油醚，在55℃萃取1.5h，萃取混合液用5um袋式過(guò)濾器和0.5um濾棒過(guò)濾器過(guò)濾得到二萃萃取液和濕菌渣。
3)合并兩次萃取液，加入5kg對(duì)羥基苯甲酸乙酯(抗氧化劑)，在48℃，-0.08MPa條件下蒸發(fā)結(jié)晶，得到結(jié)晶母液。
4)將結(jié)晶母液抽濾得到粗濕晶體，粗濕晶體用500ml二氯甲烷洗滌，再次抽濾得到濕晶體，濕晶體在80℃，-0.085MPa條件下，真空干燥2h，得到成品類(lèi)胡蘿卜素晶體。經(jīng)計(jì)算類(lèi)胡蘿卜素晶體的提取率為73.3%，經(jīng)檢測(cè)β-胡蘿卜素純度為98.1%。
5)按上述相同的工藝，不添加抗氧化劑進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)，經(jīng)計(jì)算β-胡蘿卜素晶體的提取率為62.9%，經(jīng)檢測(cè)β-胡蘿卜素純度為96.9%。
實(shí)施例14
以杜氏鹽藻為發(fā)酵菌種，依次按下列步驟操作：
1)將杜氏鹽藻接種發(fā)酵，將發(fā)酵液離心得到水量為75.7%濕菌體，
2)取1kg濕菌體，加入0.5g二丁基羥基甲苯(抗氧化劑)，混合均勻，真空干燥得到261.3g干菌體，真空干燥條件為：溫度80℃，負(fù)壓-0.085MPa。
3)取200g上述干燥的菌體，加入到3L的四頸燒瓶中，再加入0.5g維生素E(抗氧化劑)，加入600mL二氯甲烷，用高速剪切機(jī)破碎至菌體平均粒徑為181um，抽濾得到一萃萃取液和濕菌渣，濕菌渣用2L二氯甲烷進(jìn)行二次萃取，抽濾得到二萃萃取液。
4)合并兩次萃取液，在50℃，-0.08MPa條件下蒸發(fā)結(jié)晶，得到結(jié)晶母液。
5)將結(jié)晶母液抽濾得到濕晶體，濕晶體用20ml二氯甲烷洗滌，再次抽濾得到濕晶體，濕晶體在80℃，-0.085MPa條件下，真空干燥2h，得到成品類(lèi)胡蘿卜素晶體。經(jīng)檢測(cè)，β-胡蘿卜素晶體的提取率為64.1%，經(jīng)檢測(cè)β-胡蘿卜素純度為97.3%。
6)按上述相同的工藝，不添加抗氧化劑進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)，經(jīng)計(jì)算β-胡蘿卜素晶體的提取率為60.9%，經(jīng)檢測(cè)β-胡蘿卜素純度為95.9%。
實(shí)施例15
以酵母為發(fā)酵菌種，依次按下列步驟操作：
1)將酵母接種發(fā)酵，將發(fā)酵液離心得到含水量為80.9%的濕菌體；
2)取上述10kg濕菌體，加入50gVc棕櫚酸酯(抗氧化劑)，充分混合攪拌均勻，進(jìn)行噴霧干燥得到2.18kg干菌體，噴霧干燥條件為：熱風(fēng)溫度130℃，物料溫度65℃，風(fēng)機(jī)頻率為45Hz，進(jìn)料速度為5kg/h。
3)取2kg干菌體，投入到50L的反應(yīng)釜中，再加入20L正己烷，用砂磨機(jī)循環(huán)破碎至菌體平均粒徑為300um，再在550攪拌萃取1h，離心分離得到一萃萃取液和濕菌渣，濕菌渣繼續(xù)加入20L正己烷，在55℃萃取1h，離心得到二萃萃取液和濕菌渣。
4)合并一萃和二萃萃取液，加入50g迷迭香(抗氧化劑)，在43℃，-0.085MPa的條件下蒸發(fā)結(jié)晶，得到結(jié)晶母液。
5)將上述結(jié)晶母液離心分離得到濕晶體，濕晶體用250ml正己烷攪拌洗滌，再次離心得到濕晶體，濕晶體在80℃，-0.085MPa條件下真空干燥2h得到成品類(lèi)胡蘿卜素晶體。經(jīng)計(jì)算類(lèi)胡蘿卜晶體收率為69.1%，經(jīng)檢測(cè)β-胡蘿卜素純度為97.7%。
6)按上述相同的工藝，不添加抗氧化劑進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)，經(jīng)計(jì)算β-胡蘿卜素晶體的收率為63.3%，經(jīng)檢測(cè)β-胡蘿卜素純度為96.1%。
實(shí)施例16
以三孢布拉霉菌種作為發(fā)酵菌種，依次按下列步驟操作：
1)將三孢布拉霉接種發(fā)酵，將發(fā)酵液經(jīng)板框壓濾后得到含水量為55.1%濕菌體，
2)取50kg濕菌體用粉碎機(jī)破碎，經(jīng)沸騰干燥得23.1kg干菌體，沸騰干燥條件為：熱風(fēng)溫度120℃，物料溫度55℃，風(fēng)機(jī)頻率50Hz。
3)取10kg上述干燥的菌體，投入到200L反應(yīng)釜中，再加入250g對(duì)羥基苯甲酸乙酯(抗氧化劑)，并加入100L石油醚，用高剪切膠體磨循環(huán)破碎至菌體平均粒徑為231um，然后升溫至55℃，萃取1h，經(jīng)沉降分離后，上層萃取混合液用5um袋式過(guò)濾器和0.5um濾棒過(guò)濾器過(guò)濾得到一萃萃取液，向下層濕菌渣中繼續(xù)加入100L石油醚，在55℃萃取1.5h，萃取混合液用5um袋式過(guò)濾器和0.5um濾棒過(guò)濾器過(guò)濾得到二萃萃取液和濕菌渣。
4)合并兩次萃取液，加入250g維生素E(抗氧化劑)，在48℃，-0.08MPa條件下蒸發(fā)結(jié)晶，得到結(jié)晶母液。
5)將結(jié)晶母液抽濾得到粗濕晶體，粗濕晶體用2L二氯甲烷洗滌，再次抽濾得到濕晶體，濕晶體在80℃，-0.085MPa條件下，真空干燥2h，得到成品類(lèi)胡蘿卜素晶體。經(jīng)計(jì)算類(lèi)胡蘿卜素晶體的提取率為73.3%，經(jīng)檢測(cè)β-胡蘿卜素純度為98.1%。
6)按上述相同的工藝，不添加抗氧化劑進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)，經(jīng)計(jì)算β-胡蘿卜素晶體的提取率為62.9%，經(jīng)檢測(cè)β-胡蘿卜素純度為96.9%。
實(shí)施例17
以三孢布拉霉菌種作為發(fā)酵菌種，依次按下列步驟操作：
7)將三孢布拉霉接種發(fā)酵，將發(fā)酵液經(jīng)板框壓濾后得到含水量為55.1%濕菌體，
8)取500kg濕菌體用粉碎機(jī)破碎，加入2.5kg二丁基強(qiáng)基甲苯(抗氧化劑)，混合均勻，經(jīng)沸騰干燥得233.1kg干菌體，沸騰干燥條件為：熱風(fēng)溫度120℃，物料溫度55℃，風(fēng)機(jī)頻率50Hz。
8)取200kg上述干燥的菌體，投入到5000L反應(yīng)釜中，加入1kg維生素E(抗氧化劑)，并加入2000L石油醚，用高剪切膠體磨循環(huán)破碎至菌體平均粒徑為231um，然后升溫至55℃，萃取1h，經(jīng)沉降分離后，上層萃取混合液用5um袋式過(guò)濾器和0.5um濾棒過(guò)濾器過(guò)濾得到一萃萃取液，向下層濕菌渣中繼續(xù)加入2000L石油醚，在55℃萃取1.5h，萃取混合液用5um袋式過(guò)濾器和0.5um濾棒過(guò)濾器過(guò)濾得到二萃萃取液和濕菌渣。
9)合并兩次萃取液，加入1kg對(duì)羥基苯甲酸乙酯(抗氧化劑)，在48℃，-0.08MPa條件下蒸發(fā)結(jié)晶，得到結(jié)晶母液。
10)將結(jié)晶母液抽濾得到粗濕晶體，粗濕晶體用500ml二氯甲烷洗滌，再次抽濾得到濕晶體，濕晶體在80℃，-0.085MPa條件下，真空干燥2h，得到成品類(lèi)胡蘿卜素晶體。經(jīng)計(jì)算類(lèi)胡蘿卜素晶體的提取率為80.1%，經(jīng)檢測(cè)β-胡蘿卜素純度為99.1%。
11)按上述相同的工藝，不添加抗氧化劑進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)，經(jīng)計(jì)算β-胡蘿卜素晶體的提取率為61.9%，經(jīng)檢測(cè)β-胡蘿卜素純度為96.9%。
本發(fā)明制備β-胡蘿卜素的方法具有以下有益效果：在干燥、固液分離和蒸發(fā)結(jié)晶的步驟中，部分或者全部添加抗氧化劑，降低了提取過(guò)程中β-胡蘿卜素的損失，提升了β-胡蘿卜素的收率，同時(shí)制得的β-胡蘿卜素晶體純度更高，品質(zhì)更好。
本發(fā)明中所提及的抗氧化劑，不局限于實(shí)施例中所列舉的類(lèi)型，其他在使用中具有相同效果的產(chǎn)品均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。