本發(fā)明涉及生物制劑技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種蝦青素亞麻酸單酯的制備方法。

背景技術(shù)：

雨生紅球藻是一種廣泛分布于自然界的淡水藻，屬于綠藻門、綠藻綱、團(tuán)藻目、紅球藻科、紅球藻屬。雨生紅球藻通常只有處于脅迫條件時(shí)才開始積累蝦青素，以渡過不利的環(huán)境條件。關(guān)于雨生紅球藻積累蝦青素的營養(yǎng)鹽及環(huán)境條件的研究表明，當(dāng)其處于氮饑餓、高光強(qiáng)等條件下時(shí)，能夠大量積累蝦青素。近年來，光生物反應(yīng)器技術(shù)的發(fā)展大大促進(jìn)了雨生紅球藻的養(yǎng)殖及蝦青素的積累，應(yīng)用這種技術(shù)可使藻體中蝦青素含量達(dá)到干重的1.5-3％。

從雨生紅球藻中提取蝦青素的方法多種多樣，歐陽琴等對雨生紅球藻厚壁孢子細(xì)胞的幾種常用機(jī)械破壁方法的工藝條件分別進(jìn)行研究，分別比較了幾種不同破壁方法對破壁率和蝦青素提取率的影響，結(jié)果表明高壓均質(zhì)法最適合于雨生紅球藻中厚壁孢子的破碎和蝦青素的提取，氯仿:乙醇(1:1，v/v)的混合溶劑最有利于從雨生紅球藻孢子態(tài)細(xì)胞中提取出蝦青素。Dong等人比較了4種不同的方法從雨生紅球藻中提取蝦青素，結(jié)果表明鹽酸破壁后用丙酮提取的得率最高，且這種方法得到的粗提物的DPPH自由基清除能力也最高。周錦珂以雨生紅球藻粉為原料利用纖維素酶對雨生紅球藻進(jìn)行酶解處理，然后用乙醇提取蝦青素，在最佳條件下蝦青素的提取率高達(dá)94.6％。

蝦青素末端環(huán)狀結(jié)構(gòu)中各有一個(gè)羥基(-OH)，這種自由羥基可與脂肪酸形成酯，雨生紅球藻中的蝦青素多數(shù)以酯的形式存在。如果其中一個(gè)羥基與脂肪酸成酯，稱蝦青素單酯；如果兩個(gè)羥基都與脂肪酸成酯，則稱為蝦青素雙酯。在魚類吸收和色素沉積方面，蝦青素酯和游離蝦青素在生物利用方面差別很小。由于能夠與蝦青素酯化形成蝦青素單酯和雙酯的脂肪酸種類繁多，而且蝦青素酯的極性比蝦青素更小，且各類蝦青素酯的結(jié)構(gòu)極性相近，很難將單獨(dú)一種蝦青素酯分離純化出來；采用傳統(tǒng)柱層析法分離純化蝦青素酯，耗時(shí)長且得率很低，不利于大量制備純的蝦青素酯。因此，對蝦青素酯分離純化的研究鮮見報(bào)道。有鑒于此，本發(fā)明人研究和設(shè)計(jì)了一種蝦青素亞麻酸單酯的制備方法，本案由此產(chǎn)生。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種蝦青素亞麻酸單酯的制備方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案是：

一種蝦青素亞麻酸單酯的制備方法，包括以下步驟：

步驟一、粗提液的制備：

用天平稱取5.0g雨生紅球藻藻粉，加入濃度為0.5-0.7mg/mL的纖維素酶液200mL，酶反應(yīng)pH為4.0-5.0，在45-50℃的條件下破壁25-30min，然后在5000rpm條件下離心5min，棄上清后，將500mL的丙酮加入藻粉中，浸提40min，再次離心后，棄去下層沉淀，制得粗提液；將所述粗提液濃縮蒸干，充氮，于-20℃條件下保存，備用；

步驟二、溶劑系統(tǒng)的建立：

按體積比4:1:2配制正己烷-乙腈-甲醇一級溶劑系統(tǒng)和按體積比2:1配制正己烷-甲醇二級溶劑系統(tǒng)；每個(gè)溶劑系統(tǒng)分別按照上述比例配制溶液1500mL，置于分液漏斗中，劇烈振蕩充分混合后靜置分層，平衡后將上下兩相分開，兩個(gè)溶劑系統(tǒng)均以下相作為流動相，上相作為固定相，在使用前上下相分別超聲脫氣30min；

步驟三、高速逆流色譜純化：

打開泵，將超聲脫氣后的上相作為固定相以30mL/min的流速泵入到高速逆流色譜儀中，直至上相充滿整個(gè)HSCCC分離管中，暫停泵，將進(jìn)液端放到流動相的試劑瓶中，打開主機(jī)的電源，設(shè)定轉(zhuǎn)速850r/min，啟動泵；在出液端用干凈的量筒接液，在474nm波長下采集數(shù)據(jù)，首先以所述一級溶劑系統(tǒng)為實(shí)驗(yàn)條件，收集洗脫時(shí)間為12-20min的組分，再以二級溶劑系統(tǒng)為實(shí)驗(yàn)條件，將該組分溶解在二級溶劑系統(tǒng)的下相中，收集洗脫時(shí)間為40-48min的組分，初步用TLC分析流出物，合并相同組分，制得化合物，即蝦青素亞麻酸單酯。

作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，還包括步驟四、純化物的鑒定：采用高效液相色譜HPLC法或采用ESI-MS法分析所述化合物，或采用高效液相色譜HPLC法分析皂化后的所述化合物。

作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，所述采用高效液相色譜HPLC法：將所述化合物配成2mg/mL的樣品溶液，高效液相的條件：進(jìn)樣量5μL，柱溫35℃，檢測波長474nm，流速0.2mL/min；分析所述化合物的保留時(shí)間和特征吸收峰，判斷所述述化合物的保留時(shí)間是否為45.5min，特征吸收峰是否為447nm。

作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，所述ESI-MS法采用正離子模式；參數(shù)設(shè)置如下：氮?dú)飧稍锪髁?0.0L/min，霧化壓力為20psi，毛細(xì)管電壓+5000V，端板電壓+4000V，毛細(xì)管出口電壓80V，干燥溫度200℃，霧化室溫度50℃，干燥氣體壓力20psi，霧化氣體壓力50psi；判斷一級質(zhì)譜m/z是否為m/z 857.8和m/z 879.9。

作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，采用高效液相色譜HPLC法分析皂化后的所述化合物：將所述化合物12.5mg溶解在150mL的二氯甲烷溶液中，作為每組試驗(yàn)的樣品溶液，然后加入含質(zhì)量體積濃度為15.6％的NaOH的甲醇溶液，在磁力攪拌條件下，15.14℃溫度下反應(yīng)9.17min后，終止反應(yīng)；加入蒸餾水直至溶液出現(xiàn)分層，上層漂浮有白色泡沫，下層呈紅色的澄清溶液，離心棄去上清后，將下層溶液完全蒸干得到皂化產(chǎn)物，用HPLC法分析產(chǎn)物的保留時(shí)間和特征吸收峰，判斷皂化后的所述述化合物的保留時(shí)間是否為13min。

作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，所述步驟一中，加入濃度為0.6mg/mL的纖維素酶液200mL，在50℃的條件下破壁30min。

本發(fā)明首次采用高速逆流色譜純化法從雨生紅球藻藻粉分離得到了蝦青素亞麻酸單酯，進(jìn)一步采用HPLC和ESI-MS技術(shù)鑒定純化得到的化合物的結(jié)構(gòu)，從而對后續(xù)蝦青素酯的研究具有重大意義。

說明書附圖

圖1為本發(fā)明雨生紅球藻中粗提物的HPLC分析圖；

圖2為本發(fā)明的HSCCC溶劑系統(tǒng)純化結(jié)果；

圖3為本發(fā)明的HSCCC二級溶劑系統(tǒng)純化結(jié)果；

圖4為本發(fā)明HPLC和UVS分析HSCCC純化得到的組分3結(jié)果；

圖5為本發(fā)明一級質(zhì)譜分析HSCCC純化得到的組分3結(jié)果；

圖6為本發(fā)明二級質(zhì)譜分析組分3結(jié)果；

圖7為本發(fā)明HPLC分析皂化后的組分3結(jié)果。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明公開了一種蝦青素亞麻酸單酯的制備方法，包括以下步驟：

步驟一、粗提液的制備：

用天平稱取5.0g雨生紅球藻藻粉，雨生紅球藻藻粉購于湖北雅仕達(dá)生物技術(shù)荊州市天然蝦青素有限公司，加入濃度為0.5-0.7mg/mL的纖維素酶液200mL，酶反應(yīng)pH為4.0-5.0，在45-50℃的條件下破壁25-30min，然后在5000rpm條件下離心5min，棄上清后，將500mL的丙酮加入藻粉中，浸提40min，再次離心后，棄去下層沉淀，制得粗提液；將所述粗提液濃縮蒸干，充氮，于-20℃條件下保存，備用；步驟二、溶劑系統(tǒng)的建立：

按體積比4:1:2配制正己烷-乙腈-甲醇一級溶劑系統(tǒng)和按體積比2:1配制正己烷-甲醇二級溶劑系統(tǒng)；每個(gè)溶劑系統(tǒng)分別按照上述比例配制溶液1500mL，置于分液漏斗中，劇烈振蕩充分混合后靜置分層，平衡后將上下兩相分開，兩個(gè)溶劑系統(tǒng)均以下相作為流動相，上相作為固定相，在使用前上下相分別超聲脫氣30min；

高速逆流色譜法分離的效果，很大程度上取決于選擇一個(gè)合適的兩相溶劑體系，兩相溶劑體系可以用分離系數(shù)K來定量測定。若K值太小，溶質(zhì)將接近洗脫溶劑的前沿造成出峰時(shí)間太快，峰之間的分離度較差；當(dāng)K值過大時(shí)，分離度較好但是出峰時(shí)間太長，并且峰形變寬，分離效率同樣不高。因此實(shí)驗(yàn)中要試驗(yàn)不同的溶劑體系，從而在合適的時(shí)間內(nèi)得到分離度很好的峰形。

本文在選擇溶劑系統(tǒng)的過程中，首先嘗試了正己烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、水這幾種常見溶劑的的不同組成和配比，來滿足合適的分離系數(shù)K。如表1所示，例如溶劑組成為正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1:1:1:1，v/v/v/v)和正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水(6:3:2:5，v/v/v/v)的兩種溶劑系統(tǒng)在試驗(yàn)后被排除，因?yàn)榈玫終值過大，并且保留率和分離效果也不好。在參考相關(guān)文獻(xiàn)之后，考慮到蝦青素酯的極性比蝦青素更小，已不適用于有水的體系分離，因此更適合于非水溶劑體系進(jìn)行分離。如表1中正己烷-二氯甲烷-丙酮溶劑體系，雖然極性較小，但當(dāng)二氯甲烷加入后，由于幾種溶劑極性相近和密度差的減小，使上述溶液上下相混溶，不能很好地分層。通過對十余種不同有機(jī)溶劑的組成和比例的溶劑體系進(jìn)行試驗(yàn)后，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)加入乙腈時(shí)能使非水相的溶劑體系有很好的分層效果，最后選擇溶劑比例為正己烷-乙腈-甲醇(4:1:2，v/v/v)作為一級溶劑系統(tǒng)，正己烷-甲醇(2:1，v/v)作為第二級溶劑系統(tǒng)來分離純化蝦青素酯。

表1蝦青素酯在不同兩相溶劑系統(tǒng)中的分離系數(shù)K值

步驟三、高速逆流色譜純化：

打開泵，將超聲脫氣后的上相作為固定相以30mL/min的流速泵入到高速逆流色譜儀中，直至上相充滿整個(gè)HSCCC分離管中，暫停泵，將進(jìn)液端放到流動相的試劑瓶中，打開主機(jī)的電源，設(shè)定轉(zhuǎn)速850r/min，啟動泵；在出液端用干凈的量筒接液，在474nm波長下采集數(shù)據(jù)，首先以所述一級溶劑系統(tǒng)為實(shí)驗(yàn)條件，收集洗脫時(shí)間為12-20min的組分；再以二級溶劑系統(tǒng)為實(shí)驗(yàn)條件，將該組分溶解在二級溶劑系統(tǒng)的下相中，收集洗脫時(shí)間為40-48min的組分，初步用TLC分析流出物，合并相同組分，制得化合物，即蝦青素亞麻酸單酯。

作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，所述步驟一中，加入濃度為0.6mg/mL的纖維素酶液200mL，在50℃的條件下破壁30min。

作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，還包括步驟四、純化物的鑒定：采用高效液相色譜HPLC法或采用ESI-MS法分析所述化合物，或采用高效液相色譜HPLC法分析皂化后的所述化合物。

由于已知的蝦青素酯種類較多且與之酯化結(jié)合的脂肪酸鑒定比較困難，為進(jìn)一步鑒定純化得到的化合物是否為蝦青素酯，需要對得到的化合物進(jìn)行皂化實(shí)驗(yàn)，將蝦青素酯皂化還原為蝦青素，若皂化后產(chǎn)物在HPLC檢測后，得到蝦青素的特征吸收峰，則證明純化得到的化合物為蝦青素酯，反之，則為其他類胡蘿卜素。

作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，所述采用高效液相色譜HPLC法：將所述化合物配成2mg/mL的樣品溶液，高效液相的條件：進(jìn)樣量5μL，柱溫35℃，檢測波長474nm，流速0.2mL/min；分析所述化合物的保留時(shí)間和特征吸收峰，判斷所述述化合物的保留時(shí)間是否為45.5min，特征吸收峰是否為447nm。

雨生紅球藻中粗提物各組分的HPLC分析結(jié)果如圖1所示。其中數(shù)字1-6代表HSCCC分離得到的6個(gè)化合物，從圖中可以看出，游離類胡蘿卜素的保留時(shí)間為12-35min，蝦青素單酯的保留時(shí)間集中在42-50min，而蝦青素雙酯的保留時(shí)間在55min之后。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與各化合物的極性大小是相對應(yīng)的，游離的類胡蘿卜素，如蝦青素、角黃素、葉黃素等的極性相對較大，因而洗脫時(shí)間較短；蝦青素一端被酯化后，成為蝦青素單酯，極性變小，洗脫時(shí)間相應(yīng)的增加；蝦青素兩端被酯化后，變成蝦青素雙酯，分子極性進(jìn)一步變小，洗脫時(shí)間最長。

如圖2所示，使用HSCCC溶劑體系，粗提物溶液分離純化得到了4個(gè)組分，洗脫時(shí)間分別為22-27min、31-40min、102-104min、103-111min，分別將它們命名為化合物1、2、5、6(與圖2中各個(gè)峰相對應(yīng))，并且發(fā)現(xiàn)分離得到峰A(12-20min)的量很大(25.51mg)，也當(dāng)做一個(gè)組分收集以備下一步純化。使用二級溶劑體系正己烷-甲醇(2:1，v/v)，將之前得到的峰A組分溶解在此溶劑體系的下相中，作為二級溶劑系統(tǒng)的樣品溶液，繼續(xù)純化得到了化合物3和化合物4，結(jié)果如圖3所示，洗脫時(shí)間分別為40-48min和52-60min。將上述純化得到的化合物蒸干后稱量，得到化合物1-6的質(zhì)量分別為10.35mg、8.47mg、15.25mg、4.33mg、15.65mg、6.05mg。

作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，所述ESI-MS法采用正離子模式；參數(shù)設(shè)置如下：氮?dú)飧稍锪髁?0.0L/min，霧化壓力為20psi，毛細(xì)管電壓+5000V，端板電壓+4000V，毛細(xì)管出口電壓80V，干燥溫度200℃，霧化室溫度50℃，干燥氣體壓力20psi，霧化氣體壓力50psi；判斷一級質(zhì)譜m/z是否為m/z 857.8和m/z 879.9。

作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，采用高效液相色譜HPLC法分析皂化后的所述化合物：將所述化合物12.5mg溶解在150mL的二氯甲烷溶液中，作為每組試驗(yàn)的樣品溶液，然后加入含質(zhì)量體積濃度為15.6％的NaOH的甲醇溶液，在磁力攪拌條件下，15.14℃溫度下反應(yīng)9.17min后，終止反應(yīng)；加入蒸餾水直至溶液出現(xiàn)分層，上層漂浮有白色泡沫，下層呈紅色的澄清溶液，離心棄去上清后，將下層溶液完全蒸干得到皂化產(chǎn)物，用HPLC法分析產(chǎn)物的保留時(shí)間和特征吸收峰，判斷皂化后的所述述化合物的保留時(shí)間是否為13min。

化合物3為紅色固體粉末，在447nm處有最大的紫外吸收，HPLC分析化合物3的保留時(shí)間為45.5min，結(jié)果如圖4所示；化合物3的一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)顯示m/z 857.8和m/z 879.9，結(jié)果如圖5所示，推斷這兩個(gè)離子峰分別為蝦青素亞麻酸單酯的分子離子峰[M+H]+和蝦青素亞麻酸單酯的[M+Na]+離子峰，進(jìn)一步的二級串聯(lián)質(zhì)譜分析可以看到m/z 579.3和m/z 261.3，結(jié)果如圖6所示，這兩個(gè)分別為分子離子峰失去亞麻酸后的碎片離子[MH-C18:3(278)]+和亞麻酸失去OH-后的碎片離子[C18:3(278)-OH+H]+；化合物3的皂化后的產(chǎn)物HPLC分析結(jié)果顯示，皂化后在保留時(shí)間13min出現(xiàn)了蝦青素的特征峰，結(jié)果如圖7所示；由此可以鑒定化合物3是蝦青素亞麻酸單酯。

本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。