本發(fā)明涉及生物
技術領域：
。具體地說，本發(fā)明涉及具有賴氨酸脫羧酶活性的蛋白以及包含該蛋白編碼基因的表達載體和能夠表達該蛋白的基因工程菌在生產1,5-戊二胺中的應用。
背景技術：
：1,5-戊二胺，又名尸胺、1,5-二氨基戊烷、五亞甲基二胺和尸毒素，是生物體內廣泛存在的具有生物活性的含氮堿，是賴氨酸在賴氨酸脫羧酶(e.c.4.1.1.18)的作用下脫羧產生的，反應為l-lysine+h+→co2+cadaverine。1,5-戊二胺具有多種用途。例如，在農業(yè)上，1,5-戊二胺可用于調控植物衰老過程、促進雌雄蕊的發(fā)育、改善植物果實發(fā)育、提高果實產量。在醫(yī)學上，它可作為一種有效治療痢疾的藥物，也是一種重要的藥物中間體。在工業(yè)上，1,5-戊二胺是一種重要的化工原料；將1,5-戊二胺與二元酸進行聚合反應可合成優(yōu)質高分子材料——新型尼龍。尼龍66是由己二胺和己二酸1:1聚合生成，與尼龍6同為尼龍兩大品種之一。目前，己二胺的合成仍然依賴于石油化工路線，己二胺及其前體己二腈主要依賴進口。隨著石油資源逐漸枯竭，石油資源消耗帶來的溫室效應、環(huán)境污染等問題日益突出，綠色可持續(xù)發(fā)展的呼聲不斷升高，人們試圖尋找一種用生物路線生產己二胺或其替代物、最終用可再生資源替代石油原料來生產尼龍的新方法。1,5-戊二胺與己二胺互為同系物，在結構上與己二胺非常相似，可以和二元酸共聚合成具有實用性的尼龍5x(尼龍54、尼龍56、尼龍510等)。例如，尼龍56是一種新型尼龍，與尼龍66一樣具有良好的機械強度、較高的熔點和耐各種溶劑的特性，可以替代尼龍66使用，而且尼龍56觸感宜人，如棉一樣吸濕透氣，顯示出開發(fā)高舒適性服裝的前景。尼龍54和尼龍510等其它以1,5-戊二胺為單體制成的尼龍產品則具有特殊的材料性能，具有潛在的應用價值。非?？上驳氖牵?,5-戊二胺可以用可再生生物質為原料，通過生物合成路線進行合成。賴氨酸脫羧酶催化賴氨酸脫羧形成1,5-戊二胺，是1,5-戊二胺生物合成途徑中的關鍵酶。賴氨酸脫羧酶存在于各種微生物中。目前，已經分別從大腸桿菌(e.coli)、蜂房哈夫尼菌(hafniaalvei)、反芻動物月形單胞菌(selenomonasruminantium)、鼠傷寒沙門氏菌(salmonellatyphimurium)和鮰愛德華氏菌(edwardsiellaictaluri)等細菌中克隆出賴氨酸脫羧酶基因。目前，主要是來源于大腸桿菌的兩種賴氨酸脫羧酶cada和ldcc用于1,5-戊二胺的生產或研究。日本味之素公司的us7189543專利以二羧酸調節(jié)ph并通過細胞過表達大腸桿菌的cada酶轉化賴氨酸產生1,5-戊二胺，最高產量達69g/l；上海凱賽在其專利cn102851307a和cn201410004636.3中改造了蜂房哈夫尼菌，過量表達大腸桿菌cada酶來催化賴氨酸生產1,5-戊二胺，催化溫度為50℃，賴氨酸鹽酸鹽濃度為450g/kg，并調節(jié)賴氨酸底物初始ph為6.0，菌體用量為42.75g/l(細胞干重)，催化48h產生251g/kg的1,5-戊二胺。younghoon等人采用e.colixl1-blue工程菌過表達ldcc，控制初始菌體od600＝50，賴氨酸初始濃度為200g/l，并調節(jié)賴氨酸底物初始ph為6.8，催化溫度為37℃，經過120小時催化后最終獲得133.75g/l的戊二胺(ohyhetal2015)?，F(xiàn)有的大腸桿菌的兩個酶均有不足之處。cada的最適ph約為5.5，當ph高于6.5活性快速下降，當ph提高到8.0時，它的活力幾乎完全喪失(lemonnierandlane1998)。由于1,5-戊二胺是較強的堿性物質，在賴氨酸脫羧轉變?yōu)?,5-戊二胺時ph會升高，要維持賴氨酸脫羧酶的催化活力，需要加入大量的酸進行中和，這會導致成本的增加并最終產生無機鹽廢棄物。同時受反應器混合特性制約或受細胞內外環(huán)境的非均一特性影響，反應效率會由于局部ph過高而下降。如果使用具有高ph耐受特性的賴氨酸脫羧酶，1,5-戊二胺的生物合成路線將會效率更高，更加環(huán)保，更加有成本競爭力。另一方面，雖然ldcc的最適ph相對較高，約為7.6，并在ph6-8之間都具有較高活性，但它的熱穩(wěn)定性很差，當溫度超過37℃時，隨著溫度升高酶活性快速下降(lemonnierandlane1998)。由于酶的穩(wěn)定性與酶的用量、工藝成本直接相關，因而ldcc也不是一個理想的1,5-戊二胺生產用酶。綜上所述，本領域急需ph穩(wěn)定、溫度穩(wěn)定的賴氨酸脫羧酶用于1,5-戊二胺生物合成。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種能夠從賴氨酸產生1,5-戊二胺的方法以及用于該方法中的賴氨酸脫羧酶，并且所述賴氨酸脫羧酶能夠具備優(yōu)異的ph穩(wěn)定性和溫度穩(wěn)定性。在第一方面，本發(fā)明提供一種生產1,5-戊二胺的方法，所述方法包括以下步驟：1)利用以下蛋白或能夠表達以下蛋白的宿主細胞產生1,5-戊二胺；和2)從1)的體系中獲得1,5-戊二胺；所述蛋白是：(a)氨基酸序列如seqidno:1-2中任意所示的蛋白；或(b)由seqidno:1-2中任一所示氨基酸序列經過一個或數(shù)個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的且具有(a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。在優(yōu)選的實施方式中，所述蛋白或所述宿主細胞催化賴氨酸脫羧反應，從而產生1,5-戊二胺。在具體的實施方式中，(b)所述的衍生蛋白是由seqidno:1-2中任一所示氨基酸序列經過1-30個，更優(yōu)選1-10個，還要優(yōu)選1-6個，最優(yōu)選1-3個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的且具有(a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。在具體的實施方式中，(b)所述的衍生蛋白是由seqidno:1-2中任一所示氨基酸序列經過1-30個，更優(yōu)選1-10個，還要優(yōu)選1-6個，最優(yōu)選1-3個氨基酸殘基的缺失或添加而形成的且具有(a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。在具體的實施方式中，(b)所述的衍生蛋白是在seqidno:1-2中任一所示氨基酸序列的c末端和/或n末端添加或缺失1-50個、優(yōu)選1-30個，更優(yōu)選1-10個，還要優(yōu)選1-6個，最優(yōu)選1-3個氨基酸殘基而形成的且具有(a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。在具體的實施方式中，所述蛋白是氨基酸序列如seqidno:1或seqidno:2所示的蛋白。在優(yōu)選的實施方式中，所述宿主細胞是大腸桿菌(e.coli)、谷氨酸棒桿菌(corynebacteriumglutamicum)、蜂房哈夫尼菌(hafniaalvei)、枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)；更優(yōu)選地，所述宿主細胞是大腸桿菌(e.coli)。在具體的實施方式中，所述方法在ph5.0-8.5；優(yōu)選地，在ph6-8；更優(yōu)選地，在ph6.5-7.5下進行。在優(yōu)選的實施方式中，所述蛋白的最適ph在5.0-8.5；優(yōu)選地，所述蛋白的最適ph在6-8；更優(yōu)選地，所述蛋白的最適ph在6.5-7.5。在優(yōu)選的實施方式中，所述蛋白在ph從5.0-8.5的范圍內能夠保持40％以上的相對酶活；優(yōu)選地，所述蛋白在ph從6.0-8.0的范圍內能夠保持70％以上的相對酶活；最優(yōu)選地，所述蛋白在ph從6.5-7.5的范圍內能夠保持90％以上的相對酶活。在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的蛋白在37℃孵育12h后，剩余的相對比酶活高于80％；在50℃孵育12h后，本發(fā)明的蛋白剩余的相對比酶活高于45％。在優(yōu)選的實施方式中，所述生產1,5-戊二胺的方法是以賴氨酸為前體生產1,5-戊二胺。在具體的實施方式中，所述方法在30-60℃的溫度范圍內；優(yōu)選在37-50℃的溫度范圍內；更優(yōu)選在37℃進行。在第二方面，本發(fā)明提供以下蛋白、或包含編碼以下蛋白的核苷酸序列的表達載體、或能夠表達以下蛋白的宿主細胞的用途，用于生產1,5-戊二胺，所述蛋白為：(a)氨基酸序列如seqidno:1-2中任意所示的蛋白；或(b)由seqidno:1-2中任一所示氨基酸序列經過一個或數(shù)個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的且具有(a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。在優(yōu)選的實施方式中，所述蛋白或所述表達載體或所述宿主細胞用于催化賴氨酸產生1,5-戊二胺。在優(yōu)選的實施方式中，(b)所述的衍生蛋白是由seqidno:1-2中任一所示氨基酸序列經過1-30個，更優(yōu)選1-10個，還要優(yōu)選1-6個，最優(yōu)選1-3個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的且具有(a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。在優(yōu)選的實施方式中，(b)所述的衍生蛋白是由seqidno:1-2中任一所示氨基酸序列經過1-30個，更優(yōu)選1-10個，還要優(yōu)選1-6個，最優(yōu)選1-3個氨基酸殘基的缺失或添加而形成的且具有(a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。在優(yōu)選的實施方式中，(b)所述的衍生蛋白是在seqidno:1-2中任一所示氨基酸序列的c末端和/或n末端添加或缺失1-30個，更優(yōu)選1-10個，還要優(yōu)選1-6個，最優(yōu)選1-3個氨基酸殘基而形成的且具有(a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。在優(yōu)選的實施方式中，所述蛋白是氨基酸序列如seqidno:1所示的蛋白。在優(yōu)選的實施方式中，所述宿主細胞是大腸桿菌(e.coli)、谷氨酸棒桿菌(corynebacteriumglutamicum)、蜂房哈夫尼菌(hafniaalvei)、枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)；更優(yōu)選地，所述宿主細胞是大腸桿菌(e.coli)。在優(yōu)選的實施方式中，所述蛋白的最適ph在5.0-8.5；優(yōu)選地，所述蛋白的最適ph在6-8；更優(yōu)選地，所述蛋白的最適ph在6.5-7.5。在第三方面，本發(fā)明提供一種表達載體，所述表達載體包含編碼以下蛋白的核苷酸序列：(a)氨基酸序列如seqidno:1-2中任意所示的蛋白；或(b)由seqidno:1-2中任一所示氨基酸序列經過一個或數(shù)個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的且具有(a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。在優(yōu)選的實施方式中，(b)所述的衍生蛋白是由seqidno:1-2中任一所示氨基酸序列經過1-30個，更優(yōu)選1-10個，還要優(yōu)選1-6個，最優(yōu)選1-3個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的且具有(a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。在優(yōu)選的實施方式中，(b)所述的衍生蛋白是由seqidno:1-2中任一所示氨基酸序列經過1-30個，更優(yōu)選1-10個，還要優(yōu)選1-6個，最優(yōu)選1-3個氨基酸殘基的缺失或添加而形成的且具有(a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。在優(yōu)選的實施方式中，(b)所述的衍生蛋白是在seqidno:1-2中任一所示氨基酸序列的c末端和/或n末端添加或缺失1-30個，更優(yōu)選1-10個，還要優(yōu)選1-6個，最優(yōu)選1-3個氨基酸殘基而形成的且具有(a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。在優(yōu)選的實施方式中，所述蛋白的最適ph在5.0-8.5；優(yōu)選地，所述蛋白的最適ph在6-8；更優(yōu)選地，所述蛋白的最適ph在6.5-7.5。在優(yōu)選的實施方式中，所述蛋白是氨基酸序列如seqidno:1所示的蛋白。在第四方面，本發(fā)明提供一種宿主細胞，所述宿主細胞能夠表達以下蛋白，所述蛋白是：(a)氨基酸序列如seqidno:1-2中任一所示的蛋白；或(b)由seqidno:1-2中任一所示氨基酸序列經過一個或數(shù)個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的且具有(a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。在優(yōu)選的實施方式中，(b)所述的衍生蛋白是由seqidno:1-2中任一所示氨基酸序列經過1-30個，更優(yōu)選1-10個，還要優(yōu)選1-6個，最優(yōu)選1-3個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的且具有(a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。在優(yōu)選的實施方式中，(b)所述的衍生蛋白是由seqidno:1-2中任一所示氨基酸序列經過1-30個，更優(yōu)選1-10個，還要優(yōu)選1-6個，最優(yōu)選1-3個氨基酸殘基的缺失或添加而形成的且具有(a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。在優(yōu)選的實施方式中，(b)所述的衍生蛋白是在seqidno:1-2中任一所示氨基酸序列的c末端和/或n末端添加或缺失1-30個，更優(yōu)選1-10個，還要優(yōu)選1-6個，最優(yōu)選1-3個氨基酸殘基而形成的且具有(a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。在優(yōu)選的實施方式中，所述蛋白的最適ph在5.0-8.5；優(yōu)選地，所述蛋白的最適ph在6-8；更優(yōu)選地，所述蛋白的最適ph在6.5-7.5。在優(yōu)選的實施方式中，所述蛋白是氨基酸序列如seqidno:1所示的蛋白。在優(yōu)選的實施方式中，所述宿主細胞是大腸桿菌(e.coli)、谷氨酸棒桿菌(corynebacteriumglutamicum)、蜂房哈夫尼菌(hafniaalvei)、枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)；更優(yōu)選地，所述宿主細胞是大腸桿菌(e.coli)。應理解，在本發(fā)明范圍內中，本發(fā)明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優(yōu)選的技術方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附圖說明圖1顯示了3個賴氨酸脫羧酶ldc6、ldc14和cada在不同ph的比酶活。具體實施方式發(fā)明人經過廣泛而深入的研究，出乎意料地發(fā)現(xiàn)兩種賴氨酸脫羧酶，這些賴氨酸脫羧酶具備更適合實際生產的最適ph、較高的熱穩(wěn)定性、較高的比酶活，從而為開發(fā)得到優(yōu)異的賴氨酸脫羧酶，進而用于1,5-戊二胺的生產提供了物質基礎。在此基礎上完成了本發(fā)明。賴氨酸脫羧酶賴氨酸脫羧酶是催化賴氨酸脫羧形成1,5-戊二胺的合成途徑中的關鍵酶。賴氨酸脫羧酶存在于各種各樣的微生物中，包括但不限于大腸桿菌(escherichiacoli)、蜂房哈夫尼菌(hafniaalvei)、耐堿芽孢桿菌(bacillushalodurans)、蠟樣芽孢桿菌(bacilluscereus)、尸桿菌(bacteriumcadaveris)、伯克霍爾德氏菌(burkholderiavietnamensia)、青紫色素桿菌(chromobacteriumviolaceum)、霍亂弧菌(vibriocholerae)、毛鏈霉菌(streptomycespolosus)等。目前，已經分別從大腸桿菌、蜂房哈夫尼菌、反芻動物月形單胞菌(selenomonasruminantium)、鼠傷寒沙門氏菌(salmonellatyphimurium)和鮰愛德華氏菌(edwardsiellaictaluri)等細菌中克隆出賴氨酸脫羧酶基因。雖然可以從各種不同的微生物來源獲得賴氨酸脫羧酶，但各種賴氨酸脫羧酶的特性顯著不同。例如，大腸桿菌中有兩種賴氨酸脫羧酶：cada和ldcc，它們都需要磷酸吡哆醛作為輔助因子。cada的最適ph是5.5，在ph8.0時完全失活；ldcc的最適ph是7.6，在廣泛的ph范圍內均有活性。cada的熱穩(wěn)定性明顯優(yōu)越，在70℃時仍能保持很高的活性，而ldcc從37℃開始，隨著溫度升高熱穩(wěn)定性顯著下降(lemonnierandlane1998)。本領域技術人員無法從序列分析上知曉何種賴氨酸脫羧酶能夠具備所需的特性，例如高比活、熱穩(wěn)定性、ph穩(wěn)定性，特別是能夠適用于實際生產的最適溫度以及最適ph，進而無法用于1,5-戊二胺的實際生產。此外，賴氨酸脫羧酶的溫度穩(wěn)定性和ph穩(wěn)定性偏離實際生產條件還會大幅度增加生產成本。在本文中，所用的術語“賴氨酸脫羧酶”或“本發(fā)明的賴氨酸脫羧酶”或“本發(fā)明的酶”具有相同的意義，在本文可以互換使用，均是指具有催化賴氨酸產生1,5-戊二胺活性的蛋白。在具體的實施方式中，本發(fā)明的賴氨酸脫羧酶表示氨基酸序列如seqidno:1-2中任一所述的蛋白質。在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的賴氨酸脫羧酶表示氨基酸序列如seqidno:1所述的蛋白質。如上所述，賴氨酸脫羧酶的溫度穩(wěn)定性和ph穩(wěn)定性對于實際生產至關重要。而本發(fā)明的賴氨酸脫羧酶能夠具備優(yōu)異的ph穩(wěn)定性和溫度穩(wěn)定性。在具體的實施方式中，本發(fā)明的賴氨酸脫羧酶在ph從5.0-8.5的范圍內能夠保持40％以上的相對酶活；優(yōu)選地，在ph從6.0-8.0的范圍內能夠保持70％以上的相對酶活；最優(yōu)選地，在ph從6.5-7.5的范圍內能夠保持90％以上的相對酶活。本發(fā)明的賴氨酸脫羧酶在一定溫度下孵育一定時間后能夠保留較高的比酶活。在具體的實施方式中，本發(fā)明的蛋白在37℃孵育12h后，剩余的相對比酶活高于80％或更高；在50℃孵育12h后，本發(fā)明的蛋白剩余的相對比酶活高于45％。相比之下文獻報道的ldcc當溫度超過37℃時，活力隨著溫度升高快速下降(lemonnierandlane1998)。本文所用的術語“比酶活”具有本領域技術人員通常理解的含義，是指在特定條件下，單位重量(mg)的蛋白所具有的酶活力單位數(shù)。一般來說，對同一種酶而言，比活力越高，表示酶的催化性能越好。本文所用的術語“分離的”是指物質從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細胞內的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。因此，本文所用的術語“分離純化的賴氨酸脫羧酶”是指所述蛋白基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化本發(fā)明的賴氨酸脫羧酶。基本上純的蛋白在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產生單一的條帶。鑒于本發(fā)明的教導以及現(xiàn)有技術，本領域技術人員還應明白“賴氨酸脫羧酶”還應包括所述蛋白的變異形式，所述變異形式具有與“本發(fā)明的賴氨酸脫羧酶”相同或相似的功能，但其氨基酸序列與seqidno:1-2中任一所示氨基酸序列有少量差異。這些變異形式包括(但不限于)：一個或多個(通常為1-30個，較佳地1-10個，更佳地1-6個，最佳地1-3個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在c末端和/或n末端添加一個或多個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為6個或3個以內)氨基酸。例如，本領域技術人員熟知，用性能相近或相似的氨基酸進行取代，例如，異亮氨酸與亮氨酸相互取代時，不會改變所得蛋白質的功能。再例如，在c末端和/或n末端添加一個或數(shù)個氨基酸，例如為便于分離而添加的標簽通常不會改變所得蛋白質的功能。例如，本申請實施例中1-4中的蛋白都是在c端帶有6his標簽的蛋白。多肽的變異形式包括：同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴格性條件下能與“本發(fā)明的賴氨酸脫羧酶”的編碼dna雜交的dna所編碼的蛋白。本發(fā)明還包括其他多肽，如包含“本發(fā)明的賴氨酸脫羧酶”或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還應包括“本發(fā)明的賴氨酸脫羧酶”的活性片段。通常，該片段具有“本發(fā)明的賴氨酸脫羧酶”的氨基酸序列的至少約20個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。本發(fā)明還提供“賴氨酸脫羧酶”的類似物。這些類似物與天然“本發(fā)明的賴氨酸脫羧酶”的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同于天然l-氨基酸的殘基(如d-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應理解，本發(fā)明的蛋白并不限于上述例舉的代表性蛋白。修飾(通常不改變一級結構)形式包括：體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙?；螋然Ｐ揎椷€包括糖基化。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的蛋白。在本發(fā)明中，“賴氨酸脫羧酶”的保守性變異多肽指與seqidno:1-2中任一所示氨基酸序列相比，有至多20個，較佳地至多10個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽，但所述保守性變異多肽依然具有與氨基酸序列如seqidno:1-2中任一所示蛋白相同或相似的活性，即催化賴氨酸產生1,5-戊二胺活性。因此，鑒于本發(fā)明的教導和現(xiàn)有技術，本領域技術人員可根據(jù)，例如下表所示進行氨基酸替換而產生保守性變異的突變體。因此，本文所用的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……構成”、“基本上由……構成”、和“由……構成”；“主要由……構成”、“基本上由……構成”和“由……構成”屬于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。本發(fā)明的蛋白可以是重組蛋白、天然蛋白、合成蛋白，優(yōu)選重組蛋白。本發(fā)明的蛋白可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據(jù)重組生產方案所用的宿主，本發(fā)明的蛋白可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的蛋白還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。本領域技術人員明白，本發(fā)明的“賴氨酸脫羧酶”還包括“賴氨酸脫羧酶”的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的“賴氨酸脫羧酶”相同的生物學功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根據(jù)本文的定義這些片段、衍生物和類似物屬于本領域熟練技術人員公知的范圍。鑒于本領域現(xiàn)有技術和本發(fā)明的教導，本領域技術人員不難獲得本發(fā)明賴氨酸脫羧酶的活性片段。例如，在本文中，“賴氨酸脫羧酶”的生物活性片段是指“賴氨酸脫羧酶”的片段，但其仍然能保持全長“賴氨酸脫羧酶”的全部或部分功能。通常情況下，所述的生物活性片段至少保持全長“賴氨酸脫羧酶”的50％的活性。在更優(yōu)選的條件下，所述活性片段能夠保持全長“賴氨酸脫羧酶”的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。基于本發(fā)明的教導和現(xiàn)有技術，本領域技術人員還可以明白，可以將本發(fā)明的賴氨酸脫羧酶制成固定化酶等其它利用形式。在本發(fā)明的賴氨酸脫羧酶的基礎上，本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明“賴氨酸脫羧酶”或其保守性變異多肽的多核苷酸序列。本發(fā)明的多核苷酸可以是dna形式或rna形式。dna形式包括cdna、基因組dna或人工合成的dna。dna可以是單鏈的或是雙鏈的。dna可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與編碼seqidno:1-2中任一所示氨基酸序列的核苷酸序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有seqidno:1-2中任一所示氨基酸序列的蛋白質，但與seqidno:1-2中任一所示氨基酸序列的編碼核苷酸序列有差別的核酸序列。本發(fā)明中，“賴氨酸脫羧酶”的編碼多核苷酸序列可插入重組表達載體或基因組。術語“重組表達載體”指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒或其他載體?？傊?，只要能在宿主體內復制和穩(wěn)定，任何質粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復制起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。本領域的技術人員可采用熟知的方法能用于構建含“賴氨酸脫羧酶”編碼dna序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體，包括體外重組dna技術、dna合成技術、體內重組技術等。所述的dna序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mrna合成。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。此外，表達載體優(yōu)選包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(gfp)，或用于大腸桿菌的卡那霉素或氨芐青霉素抗性。包含上述的適當dna序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉化適當?shù)乃拗骷毎?，以使其能夠表達蛋白質。本文所述的宿主細胞包括包含上述表達載體或基因組上整合了本發(fā)明“賴氨酸脫羧酶”編碼序列，優(yōu)選seqidno:1-2中任一所示氨基酸序列的編碼核苷酸序列的宿主細胞。本發(fā)明的宿主細胞或菌株能夠高效表達具有高催化性能的新型賴氨酸脫羧酶，從而提高生產1,5-戊二胺的水平。本發(fā)明的宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞。在具體的實施方式中，所述菌株包括但不限于：大腸桿菌(e.coli)、谷氨酸棒桿菌(corynebacteriumglutamicum)、蜂房哈夫尼菌(hafniaalvei)、、枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)。在優(yōu)選的實施方式中，所述菌株為大腸桿菌(e.coli)。用重組dna轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規(guī)技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收dna的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲，用cacl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用mgcl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的dna轉染方法：磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。獲得的轉化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養(yǎng)。在上面的方法中的重組多肽可以組成型表達或條件表達，例如當宿主細胞生長到適當?shù)募毎芏群?，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于：常規(guī)的復性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超聲處理、高壓勻漿、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、親和層析、高效液相層析(hplc)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。在優(yōu)選的實施方式中，所述“賴氨酸脫羧酶”是：(a)具有seqidno:1-2中任一所示氨基酸序列的蛋白；或(b)由seqidno:1-2中任一所示氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的且具有“賴氨酸脫羧酶”功能的由(a)衍生的蛋白；或(c)由seqidno:1-2中任一所示氨基酸序列經過一個或數(shù)個，優(yōu)選1-30個，更優(yōu)選1-10個，還要優(yōu)選1-6個，最優(yōu)選1-3個氨基酸殘基的缺失或添加而形成的且具有(a)所述蛋白功能的衍生蛋白；或(d)在seqidno:1-2中任一所示氨基酸序列的c末端和/或n末端添加或缺失一個或數(shù)個，優(yōu)選1-30個，更優(yōu)選1-10個，還要優(yōu)選1-6個，最優(yōu)選1-3個氨基酸殘基而形成的且具有(a)所述蛋白功能的衍生蛋白。鑒于本發(fā)明的教導和現(xiàn)有技術，本領域普通技術人員會理解，本發(fā)明的賴氨酸脫羧酶及其編碼序列、表達載體、宿主細胞可用于催化賴氨酸脫羧產生1,5-戊二胺。在此基礎上，本發(fā)明還提供了利用本發(fā)明的表達載體或宿主細胞催化賴氨酸脫羧產生1,5-戊二胺的方法。例如，在具體的實施方式中，可通過培養(yǎng)包含本發(fā)明表達載體或其基因組上整合由本發(fā)明蛋白的編碼序列的宿主細胞或者利用本發(fā)明的賴氨酸脫羧酶，催化賴氨酸產生1,5-戊二胺；然后從催化體系中獲得產生的1,5-戊二胺。在優(yōu)選的實施方式中，所述方法在ph6-8之間，更優(yōu)選在ph6.5-7.5進行。本發(fā)明所述的用于催化的賴氨酸，可以是宿主細胞自身產生的賴氨酸，也可以是外源添加的賴氨酸。本發(fā)明的優(yōu)點：1.相比于現(xiàn)有技術中效果最好的賴氨酸脫羧酶，本發(fā)明的賴氨酸脫羧酶具備優(yōu)異ph穩(wěn)定性以及溫度穩(wěn)定性；2.由于本發(fā)明的賴氨酸脫羧酶的ph穩(wěn)定性以及溫度穩(wěn)定性更適合實際生產，從而能夠顯著降低生產成本和減少對環(huán)境的污染；和3.本發(fā)明的賴氨酸脫羧酶為進一步優(yōu)化1,5-戊二胺的生產提供了物質基礎。下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨?newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另有定義，本文所用的所有技術和科學術語與本發(fā)明所屬領域普通技術人員通常理解的意義相同。雖然可利用與本文所述相似或等價的任何方法和材料來實施或檢驗本發(fā)明，但優(yōu)選本文所述的方法和材料。實施例1.賴氨酸脫羧酶的表達質粒和菌株構建本發(fā)明的賴氨酸脫羧酶序列如以下seqidno:1-2所示：seqidno:1(命名為ldc6)–mnifailnhsgvffkeepvrelhaslekagykvvypvdaqdlykmvemnpricgvlfdwdkysldlcteinvlneklplyafanqhstldisltdlrlnlhffeyalgmaddialkinqateeyidqimppftkalfkyveegkytfctpghmggtafqkspagsifydfygpnafkadvsismpelgslldhsgphkeaeeyiartfnadssyivtngtstsnkivgmfsapagstvlvdrnchkslthmmmmsdvtpiyfrptrnaygilggipqseftrevieakvaatpnatmpgyavitnstydgllyntqyiketldtkfihfdsawvpytnfnsiyegkcgmsgeampgkvfyetqsthkllaafsqasmihvkgefdkesfneafmmhtstspqygivasteiaaammrgntgkkliqdsidrairfrkeikrlesesdswffdvwqpenidttecwkldpkdtwhgfkdidddhmyldpikvtlltpgmnensemsetgipasivakyldehgivvektgpynllflfsigidkskamqllraltdfkrgydlnltvknflpslynedpsfyegmriqelaqgihdltrqyrlpelmfkafdvlpelkvtphaawqeelrgnveevkleemvgrvsanmilpyppgvplvlpgemvttesrpvldflemlcaigahypgfetdihgvyaqkdgsytvkvlked；seqidno:2(命名為ldc14)–mkdilflcnpsptfkripleelyaqlrdrgfniiestsvddlldlvrnnaqlagvvfdwdsysldlckhitalnemlplyafanthstldvslgdlrmniqffeytlggaadiadkirqgtddyidtimppltkalfhyvkegkytfctpghmggtafqkspvgslfydffgantmksdisisvselgslldhsgphkeaeeyiartfnadrsymvtngtstankivgmyaapagstilidrnchkslthlmmmsdvipiylrptrnaygilggipqrefthdtiearvkntpnatwpvhavvtnstydglfynaeyikktldvksihfdsawvpytnfspiyqglcgmsgervegkviyetqsthkllaafsqasmihvkgdfnqetfneaymmhtstsphygivasietaaammkghagkrlindsiarairfrkeikrlrsesdgwffdvwqpdnidqvacwkldpkeswhgfkgiddnhmyldpikvtlltpgmnpdgtmaddgipaaivakyldehgiivektgpynllflfsigidktkalsllraltdfkraydlnlrvknmlpslyredpefyehmriqalaqgihalilhhnlpdlmyrafevlptmvlnphdafqqelrgqaeevyldemigkvnanmilpyppgvplvmpgemlteesrpvleflqmlceigahypgfetdihgayrqadgrytvkvlkq。將賴氨酸脫羧酶ldc6(seqidno:3)和ldc14(seqidno:4)基因的dna序列分別進行全基因合成，并通過5‘ndei和3’xhoi克隆至載體pet-21a(+)(購自蘇州金唯智有限公司)，獲得2個表達質粒，分別命名為pskp1和pskp2；同時以目前生產性能更優(yōu)的大腸桿菌cada作為對照，基因序列在ncbi的geneid為948643，表達質粒命名為pskp3。然后將對照空質粒pet-21a(+)、pskp1、pskp2和pskp3質粒分別轉化至e.colibl21(de3)感受態(tài)細胞(購自北京全市金有限公司)，獲得表達菌株skecc1、skecc2、skecc3和skecc4。實施例2.酶的分離純化將重組菌skecc2、skecc3和skecc4分別接入含有100μg/ml氨芐青霉素的5mllb液體培養(yǎng)基中，37℃，200r/min培養(yǎng)10h左右。取0.5ml種子液接入含有100μg/ml氨芐青霉素的50mllb液體培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，37℃，200r/min培養(yǎng)。當生長至od600為0.6-0.8時，加入itpg至終濃度為0.1mm，20℃，200r/min誘導表達20h。誘導表達的菌液4℃離心收集菌體，采用4℃預冷的重懸buffer(20mm磷酸鉀，20mm咪唑，0.1mm磷酸吡哆醛，1mmdtt，100mmnacl，調節(jié)ph＝7.4)對誘導后的細胞進行重懸并洗3次后，采用超聲進行破碎。對破碎液以12,000rpm離心20min，獲得的可溶性上清液，在akta儀器上利用his標簽進行鎳柱純化，最終通過洗脫buffer(20mm磷酸鉀，500mm咪唑，0.1mm磷酸吡哆醛，1mmdtt，100mmnacl，調節(jié)ph＝7.4)洗脫目的蛋白，再通過10kd超濾管超濾除鹽，最終獲得溶于保存buffer(20mm磷酸鉀，0.1mm磷酸吡哆醛，100mmnacl，5％甘油，調節(jié)ph＝7.4)的純酶，所得的酶為分離純化的賴氨酸脫羧酶，保存于-80℃，用于各種酶學性質表征。實施例3.不同ph條件酶活測定在100ul的酶反應體系中(100mm磷酸鉀,0.1mm磷酸吡哆醛，1mmdtt，100mmnacl)ldc純酶用量為0.5ug，底物l-賴氨酸濃度為15mm，調節(jié)緩沖液ph分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，在37℃反應3min。吸取30ul反應液加入到70ul1m碳酸鈉終止液中終止反應，取50ul10mm的tnbs加入到反應終止液中，42℃顯色5min，最后用500ul甲苯萃取，吸取200μl上清液在酶標儀上讀取340nm下吸光值。酶活力單位u定義為：在以上酶反應條件下，每分鐘催化產生1μmol1,5-戊二胺所需的酶量定義為一個酶活單位。ldc6和ldc14在不同ph條件下的比酶活如圖1所示，ldc6和ldc14的ph耐受范圍較廣，在ph5.0-8.5的范圍內仍能夠保持40％以上的相對酶活，在ph6.0-8.0的范圍內能夠保持70％以上的相對酶活；在ph6.5-7.5的范圍內能夠保持90％以上的相對酶活，最適ph值分別為7.5和7.0，在最適ph下的比酶活分別為205.1和141.9u.mg-1。大腸桿菌的cada的最適ph為5.5，在最適ph下的比酶活為171.6u.mg-1，當ph升高到6.5以上時cada比酶活就開始顯著下降，與文獻報道一致(lemonnierandlane1998)。催化反應在中偏堿性條件進行時，與大腸桿菌等菌株的生長ph相接近，并且可以減少中和酸的用量，減少廢棄物無機鹽對環(huán)境的污染，因此ldc6和ldc14更適合于1,5-戊二胺的實際生產。實施例4.熱穩(wěn)定性的測定ldc6、ldc14和cada分別用各自最適ph值的緩沖液配制成10μg/ml的濃度，并分別于37℃和50℃進行孵育，孵育12小時后測定剩余酶活力，并與孵育前的酶活力進行比對，計算剩余的相對比酶活。。結果如表1所示，在37℃孵育12h后ldc6、ldc14和cada剩余的相對比酶活都超過80％，在50℃孵育12h后ldc6、ldc14和cada剩余的相對酶活都超過45％，其中l(wèi)dc6的剩余酶活最高，cada和ldc14基本相當。而文獻報道的ldcc當溫度超過37℃時，活力隨著溫度升高快速下降(lemonnierandlane1998)。說明ldc6和ldc14與cada一樣具有良好的熱穩(wěn)定性。表1ldc溫度穩(wěn)定性測定從實施例3和4的結果可以看出，本發(fā)明的賴氨酸脫羧酶不僅在中性偏堿ph下具有較高酶活力，而且也具有良好的熱穩(wěn)定性，具有良好的1,5-戊二胺生產應用前景。實施例5.賴氨酸脫羧酶的全細胞催化本發(fā)明人進一步利用實施例2所示的誘導表達條件，獲得skecc1、skecc2和skecc3菌株的表達菌液，skecc1作為對照，離心收集菌體。在以下體系中進行賴氨酸全細胞轉化反應：100mm的磷酸鉀緩沖液，0.1mmplp，初始賴氨酸鹽酸鹽濃度35g/l，初始菌體od600為3.0，反應溫度37℃，攪拌轉速200r/min，skecc1、skecc2、skecc3三個催化體系加硫酸控制恒定反應ph分別為7.0、7.5和7.0，催化反應時間5小時，結果如表2所示，從表2可以看出，能夠表達本發(fā)明的賴氨酸脫羧酶的skecc2和skecc3菌株均能夠在比較高的ph條件下實現(xiàn)全細胞催化賴氨酸轉化為1,5-戊二胺。表2不同賴氨酸脫羧酶全細胞催化產生1,5-戊二胺菌株催化5h生成的1,5-戊二胺(g/l)skecc10.5skecc217.6skecc35.9討論：本發(fā)明人通過細致的研究，出乎意料地發(fā)現(xiàn)幾種具備催化賴氨酸脫羧產生1,5-戊二胺活性的賴氨酸脫羧酶。這些賴氨酸脫羧酶(尤其是ldc6)在整體上明顯優(yōu)于現(xiàn)有技術中效果最好的賴氨酸脫羧酶，特別是在反應ph、熱穩(wěn)定性等多個方面；從而為進一步優(yōu)化1,5-戊二胺的生產提供了新的物質基礎。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。序列表<110>中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所<120>新的賴氨酸脫羧酶及其應用<130>p2015-1664<160>4<170>patentinversion3.5<210>1<211>712<212>prt<213>artificialsequence<220><223>賴氨酸脫羧酶ldc6<400>1metasnilephealaileleuasnhisserglyvalphephelysglu151015gluprovalarggluleuhisalaserleuglulysalaglytyrlys202530valvaltyrprovalaspalaglnaspleutyrlysmetvalglumet354045asnproargilecysglyvalleupheasptrpasplystyrserleu505560aspleucysthrgluileasnvalleuasnglulysleuproleutyr65707580alaphealaasnglnhisserthrleuaspileserleuthraspleu859095argleuasnleuhisphepheglutyralaleuglymetalaaspasp100105110ilealaleulysileasnglnalathrgluglutyrileaspglnile115120125metproprophethrlysalaleuphelystyrvalglugluglylys130135140tyrthrphecysthrproglyhismetglyglythralapheglnlys145150155160serproalaglyserilephetyraspphetyrglyproasnalaphe165170175lysalaaspvalserilesermetprogluleuglyserleuleuasp180185190hisserglyprohislysglualagluglutyrilealaargthrphe195200205asnalaaspsersertyrilevalthrasnglythrserthrserasn210215220lysilevalglymetpheseralaproalaglyserthrvalleuval225230235240aspargasncyshislysserleuthrhismetmetmetmetserasp245250255valthrproiletyrpheargprothrargasnalatyrglyileleu260265270glyglyileproglnsergluphethrarggluvalileglualalys275280285valalaalathrproasnalathrmetproglytyralavalilethr290295300asnserthrtyraspglyleuleutyrasnthrglntyrilelysglu305310315320thrleuaspthrlyspheilehispheaspseralatrpvalprotyr325330335thrasnpheasnseriletyrgluglylyscysglymetserglyglu340345350alametproglylysvalphetyrgluthrglnserthrhislysleu355360365leualaalapheserglnalasermetilehisvallysglygluphe370375380asplysgluserpheasnglualaphemetmethisthrserthrser385390395400proglntyrglyilevalalaserthrgluilealaalaalametmet405410415argglyasnthrglylyslysleuileglnaspserileaspargala420425430ileargphearglysgluilelysargleuglusergluseraspser435440445trpphepheaspvaltrpglnprogluasnileaspthrthrglucys450455460trplysleuaspprolysaspthrtrphisglyphelysaspileasp465470475480aspasphismettyrleuaspproilelysvalthrleuleuthrpro485490495glymetasngluasnserglumetsergluthrglyileproalaser500505510ilevalalalystyrleuaspgluhisglyilevalvalglulysthr515520525glyprotyrasnleuleupheleupheserileglyileasplysser530535540lysalametglnleuleuargalaleuthraspphelysargglytyr545550555560aspleuasnleuthrvallysasnpheleuproserleutyrasnglu565570575aspproserphetyrgluglymetargileglngluleualaglngly580585590ilehisaspleuthrargglntyrargleuprogluleumetphelys595600605alapheaspvalleuprogluleulysvalthrprohisalaalatrp610615620glnglugluleuargglyasnvalglugluvallysleugluglumet625630635640valglyargvalseralaasnmetileleuprotyrproproglyval645650655proleuvalleuproglyglumetvalthrthrgluserargproval660665670leuasppheleuglumetleucysalaileglyalahistyrprogly675680685phegluthraspilehisglyvaltyralaglnlysaspglysertyr690695700thrvallysvalleulysgluasp705710<210>2<211>711<212>prt<213>artificialsequence<220><223>賴氨酸脫羧酶ldc14<400>2metlysaspileleupheleucysasnproserprothrphelysarg151015ileproleuglugluleutyralaglnleuargaspargglypheasn202530ileilegluserthrservalaspaspleuleuaspleuvalargasn354045asnalaglnleualaglyvalvalpheasptrpaspsertyrserleu505560aspleucyslyshisilethralaleuasnglumetleuproleutyr65707580alaphealaasnthrhisserthrleuaspvalserleuglyaspleu859095argmetasnileglnphepheglutyrthrleuglyglyalaalaasp100105110ilealaasplysileargglnglythraspasptyrileaspthrile115120125metproproleuthrlysalaleuphehistyrvallysgluglylys130135140tyrthrphecysthrproglyhismetglyglythralapheglnlys145150155160serprovalglyserleuphetyraspphepheglyalaasnthrmet165170175lysseraspileserileservalsergluleuglyserleuleuasp180185190hisserglyprohislysglualagluglutyrilealaargthrphe195200205asnalaaspargsertyrmetvalthrasnglythrserthralaasn210215220lysilevalglymettyralaalaproalaglyserthrileleuile225230235240aspargasncyshislysserleuthrhisleumetmetmetserasp245250255valileproiletyrleuargprothrargasnalatyrglyileleu260265270glyglyileproglnarggluphethrhisaspthrileglualaarg275280285vallysasnthrproasnalathrtrpprovalhisalavalvalthr290295300asnserthrtyraspglyleuphetyrasnalaglutyrilelyslys305310315320thrleuaspvallysserilehispheaspseralatrpvalprotyr325330335thrasnpheserproiletyrglnglyleucysglymetserglyglu340345350argvalgluglylysvaliletyrgluthrglnserthrhislysleu355360365leualaalapheserglnalasermetilehisvallysglyaspphe370375380asnglngluthrpheasnglualatyrmetmethisthrserthrser385390395400prohistyrglyilevalalaserilegluthralaalaalametmet405410415lysglyhisalaglylysargleuileasnaspserilealaargala420425430ileargphearglysgluilelysargleuargsergluseraspgly435440445trpphepheaspvaltrpglnproaspasnileaspglnvalalacys450455460trplysleuaspprolysglusertrphisglyphelysglyileasp465470475480aspasnhismettyrleuaspproilelysvalthrleuleuthrpro485490495glymetasnproaspglythrmetalaaspaspglyileproalaala500505510ilevalalalystyrleuaspgluhisglyileilevalglulysthr515520525glyprotyrasnleuleupheleupheserileglyileasplysthr530535540lysalaleuserleuleuargalaleuthraspphelysargalatyr545550555560aspleuasnleuargvallysasnmetleuproserleutyrargglu565570575aspprogluphetyrgluhismetargileglnalaleualaglngly580585590ilehisalaleuileleuhishisasnleuproaspleumettyrarg595600605alaphegluvalleuprothrmetvalleuasnprohisaspalaphe610615620glnglngluleuargglyglnalaglugluvaltyrleuaspglumet625630635640ileglylysvalasnalaasnmetileleuprotyrproproglyval645650655proleuvalmetproglyglumetleuthrglugluserargproval660665670leuglupheleuglnmetleucysgluileglyalahistyrprogly675680685phegluthraspilehisglyalatyrargglnalaaspglyargtyr690695700thrvallysvalleulysgln705710<210>3<211>2136<212>dna<213>artificialsequence<220><223>賴氨酸脫羧酶ldc6編碼序列<400>3atgaatatttttgctatcctaaaccactcaggtgttttctttaaagaagagccagttcgc60gaacttcatgcttctttagaaaaagcaggctacaaagttgtttacccagtagacgcacaa120gatttgtataaaatggttgaaatgaacccacgtatttgtggtgtgttatttgactgggat180aaatactcattagacttatgtactgaaattaatgtcttgaatgaaaaattgcctttgtat240gcctttgcaaaccaacattcaacgttagatatttcattaacggatttacgtctaaatctt300catttcttcgaatatgcattaggcatggccgatgatatcgctctgaaaattaatcaagcg360actgaagaatacatagatcaaatcatgcctccttttactaaggcactattcaaatatgta420gaagaaggtaaatatacgttctgtactccgggtcacatgggcggtactgctttccaaaaa480agtccagcaggcagcatcttctatgatttctacggtccaaacgcatttaaagcggatgtc540tcaatttcaatgcctgaactaggttcattgcttgatcactctggtcctcataaagaagca600gaagagtatattgctcgcacgtttaatgcagacagctcttacatcgtaacgaacggtacg660tctacttcaaataaaattgtaggtatgttttctgcaccagcaggcagcacagtacttgtt720gaccgtaactgtcacaaatctttgactcacatgatgatgatgagtgatgtaacccctatc780tatttccgtccaacgcgtaacgcttacggtattttaggtggcattcctcaaagtgaattc840actcgtgaagtgattgaagcaaaagtagcagcaacaccaaacgcaactatgcctggttat900gcggttattactaactctacttacgatggcttgttgtataacactcaatacatcaaagaa960acgctagacactaaattcatccacttcgacagtgcttgggttccttacactaacttcaac1020tctatttacgaaggtaaatgtggtatgagtggtgaagcgatgccgggtaaagtgttctat1080gaaacacaatcaactcataaattattggctgcgttctctcaagcatcaatgatccacgtg1140aaaggtgagtttgataaagaatctttcaacgaagccttcatgatgcacacatcaacatca1200cctcaatacggtattgttgcatcaacagaaattgctgcggcgatgatgcgcggtaataca1260ggtaagaaactgatccaagactctattgaccgtgcgattcgtttccgtaaagagatcaaa1320cgtctagaaagtgaaagtgacagctggttcttcgatgtatggcaaccagaaaatatcgat1380acaacagaatgttggaaactggatcctaaagatacatggcatggttttaaagacatcgat1440gatgaccacatgtaccttgatccaatcaaagtaacgctattaactccaggaatgaacgaa1500aatagcgaaatgagtgaaacaggtatccctgcttctatcgttgctaaatacttagatgaa1560cacggtattgtagtagagaaaacaggtccatataacctattattcttgttctctatcggt1620attgataaatcaaaagcaatgcaattactgcgtgcgttaactgactttaaacgtggctat1680gatctaaacttaacagtgaaaaacttcttaccttcactgtacaacgaagatccaagcttc1740tacgaaggcatgcgcattcaagaactggcacaaggcattcacgatcttactcgtcaatac1800cgtttaccagaattgatgttcaaagcgtttgatgtattacctgaactaaaagtaacgcca1860cacgcagcatggcaagaagagctacgcggcaatgtggaagaagtgaaactggaagaaatg1920gttggtcgcgtaagtgccaatatgatccttccttatcctccaggtgttccactagtactt1980cctggtgaaatggtaacaacagaatctcgtccagtacttgatttcttagagatgctatgt2040gcaatcggcgctcattacccaggttttgaaacggatattcacggtgtatatgctcaaaaa2100gatggcagttacacagtgaaagtattaaaagaagat2136<210>4<211>2133<212>dna<213>artificialsequence<220><223>賴氨酸脫羧酶ldc14編碼序列<400>4atgaaagacattctgttcctgtgtaacccctcgccgaccttcaagcggattccgctggag60gagctgtacgcccagctgcgcgatcgggggtttaacatcatcgaaagcacctcggtcgac120gatctgctggatctggtgcgcaacaacgcccagctggccggggtcgtcttcgactgggat180agctacagtctggatctgtgcaagcacatcacggcgctgaacgaaatgctgccgctgtat240gccttcgccaacacccactccacgctggacgtcagcctgggcgacctgcgcatgaacatt300cagttctttgagtatacgctgggtggcgcggccgacatcgccgacaagatccgccaggga360accgacgactacatcgataccatcatgccgccgctgaccaaggcgctgttccactacgtc420aaagagggaaaatacaccttctgtaccccggggcacatgggcggcaccgcgttccagaaa480agcccggtcggcagcctgttctatgacttctttggcgccaacaccatgaagtccgacatc540tccatctccgtatccgagctgggctccctgctggaccactccggcccgcacaaagaggcg600gaagagtacatcgcccgcaccttcaacgccgatcgcagctacatggtgaccaacggcacc660tcgaccgccaacaagatcgtcggcatgtacgccgcgccggccggcagcactatcctgatc720gaccgtaactgtcacaaatcgctgacccacctgatgatgatgagcgacgttatcccgatc780tacctgcggccgacccgcaacgcctacggcattctgggggggattccccagcgcgagttc840acccacgacaccatcgaagcgcgggtgaaaaataccccgaacgccacctggccggtgcat900gcggtggtcaccaactccacctatgacggcctgttctacaacgcggagtacatcaagaaa960accctggacgtaaaatccatccactttgactccgcctgggtgccctacaccaacttcagc1020ccgatctaccaggggctgtgcggtatgagcggcgagcgcgtcgagggcaaggttatctac1080gaaacccagtccacccacaaactgctggcggcgttctcgcaggcgtccatgatccacgtg1140aaaggcgacttcaaccaagaaacctttaacgaagcctacatgatgcacacctccacctca1200ccgcactatggcatcgtggcctccatcgaaaccgcggcggcgatgatgaagggtcacgcc1260ggtaaacgcctgatcaatgactctatcgcgcgagccatccgcttccgtaaggagatcaag1320cgcctgcgcagcgagtccgacggctggttcttcgacgtctggcagccggacaatattgac1380caggtcgcctgctggaagctggatccgaaagagtcctggcacggctttaagggcatcgat1440gacaaccacatgtaccttgacccgatcaaggtcaccctgctgaccccggggatgaacccg1500gacggcacgatggcggatgacggtatcccggccgccatcgtggccaagtacctggacgag1560cacggcatcatcgtcgagaagaccggcccgtacaacctgctgttcctgttcagcatcggc1620atcgacaagaccaaggccctgagcctgctgcgcgcgctgaccgacttcaagcgggcctat1680gacctgaacctgcgcgtgaagaacatgctgccgtcgctgtaccgcgaagatccggagttc1740tatgagcacatgcggatccaggcgctggcccagggcatccacgcgctgatcctacaccat1800aacctgccggatctgatgtaccgcgccttcgaggtgctaccgaccatggtgctgaacccg1860cacgacgccttccaacaggagctgcgcggccaggccgaagaggtctacctcgacgagatg1920atcggcaaggtcaacgccaacatgatcctgccgtacccgccgggcgtgccgctggtgatg1980ccgggcgaaatgctgacggaggagagccggccggtgctggagtttctgcagatgctgtgc2040gaaatcggcgcccactatccgggcttcgaaaccgacatccacggcgcctatcgtcaggcc2100gacgggcgctatacggtgaaagtgctcaagcag2133當前第1頁12