本發(fā)明提供一種十八烷基聚乙烯醚的制備方法，用于從螺旋藻破壁液中雙水相萃取藻藍蛋白。屬于海產(chǎn)品加工分離工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
螺旋藻藻藍蛋白存在于螺旋藻的藻膽體中。藻膽體是紅藻和藍藻所特有的一種超分子捕光色素復合體。藻藍蛋白色澤呈明亮的藍色，顏色鮮艷，是食品、高級眼影、唇膏的首選純天然色素。藻藍蛋白還可以調(diào)節(jié)和合成人體代謝所需要的多種重要酶，具有明顯的抗氧化、抗炎癥作用，調(diào)節(jié)人體免疫系統(tǒng)，增強免疫系統(tǒng)功能。高純度的藻藍蛋白帶有很強的熒光，制成的純天然熒光試劑，用于臨床醫(yī)學診斷，免疫化學及生物醫(yī)學工程等研究領(lǐng)域。
在我國，每年的螺旋藻全國總產(chǎn)量已達到7000噸。螺旋藻產(chǎn)量的三分之一用于直接出口，其它螺旋藻多以藻粉、微藻藻片和灌注膠囊的形式當作保健品使用。螺旋藻的規(guī)?；_發(fā)和利用處于初級加工階段，還沒有深加工產(chǎn)品。螺旋藻中藻藍蛋白的提取還處于實驗室研究階段，沒有適合于工業(yè)化生產(chǎn)的好的工藝方法。目前，市場上銷售的高純度的藻藍蛋白商品都是從國外進口，價格昂貴，在應用上受到限制。
因此，開發(fā)簡便、快速的螺旋藻藻藍蛋白的提取過程，提高螺旋藻藻藍蛋白產(chǎn)品純度是目前螺旋藻藻藍蛋白的規(guī)?；_發(fā)利用中亟待解決的關(guān)鍵問題。聚合物雙水相分離蛋白質(zhì)具有生物相容性高，操作條件溫和，易于進行連續(xù)化操作等優(yōu)點。已報道的有關(guān)制備藻類藻藍蛋白的雙水相萃取分離藻藍蛋白的專利技術(shù)，例如中國專利CN103880950A采用價格昂貴的離子液體組成聚合物-水相，增加生產(chǎn)成本，CN102993297A、CN101891809A等采用市售的PEG組成聚合物-水相，分離藻藍蛋白的選擇性差，需要與鹽析等其它提取手段聯(lián)合使用才能得到高純度產(chǎn)品，過程繁瑣。
本發(fā)明提供一種對藻藍蛋白具有特異性萃取能力的十八烷基聚乙烯醚，可通過雙水相萃取方式從螺旋藻破壁液中直接分離純化藻藍蛋白，無需與鹽析等其它提取手段聯(lián)合使用，就能得到高純度藻藍蛋白。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種十八烷基聚乙烯醚的制備方法，用于雙水相萃取分離螺旋藻藻藍蛋白，獲得高純度的藻藍蛋白，應用于天然色素、保健食品和新藥的研究開發(fā)。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種十八烷基聚乙烯醚的制備方法，用于從螺旋藻破壁液中萃取分離藻藍蛋白。其方法簡單，快捷，成本低，分離藻藍蛋白具有較高的純度，原料既可采用新鮮螺旋藻也可采用螺旋藻干粉，從而提供了一種解決螺旋藻藻藍蛋白資源規(guī)?；玫姆椒?。
本發(fā)明的技術(shù)方案：一種十八烷基聚乙烯醚雙水相萃取螺旋藻藻藍蛋白的分離技術(shù)，步驟為：
(1)十八烷基聚乙烯醚的制備；(2)從螺旋藻破壁清液兩相萃取藻藍蛋白；(3)藻藍蛋白水溶液經(jīng)濃縮和冷凍干燥后獲得藻藍蛋白粉。
所述的方案，步驟1中，在圓底燒瓶中放入重量百分比為2％～8％的叔丁醇鉀苯溶液，在氮氣保護下逐滴加入重量百分比為25％～50％的聚乙二醇苯溶液，叔丁醇鉀與聚乙二醇的重量比為0.04～0.1:1，在室溫下攪拌1～3小時，然后加入重量百分比為15％～30％的十八烷基溴苯溶液，十八烷基溴與聚乙二醇的重量比為0.22～0.5:1，在室溫下攪拌反應72～108小時，過濾后將濾液在真空下蒸餾1～3小時獲得十八烷基聚乙烯醚。
所述的方案，步驟2中，螺旋藻破壁清液的制備：采用水或磷酸緩沖液作提取劑，磷酸緩沖液的濃度為25～100mmol/L，藻粉或鮮藻與提取液的固液比為1:50～1:150，攪拌均勻后，置于-10℃～-20℃下冷凍一定時間后，37℃溶解，如此反復凍融4-6次，融化后離心獲得的破壁清液，破壁清液中蛋白質(zhì)濃度為1.0～5.6mg/ml，藻藍蛋白純度為0.5～0.72。
所述的方案，步驟2中，在螺旋藻破壁清液中加入十八烷基聚乙烯醚和無機鹽，十八烷基聚乙烯醚:無機鹽:破壁清液的重量比為0.05～0.35:0.25～0.4:1，震蕩混合2分鐘，靜置分相，藻藍蛋白富集于上相；將含藻藍蛋白的上相經(jīng)截留分子量為30000道爾頓的超濾膜過濾，去除十八烷基聚乙烯醚和無機鹽，獲得藻藍蛋白水溶液，純度為2.4～4.2，蛋白濃度為4.15～6.6mg/ml。
所述的方案，步驟3中，將藻藍蛋白水溶液在60℃下真空濃縮至原體積三分之一，冷凍干燥后得到藻藍蛋白粉末。
本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，主要具有以下優(yōu)點：1.十八烷基聚乙烯醚對藻藍蛋白的選擇性高，適合不同規(guī)模和場地的工業(yè)化生產(chǎn)要求；2.十八烷基聚乙烯醚可直接從螺旋藻破壁清液中萃取獲得高純度的藻藍蛋白，無需其它提取手段配合，生產(chǎn)成本低；3.制備藻藍蛋白的原料可以是螺旋藻鮮藻或者干藻粉，有效地解決螺旋藻資料的利用和高值化問題。
具體實施方式
實施實例1
(1)螺旋藻破壁清液的制備
取產(chǎn)于江蘇東臺市賜百年生物工程有限公司的鈍頂螺旋藻干粉，用去離子水作提取劑，藻粉與去離子水的固液比為1:55，置于-20℃下冷凍3小時后，37℃融解，如此反復凍融4次，融化后的藍藻破壁液用離心機在6000轉(zhuǎn)/min下離心10分鐘，取上清液為破壁清液，清液中蛋白質(zhì)濃度為1.2mg/ml，藻藍蛋白純度A620/A280為0.75mg/ml。
(2)十八烷基聚乙烯醚的制備
在1000ml的圓底燒瓶中放入100ml重量百分比為2％的叔丁醇鉀(購自常州市啟迪化工有限公司)苯(購自上海泰正化工有限公司)溶液，在氮氣(購自無錫市圣馬氣體有限公司)保護下逐滴加入重量百分比為25％的聚乙二醇PEG-1000(購自海安石油化工廠)苯溶液，PEG-1000的平均分子量為1000，PEG-1000的用量為50g，在室溫下攪拌1小時，然后加入重量百分比為15％的十八烷基溴苯溶液，十八烷基溴的用量為11g，在室溫下攪拌反應72小時，過濾后將濾液在真空下蒸餾1小時獲得十八烷基聚乙烯醚。
(3)兩相萃取
在10g螺旋藻破壁清液中加入1.2g十八烷基聚乙烯醚和2.5g無水硫酸鈉(購自南京大唐化工有限責任公司)，震蕩混合2分鐘，靜置分相，藻藍蛋白富集于上相，上相經(jīng)截留分子量為30000道爾頓的超濾膜(頗爾過濾器有限公司)過濾，去除十八烷基聚乙烯醚和硫酸鈉，獲得藻藍蛋白水溶液，純度為2.5，蛋白濃度為4.15mg/ml。
(4)冷凍干燥獲得藻藍蛋白粉
將前述步驟(3)中獲得的藻藍蛋白水溶液在60℃下真空濃縮至原體積三分之一，冷凍干燥后得到藻藍蛋白粉產(chǎn)品。產(chǎn)品中藻藍蛋白純度A620/A280為2.5，蛋白回收率為80％。
實施例2
(1)螺旋藻破壁液的制備
取產(chǎn)于江蘇大豐賜百年生物科技有限公司的新鮮螺旋藻，用100mmol/L磷酸緩沖液作提取劑，螺旋藻與去離子水的固液比為1:80，置于-10℃下冷凍4小時后，37℃融解，如此反復凍融5次。融化后的藍藻破壁液用離心機在6000轉(zhuǎn)/min下離心10分鐘，取上清液為破壁清液，清液中蛋白質(zhì)濃度為3.1mg/ml，藻藍蛋白純度A620/A280為0.55。
(2)十八烷基聚乙烯醚的制備
在1500ml的圓底燒瓶中放入100ml重量百分比為4％的叔丁醇鉀(購自常州市啟迪化工有限公司)苯(購自上海泰正化工有限公司)溶液，在氮氣(購自無錫市圣馬氣體有限公司)保護下逐滴加入重量百分比為40％的聚乙二醇PEG-3000(購自海安石油化工廠)苯溶液，PEG-3000的平均分子量為3000，PEG-3000的用量為40g，在室溫下攪拌2小時，然后加入重量百分比為25％的十八烷基溴苯溶液，十八烷基溴的用量為14g，在室溫下攪拌反應96小時，過濾后將濾液在真空下蒸餾2小時獲得十八烷基聚乙烯醚。
(3)兩相萃取
在10g螺旋藻破壁清液中加入2g十八烷基聚乙烯醚和2.5g無水硫酸鎂(購自南京大唐化工有限責任公司)，震蕩混合2分鐘，靜置分相，藻藍蛋白富集于上相，將上相經(jīng)截留分子量為30000道爾頓的超濾膜(頗爾過濾器有限公司)過濾，去除十八烷基聚乙烯醚和硫酸鎂，獲得藻藍蛋白水溶液，純度為4.1，蛋白濃度為5.8mg/ml。
(5)冷凍干燥獲得藻藍蛋白粉
將前述步驟(3)中獲得的藻藍蛋白水溶液在60℃下真空濃縮至原體積三分之一，冷凍干燥后得到藻藍蛋白粉產(chǎn)品。產(chǎn)品中藻藍蛋白純度A620/A280為4.2，蛋白回收率75％。
實施例3
(1)螺旋藻破壁液的制備
取產(chǎn)于云南麗江程海源螺旋藻基地的螺旋藻粉，用50mmol/L磷酸緩沖液作提取劑，螺旋藻與去離子水的固液比為1:100，置于-20℃下冷凍5小時后，37℃融解，如此反復凍融5次。融化后的藍藻破壁液用離心機在6000轉(zhuǎn)/min下離心10分鐘，取上清液為破壁清液，清液中的藻藍蛋白純度A620/A280為0.72，破壁液蛋白質(zhì)濃度為4.6mg/ml mg/ml。
(2)十八烷基聚乙烯醚的制備
在1000ml的圓底燒瓶中放入100ml重量百分比為8％的叔丁醇鉀(購自常州市啟迪化工有限公司)苯(購自上海泰正化工有限公司)溶液，在氮氣(購自無錫市圣馬氣體有限公司)保護下逐滴加入重量百分比為50％的聚乙二醇PEG-4000(購自海安石油化工廠)苯溶液，PEG-4000的平均分子量為4000，PEG-4000的用量為80g，在室溫下攪拌3小時，然后加入重量百分比為30％的十八烷基溴苯溶液，十八烷基溴的用量為40g，在室溫下攪拌反應108小時，過濾后將濾液在真空下蒸餾3小時獲得十八烷基聚乙烯醚。
(3)雙水相萃取
在10g螺旋藻破壁清液中加入3.5g十八烷基聚乙烯醚和4g無水硫酸銨(購自南京大唐化工有限責任公司)，震蕩混合2分鐘，靜置分相，藻藍蛋白富集于上相，將上相經(jīng)截留分子量為30000道爾頓的超濾膜(頗爾過濾器有限公司)過濾，去除十八烷基聚乙烯醚和硫酸銨，獲得藻藍蛋白水溶液，純度為3.5，蛋白濃度為6.6mg/ml。
(4)冷凍干燥獲得藻藍蛋白粉
將前述步驟(3)中獲得的藻藍蛋白水溶液在60℃下真空濃縮至原體積三分之一，冷凍干燥后得到藻藍蛋白粉產(chǎn)品。產(chǎn)品中藻藍蛋白純度A620/A280為3.5，蛋白回收率85％。