本發(fā)明涉及一種水凝膠，特別涉及一種3D水凝膠的制備及在細胞組織培養(yǎng)中的應用。
背景技術(shù)：
水凝膠具有可溶脹的三維網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，在水中能夠吸收大量的水分，并能繼續(xù)保持其原有結(jié)構(gòu)而不被溶解。由于具有較高的含水量和柔軟度，水凝膠與其他生物材料相比，可以更逼真的模擬體內(nèi)組織。水凝膠作為生物材料的一種，必須滿足高純度、無毒、無刺激性。無免疫反應，能與組織相容等特點?；诙嗵侵苽涞乃z已經(jīng)在食品、藥物遞送和組織工程學領(lǐng)域廣泛使用。多糖水凝膠的形成是一個復雜的過程，其中物理交聯(lián)是由聚合物分子通過分子間的非共價相互作用(如氫鍵作用、疏水作用、靜電作用、π-π堆積作用)在水溶液中自聚集形成的。大多數(shù)天然多糖凝膠是依靠高分子鏈段間的氫鍵形成三維結(jié)構(gòu)，但氫鍵受熱會被破會，使凝膠變成溶膠。電荷交聯(lián)是帶不同電荷的高分子材料相互作用形成凝膠，但這種交聯(lián)方式在pH或離子強度等破壞下，都會是凝膠轉(zhuǎn)變成溶膠。
因此，需要構(gòu)建一種物理交聯(lián)的、制備方法簡單的、穩(wěn)定的水凝膠。通過平衡疏水與親水作用力，使聚合物鏈有規(guī)則的組裝可以實現(xiàn)多糖的物理凝膠化，該制備過程簡單，制得的水凝膠可以高溫濕熱滅菌。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供一種3D水凝膠的制備及在細胞組織培養(yǎng)中的應用，本發(fā)明制備的3D水凝膠是通過物理作用形成，膠凝過程簡單，可用于細胞培養(yǎng)使用。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的：一種3D水凝膠的制備方法，包括如下的步驟：
(1)、配制質(zhì)量體積比為20％的泊洛薩姆188溶液，然后將配置好的溶液在25-30℃條件及80-100rpm/min速度下攪拌至完全溶解；
(2)、配制質(zhì)量體積比為10％的殼聚糖溶液，將配置好的溶液在25-30℃條件及80-100rpm/min速度下攪拌均勻，然后加入質(zhì)量體積比為2％的氫氧化鈉攪拌至完全溶解；
(3)、將步驟(2)制備的溶液在攪拌條件下加入到步驟(1)制備的溶液中，緩慢攪拌混合均勻后將溶液放置在真空烘箱中，在50-60℃條件下干燥1-3小時去除部分水分，制備得3D水凝膠。
進一步優(yōu)化方案為：所述殼聚糖分子量(Mw)是10000±250g/mol，乙酰度1.3±0.1％。
進一步優(yōu)化方案為：所述步驟(1)中溶解后制備的溶液粘度為54-60cps
進一步優(yōu)化方案為：所述步驟(3)中緩慢攪拌的速度為6-12rpm/min。
進一步優(yōu)化方案為：所述步驟(3)中緩慢攪拌的時間為10-20min。
進一步優(yōu)化方案為：所述步驟(3)中干燥去除5-10％水分。
一種3D水凝膠在細胞組織培養(yǎng)中的應用，上述制備的3D水凝膠可用于細胞組織培養(yǎng)。上述制備的3D水凝膠可用于小鼠間充質(zhì)干細胞組織，小鼠間充質(zhì)干細胞在3D水凝膠的水層中顯示出很強的增殖效果。
本發(fā)明制備的3D水凝膠的制備方法具有如下優(yōu)點：本發(fā)明通過混合高分子材料的使用、可控的物理凝膠方法，制備一種3D水凝膠，凝膠中的多孔結(jié)構(gòu)可以用于細胞培養(yǎng)。本發(fā)明制備方法簡單，制備的水凝膠穩(wěn)定，制得的水凝膠可以高溫濕熱滅菌。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例來對本發(fā)明進行詳細的說明。
(一)具體實施方式如下：
一種3D水凝膠的制備方法，包括如下的步驟：
(1)、配制質(zhì)量體積比為20％的泊洛薩姆188溶液，然后將配置好的溶液在25-30℃條件及80-100rpm/min速度下攪拌至完全溶解；
(2)、配制質(zhì)量體積比為10％的殼聚糖溶液，將配置好的溶液在25-30℃條件及80-100rpm/min速度下攪拌均勻，然后加入質(zhì)量體積比為2％的氫氧化鈉攪拌至完全溶解；
(3)、將步驟(2)制備的溶液在攪拌條件下加入到步驟(1)制備的溶液中，緩慢攪拌混合均勻后將溶液放置在真空烘箱中，在50-60℃條件下干燥1-3小時去除部分水分，制備得3D水凝膠。
進一步優(yōu)化方案為：所述殼聚糖分子量(Mw)是10000±250g/mol，乙酰度1.3±0.1％。
進一步優(yōu)化方案為：所述步驟(1)中溶解后制備的溶液粘度為54-60cps
進一步優(yōu)化方案為：所述步驟(3)中緩慢攪拌的速度為6-12rpm/min。
進一步優(yōu)化方案為：所述步驟(3)中緩慢攪拌的時間為10-20min。
進一步優(yōu)化方案為：所述步驟(3)中干燥去除5-10％水分。
一種3D水凝膠在細胞組織培養(yǎng)中的應用，上述制備的3D水凝膠可用于細胞組織培養(yǎng)。上述制備的3D水凝膠可用于小鼠間充質(zhì)干細胞組織，小鼠間充質(zhì)干細胞在3D水凝膠的水層中顯示出很強的增殖效果。
(二)實施例如下：
實施例1：一種3D水凝膠的制備方法，將2g泊洛薩姆188分散在10ml水中，在25℃條件下攪拌至完全溶解，測定粘度為60cps。將1g殼聚糖分散至10mL水中攪拌均勻，然后加入0.2g氫氧化鈉攪拌至全部溶解。將上述制備的殼聚糖溶液在攪拌下加入到上述制備的泊洛薩姆溶液中，在6rpm/min速度下緩慢攪拌10min混合均勻后，將混合后的溶液放置在真空烘箱中，55℃除去水分，減重7％，停止干燥，得凝膠。
實施例2：一種3D水凝膠的制備方法，將2g泊洛薩姆188分散在10ml水中，在30℃條件下攪拌至完全溶解，測定粘度為55.4cps。將1g殼聚糖分散至10mL水中攪拌均勻，然后加入0.2g氫氧化鈉攪拌至全部溶解。將上述制備的殼聚糖溶液在攪拌條件下加入到上述制備的泊洛薩姆溶液中，在6rpm/min速度下緩慢攪拌15min混合均勻后，將混合后的溶液放置在真空烘箱中，55℃除去水分，減重5％，停止干燥，得凝膠。
實施例3：一種3D水凝膠的制備方法，將2g泊洛薩姆188分散在10ml水中，在25℃條件下攪拌至完全溶解，測定粘度為60cps。將1g殼聚糖分散至10mL水中攪拌均勻，然后加入0.2g氫氧化鈉攪拌至全部溶解。將上述制備的殼聚糖溶液攪拌下加入到上述制備的泊洛薩姆溶液中，在12rpm/min速度下緩慢攪拌10min混合均勻后，將混合后的溶液放置在真空烘箱中，55℃除去水分，減重10％，停止干燥，得凝膠。
實施例4：一種3D水凝膠的制備方法，將2g泊洛薩姆188分散在10ml水中，在28℃條件下攪拌至完全溶解，測定粘度為59.3cps。將1g殼聚糖分散至10mL水中攪拌均勻，然后加入0.2g氫氧化鈉攪拌至全部溶解。將上述制備的殼聚糖溶液攪拌下加入到上述制備的泊洛薩姆溶液中，在10rpm/min速度下緩慢攪拌10min混合均勻后，將混合后的溶液放置在真空烘箱中，55℃除去水分，減重3.5％，停止干燥，得凝膠。
實施例5：一種3D水凝膠的制備方法，將2g泊洛薩姆188分散在10ml水中，在30℃條件下攪拌至完全溶解，測定粘度為56cps。將1g殼聚糖分散至10mL水中攪拌均勻，然后加入0.2g氫氧化鈉攪拌至全部溶解。將上述制備的殼聚糖溶液攪拌下加入到上述制備的泊洛薩姆溶液中，在6rpm/min速度下緩慢攪拌20min混合均勻后，將混合后的溶液放置在真空烘箱中，55℃除去水分，減重2.5％，停止干燥，得凝膠。
實施例6：一種3D水凝膠的制備方法，將2g泊洛薩姆188分散在10ml水中，在30℃條件下攪拌至完全溶解，測定粘度為55.7cps。將1g殼聚糖分散至10mL水中攪拌均勻，然后加入0.2g氫氧化鈉攪拌至全部溶解。將上述制備的殼聚糖溶液攪拌下加入到上述制備的泊洛薩姆溶液中，在9rpm/min速度下緩慢攪拌15min混合均勻后，將混合后的溶液放置在真空烘箱中，55℃除去水分，減重4％，停止干燥，得凝膠。
實施例7：一種3D水凝膠應用于培養(yǎng)細胞組織：
將水凝膠濕熱滅菌除熱源，放在培養(yǎng)基中，加入5ml L-DMEM完全培養(yǎng)液預培養(yǎng)12h。
使用注射器將小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(MSC)，按照5×106/ml濃度,注射入3D凝膠的水層中，體積為400μL。
細胞在37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)，2天后換液去除非貼壁細胞，以后每3～4天半量換液1次，培養(yǎng)7天后，L-DMEM完全培養(yǎng)液加入1×10-8mol/L地塞米松，誘導分化，繼續(xù)培養(yǎng)45天。
小鼠間充質(zhì)干細胞在3D水凝膠的水層中顯示出很強的增殖效果，MSC成骨細胞誘導培養(yǎng)第l-3天的細胞增殖旺盛,3-5d即融合成單層。隨著誘導培養(yǎng)時間的延長,細胞逐漸堆積并礦鹽沉積,形成礦化結(jié)節(jié)。培養(yǎng)14d和21d后，礦化結(jié)節(jié)形成率分別為(70.5±3.5)％和(87.5±3.5)％，ALP染色陽性率分別為(41.5±1.5)％和(85.2±1.7)％。結(jié)論:骨髓MSC在本技術(shù)方案制備的3D水凝膠中可誘導分化為具有含礦化結(jié)節(jié)及ALP陽性特征的骨樣細胞。
上述具體實施方式只是對本發(fā)明的技術(shù)方案進行詳細解釋，本發(fā)明并不只僅僅局限于上述實施例，凡是依據(jù)本發(fā)明原理的任何改進或替換，均應在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。