本發(fā)明屬于高分子材料聚合物及載藥膠束技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種Y型兩親嵌段共聚物及其制備方法和以該共聚物為載體靶向胞內(nèi)釋藥的載藥膠束。

背景技術(shù)：

聚乳酸(Polylactic acid，PLA)又稱聚丙交酯，是由來源豐富的乳酸分子通過化學(xué)方法得到的，是20世紀(jì)90年代迅速發(fā)展起來的新一代可完全降解的高分子材料。聚乳酸在體內(nèi)的降解產(chǎn)物是乳酸(人和所有高級(jí)動(dòng)物體內(nèi)的正常代謝產(chǎn)物)，最終會(huì)分解為無毒的水和二氧化碳。正因?yàn)榫廴樗峋哂猩锵嗳菪院涂山到庑允蛊涑蔀樗幬镙斔腕w系的熱點(diǎn)，并且已被美國FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床。

兩親聚合物膠束作為抗腫瘤藥物載體具有廣闊的應(yīng)用前景，它可以有效增強(qiáng)藥物穩(wěn)定性，提高藥物的選擇性并能夠根據(jù)病灶部位與正常組織的環(huán)境差異控制釋放藥物，使藥物有效地富集于腫瘤組織處，進(jìn)而提高治療效果和病人的生命質(zhì)量。基于聚乳酸、聚甲基丙烯酸-N,N-二甲氨基乙酯這兩種具有良好生物相容性的材料，設(shè)計(jì)并合成了穩(wěn)定性增強(qiáng)的載藥膠束，期望將其用于抗腫瘤藥物的輸送體系中。

兩親性聚合物既含有親水性鏈段又含有疏水性鏈段，它們之間通過共價(jià)鍵結(jié)合在一起。在選擇性溶劑中，聚合物可以自組裝形成不同形態(tài)的膠束，包括球形、囊泡、棒狀、管狀和葉瓣形等。根據(jù)自組裝形成膠束原理的不同，聚合物膠束可分為嵌段共聚物膠束、聚電解質(zhì)共聚物膠束、接枝共聚物膠束和非共價(jià)鍵膠束等。

聚合物膠束是在多種驅(qū)動(dòng)力協(xié)同作用下形成的，膠束內(nèi)分子間是以非共價(jià)鍵締合的，因而其在溶液中不穩(wěn)定，容易受外界因素如溫度、pH值、溶劑、稀釋和剪切力等影響，導(dǎo)致膠束結(jié)構(gòu)的解體。理想狀況下，載藥膠束在藥物輸送過程中要具有很好的穩(wěn)定性才能將藥物有效地輸送到病灶部位從而達(dá)到較好的療效。因此作為載藥材料，設(shè)計(jì)并合成穩(wěn)定的膠束就變得十分重要。

阿霉素(Doxorubicin)是一種常見的抗腫瘤模型藥物，廣泛應(yīng)用于癌癥的治療中，其作用機(jī)理主要通過插入DNA中并與之相互作用抑制核酸的合成，從而抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。本發(fā)明通過包載和釋放阿霉素用來研究所合成聚合物的體外釋放能力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明解決的技術(shù)問題是提供了一種Y型兩親嵌段共聚物，以該共聚物為載體靶向胞內(nèi)釋藥的載藥膠束，以及它們的制備方法，該方法設(shè)計(jì)制備了一系列Y型兩親共聚物載藥體系，通過選擇合適的藥物載體構(gòu)筑藥物輸送體系可以降低藥物的毒副作用，改變藥物的藥代動(dòng)力學(xué)從而提高療效。

本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題采用如下技術(shù)方案，Y型兩親嵌段共聚物，其特征在于該Y型兩親嵌段共聚物的結(jié)構(gòu)式為：

本發(fā)明所述的Y型兩親嵌段共聚物的制備方法，其特征在于具體步驟為：

(1)雙羥基引發(fā)劑的合成

向圓底燒瓶中加入三羥甲基乙烷，再加入干燥丙酮攪拌10min，然后用注射器吸取三乙胺加入到圓底燒瓶中，攪拌30min后將圓底燒瓶置于冰浴中，用恒壓滴定漏斗將2-溴代異丁酰溴溶液以8-10s/滴的速率滴加到圓底燒瓶中，待2-溴代異丁酰溴溶液滴加完全后，撤去冰浴，在室溫條件下反應(yīng)24h，待反應(yīng)完全后抽濾反應(yīng)產(chǎn)物，收集濾液，向?yàn)V液中加入無水Na₂CO₃，在室溫條件下攪拌5h，然后抽濾，得到的淡黃色濾液過硅膠柱純化，收集目標(biāo)產(chǎn)物，旋蒸濃縮后于35℃真空干燥得到白色固體雙羥基引發(fā)劑；

(2)Y型疏水嵌段PLA的合成

將反應(yīng)瓶放入加熱套中，抽真空，通氮?dú)夥磸?fù)三次，待反應(yīng)瓶溫度降至室溫后，在氮?dú)鈼l件下向反應(yīng)瓶?jī)?nèi)加入單體丙交酯，抽真空/充氮?dú)?0min，然后在氮?dú)鈼l件下向反應(yīng)瓶中加入步驟(1)得到的雙羥基引發(fā)劑，抽真空/充氮?dú)?0min，將反應(yīng)瓶置于130℃的油浴中，待其完全溶解后，用注射器吸取辛酸亞錫加入至反應(yīng)瓶中，關(guān)閉氮?dú)鈹嚢璺磻?yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后，取出反應(yīng)瓶，降至室溫后向反應(yīng)瓶中加入二氯甲烷溶解反應(yīng)產(chǎn)物，待其全部溶解后，將此溶液逐滴加入到乙醚中沉淀，重復(fù)溶解-沉淀-抽濾三次，收集沉淀物，置于35℃的真空干燥箱中干燥得到白色固體Y型疏水嵌段PLA；

(3)Y型兩親嵌段共聚物PLA-b-PDMAEMA的合成

將反應(yīng)瓶放入加熱套中，抽真空，通氮?dú)夥磸?fù)三次，待反應(yīng)瓶溫度降到室溫后，在氮?dú)鈼l件下向反應(yīng)瓶中加入步驟(2)得到的Y型疏水嵌段PLA大分子引發(fā)劑和無水四氫呋喃，鼓泡30min，然用注射器吸取聚甲基丙烯酸-N,N-二甲氨基乙酯PMDETA加入到反應(yīng)瓶中，繼續(xù)鼓泡30min，在氮?dú)鈼l件下向反應(yīng)瓶中加入CuBr，將反應(yīng)瓶密封后置于60℃的油浴中反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后，取出反應(yīng)瓶，降至室溫后向反應(yīng)瓶中加入三氯甲烷溶解反應(yīng)產(chǎn)物，將溶液通過堿性氧化鋁柱子以三氯甲烷為流動(dòng)性將銅離子除去，收集溶液，旋蒸濃縮，然后將其沉淀在乙醚中，重復(fù)溶解-沉淀-抽濾兩次，收集沉淀物，置于35℃的真空干燥箱中干燥得到白色固體Y型兩親嵌段共聚物PLA-b-PDMAEMA。

進(jìn)一步優(yōu)選，步驟(1)中所述的三羥基甲基乙烷、三乙胺與2-溴代異丁酰溴的投料摩爾比為1.12:1.07:1，過硅膠柱純化采用干法上樣，以體積比為2:3的乙酸乙酯與石油醚混合溶液為流動(dòng)相。

進(jìn)一步優(yōu)選，步驟(2)中所述的單體丙交酯與雙羥基引發(fā)劑的投料摩爾比為27.78:1，單體丙交酯為L(zhǎng)-丙交酯或D-丙交酯中的一種或多種。

本發(fā)明所述的以Y型兩親嵌段共聚物為載體靶向胞內(nèi)釋藥的載藥膠束，其特征在于該載藥膠束由上述Y型兩親嵌段共聚物和疏水性藥物組成，其中疏水性藥物包裹在Y型兩親嵌段共聚物疏水嵌段形成的疏水核中。

進(jìn)一步優(yōu)選，所述的載藥膠束的粒徑為40-200nm。

進(jìn)一步優(yōu)選，所述的疏水性藥物為阿霉素。

進(jìn)一步優(yōu)選，所述的Y型兩親嵌段共聚物為共聚物PDLA-b-PDMAEMA、共聚物PLLA-b-PDMAEMA或由共聚物PDLA-b-PDMAEMA和共聚物PLLA-b-PDMAEMA組成的立構(gòu)復(fù)合物sc-PLA-b-PDMAEMA。

本發(fā)明所述的以Y型兩親嵌段共聚物為載體靶向胞內(nèi)釋藥的載藥膠束的制備方法，其特征在于具體步驟為：將上述得到的Y型兩親嵌段共聚物PLA-b-PDMAEMA和疏水性藥物溶解于共溶劑中，其中共溶劑為N,N-二甲基甲酰胺或三乙胺，再向上述溶液中滴加二次蒸餾水直至載藥膠束溶液的濃度為0.5mg/mL，然后透析除去共溶劑，過濾，冷凍干燥得到以Y型兩親嵌段共聚物為載體靶向胞內(nèi)釋藥的載藥膠束。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下有益效果：

1、所合成的Y型兩親性聚合物PLA-b-PDMAEMA既含有親水性鏈段又含有疏水性鏈段，將疏水性的抗腫瘤藥物包載在核中，顯著地增加了藥物的溶解度，有效地提高了藥物的生物利用度，同時(shí)也避免了藥物降解活性，增加了藥物的穩(wěn)定性，大大減少了毒副作用；

2、基于聚乳酸、聚甲基丙烯酸-N，N-二甲氨基乙酯(PDMAEMA)設(shè)計(jì)的材料具有良好的生物利用度；

3、聚乳酸具有生物相容性和可降解性，在體內(nèi)可以自行降解成乳酸，最終會(huì)分解成無毒的水和二氧化碳；

4、聚甲基丙烯酸-N,N-二甲氨基乙酯的單體分子結(jié)構(gòu)賦予其多重環(huán)境響應(yīng)性，在生物醫(yī)藥、藥物控制釋放及功能吸附材料上有廣泛的應(yīng)用。

基于兩親嵌段聚合物膠束的基本特征，它主要用作抗腫瘤藥物載體。與其他載藥材料相比，兩親嵌段聚合物膠束載體具有很多優(yōu)勢(shì)：膠束外殼的親水作用和納米級(jí)的粒徑(一般為20-100nm)使其不易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬，并且可阻止細(xì)胞和蛋白質(zhì)的吸附，因而可以在血液中長(zhǎng)時(shí)間地循環(huán)并保持穩(wěn)定，增大了它們到達(dá)腫瘤部位并利用腫瘤細(xì)胞的“增強(qiáng)滲透與滯留效應(yīng)”達(dá)到被動(dòng)靶向效果幾率。另外，納米級(jí)的粒徑也使它們?cè)谀[瘤部位展現(xiàn)出更好的生物膜穿透能力?？梢酝ㄟ^對(duì)修飾聚合物膠束外殼如接入配體或者抗體等實(shí)現(xiàn)主動(dòng)靶向，同時(shí)也可以通過設(shè)計(jì)加入pH敏感、溫度敏感、氧化還原敏感等基團(tuán)實(shí)現(xiàn)多重環(huán)境響應(yīng)的聚合物膠束。

聚甲基丙烯酸-N,N-二甲氨基乙酯在水中的pH/溫度敏感行為研究，當(dāng)溶液pH值小于聚合物離解常數(shù)(pKa約為7.0-7.3)時(shí)，聚合物鏈呈舒展構(gòu)狀態(tài)，沒有相變；當(dāng)pH值大于pKa時(shí)，聚合物發(fā)生去質(zhì)子化作用，析出部分聚合物，且對(duì)應(yīng)的低臨界溶解溫度值(lower critical solution tenperature，LCST)隨pH的升高而降低。體外藥物釋放試驗(yàn)表明，與pH＝7相比，pH＝5時(shí)載藥膠束較快釋放姜黃素。另外，體內(nèi)藥物代謝研究表明，與單獨(dú)的阿霉素溶液相比，載藥膠束在血液中的保留時(shí)間變長(zhǎng)并且膠束中的阿霉素也會(huì)被延遲清除。這些結(jié)果說明，這種pH響應(yīng)型的聚合物非常有潛質(zhì)作為疏水性抗癌藥物的載體。

本發(fā)明制備了一系列Y型兩親共聚物載藥體系，通過選擇合適的藥物載體構(gòu)筑藥物輸送體系可以降低藥物的毒副作用，改變藥物的藥代動(dòng)力學(xué)從而提高療效，操作簡(jiǎn)單，對(duì)設(shè)備要求低，采用現(xiàn)有設(shè)備即可進(jìn)行生產(chǎn)。

附圖說明

圖1中(a)、(b)、(c)分別為制備的雙羥基引發(fā)劑、Y型疏水嵌段PLA、Y型兩親嵌段共聚物PLA-b-PDMAEMA的核磁圖譜；

圖2為制備的Y型兩親嵌段共聚物PLA-b-PDMAEMA的凝膠滲透色譜圖；

圖3中(a)、(b)、(c)分別為制備的共聚物PDLA-b-PDMAEMA、共聚物PLLA-b-PDMAEMA和立構(gòu)復(fù)合物sc-PLA-b-PDMAEMA以芘為探針得到的熒光光譜的I₁/I₃隨濃度的變化曲線；

圖4中(a)、(b)、(c)分別為制備的共聚物PDLA-b-PDMAEMA、共聚物PLLA-b-PDMAEMA和立構(gòu)復(fù)合物sc-PLA-b-PDMAEMA膠束溶液的動(dòng)態(tài)光散射圖；

圖5中(A)、(B)、(C)為別為制備的共聚物PDLA-b-PDMAEMA、共聚物PLLA-b-PDMAEMA和立構(gòu)復(fù)合物sc-PLA-b-PDMAEMA膠束溶液的透射電鏡圖；

圖6是共聚物PDLA-b-PDMAEMA、共聚物PLLA-b-PDMAEMA和立構(gòu)復(fù)合物sc-PLA-b-PDMAEMA膠束溶液的Zeta電位圖片；

圖7是載藥膠束的細(xì)胞外液模擬液中的藥物釋放曲線；

圖8是共聚物PDLA-b-PDMAEMA、共聚物PLLA-b-PDMAEMA和立構(gòu)復(fù)合物sc-PLA-b-PDMAEMA膠束溶液的DSC(差示掃描量熱法)曲線；

圖9是采用MTT法測(cè)定的不同濃度的Y型兩親嵌段共聚物對(duì)于小鼠L929細(xì)胞的影響；

圖10是細(xì)胞毒性熒光圖。

具體實(shí)施方式

以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容做進(jìn)一步詳細(xì)說明，但不應(yīng)該將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

結(jié)構(gòu)式中的m、n、p分別代表聚合度。

(1)雙羥基引發(fā)劑的合成

向圓底燒瓶中加入三羥甲基乙烷，再向其中加入新蒸干燥丙酮攪拌10min，然后用注射器吸取三乙胺加入到圓底燒瓶中，攪拌30min，將圓底燒瓶置于冰浴中，用恒壓滴定漏斗將2-溴代異丁酰溴溶液(先向恒壓滴定漏斗中加入適量新蒸干燥丙酮，然后向其中加入2-溴代異丁酰溴)以8-10s/滴的速率加入到圓底燒瓶中。待2-溴代異丁酰溴溶液加入完全后，撤去冰浴。在室溫條件下反應(yīng)24h。待反應(yīng)完全后，發(fā)現(xiàn)溶液變黃，并且有大量的白色固體。抽濾反應(yīng)產(chǎn)物，收集濾液，向?yàn)V液中加入無水Na₂CO₃，在室溫條件攪拌5h。然后抽濾，得到的淡黃色濾液過硅膠柱純化。收集目標(biāo)產(chǎn)物，旋蒸濃縮，于35℃真空干燥，得到白色固體。

所述的三羥甲基乙烷、三乙胺與2-溴代異丁酰溴的投料摩爾比為1.12:1.07:1，過硅膠柱純化采用干法上樣，以體積比為2:3的乙酸乙酯與石油醚混合溶液為流動(dòng)相。

圖1(a)為雙羥基引發(fā)劑在氘代二甲基亞砜溶液中的核磁氫譜圖。與原料三羥甲基乙烷的核磁譜圖¹HNMR(DMSO)圖相比發(fā)現(xiàn)，此核磁氫譜圖在化學(xué)位移為δ＝1.89ppm和δ＝3.97ppm處出現(xiàn)兩個(gè)新的單峰，其它峰的化學(xué)位移幾乎沒有變化。將圖中d(甲基)的積分面積設(shè)置為3，分別對(duì)圖譜中峰面積進(jìn)行積分。結(jié)果發(fā)現(xiàn)化學(xué)位移為δ＝1.89ppm峰的積分值為6，它們是2-溴代異丁酰溴的兩個(gè)甲基的氫原子；化學(xué)位移為δ＝3.27-3.29ppm峰的積分值為4，它們和原料三羥甲基乙烷的亞甲基的化學(xué)位移幾乎一致，所以它們是產(chǎn)物中的兩個(gè)羥甲基結(jié)構(gòu)中的亞甲基；化學(xué)位移為δ＝3.97ppm峰的積分值為2，它是與酯基相連的亞甲基上的氫原子；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在化學(xué)位移為δ＝4.53-4.56ppm處峰的積分值為2，化學(xué)位移與原料三羥甲基乙烷中的羥基幾乎一致，可斷定其為兩個(gè)羥基。由此可知通過三乙胺作為縛酸劑我們成功合成了帶有溴原子的雙羥基引發(fā)劑。

(2)Y型疏水嵌段PLA的合成

以辛酸亞錫為催化劑，雙羥基引發(fā)劑引發(fā)丙交酯開環(huán)聚合形成Y型聚乳酸(PLLA/PDLA)。具體過程如下：烤一只史萊克瓶子(將瓶子放入加熱套中，抽真空，通氮?dú)夥磸?fù)三次)，待瓶子溫度降至室溫后，在開大氮?dú)獾臈l件下，向反應(yīng)瓶?jī)?nèi)加入單體丙交酯(L-LA或/和D-LA)，抽真空/充氮?dú)?0min；然后在開大氮?dú)獾臈l件下，向反應(yīng)瓶中加入雙羥基引發(fā)劑，抽真空/充氮?dú)?0min，將史萊克瓶子置于130℃的油浴中，待其完全溶解之后，用注射器吸取辛酸亞錫加入至反應(yīng)瓶(開大氮?dú)?，關(guān)閉氮?dú)鈹嚢璺磻?yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束后，取出反應(yīng)瓶，降至室溫后，向反應(yīng)瓶中加入二氯甲烷(CH₂Cl₂)溶解反應(yīng)產(chǎn)物，待其全部溶解后，將此溶液逐滴地加入到乙醚中沉淀(4-5h)，重復(fù)溶解-沉淀-抽濾三次。收集沉淀物，置于35℃的真空干燥箱中干燥，得白色固體。

所述的丙交酯與雙羥基引發(fā)劑的投料摩爾比為27.78:1，引發(fā)開環(huán)聚合的催化劑為辛酸亞錫，無水無氧操作的關(guān)鍵在于抽真空、通氮?dú)夥磸?fù)進(jìn)行三次。

圖1(b)是端溴原子的Y型疏水嵌段聚乳酸(PDLA)在氘帶氯仿中的核磁共振氫譜圖，以此譜圖為例，證明不同手性分子量接近的端溴原子PLA的成功合成。與圖1(a)相比，圖1(b)明顯多出新的多重峰。在化學(xué)位移為δ＝1.58-1.60ppm處的雙重峰和δ＝5.14-5.19ppm處的四重峰分別是聚乳酸重復(fù)單元中的甲基和次甲基的特征峰，并且δ＝1.58-1.60ppm處峰的積分面積正好是δ＝5.14-5.19ppm處峰的積分面積的3倍，這說明引發(fā)劑成功引發(fā)丙交酯的開環(huán)聚合反應(yīng)?；瘜W(xué)位移δ＝1.07ppm即d是引發(fā)劑中的甲基，將其設(shè)置為3，求出e處的積分面積即可求得所合成的聚合物的分子量。

(3)Y型兩親嵌段共聚物PLA-b-PDMAEMA的合成

烤一只史萊克瓶子(將瓶子放入加熱套中，抽真空，通氮?dú)夥磸?fù)三次)，待瓶子溫度降到室溫后，開大氮?dú)?，向反?yīng)瓶中加入Y型疏水嵌段PLA大分子引發(fā)劑和無水四氫呋喃，鼓泡30min。然用注射器吸取PMDETA加入到反應(yīng)瓶中，繼續(xù)鼓泡30min，在開大氮?dú)獾臈l件下向反應(yīng)瓶中加入CuBr，將反應(yīng)瓶密封后置于60℃的油浴中反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束后，取出反應(yīng)瓶，降至室溫后向反應(yīng)瓶中加入三氯甲烷(CHCl₃)溶解反應(yīng)產(chǎn)物，將溶液通過堿性氧化鋁柱子以三氯甲烷為流動(dòng)性將銅離子除去，收集溶液，旋蒸濃縮，然后將其沉淀在適量體積的乙醚中(4-5h)，重復(fù)溶解-沉淀-抽濾兩次。收集沉淀物，置于35℃的真空干燥箱中干燥，得白色固體。

所述的溶劑四氫呋喃必須是新回流的無水試劑，除去銅離子所用的為堿性氧化鋁的柱子，以三氯甲烷為流動(dòng)相。

圖1(c)為Y型兩親嵌段共聚物PDLA-b-PDMAEMA在氘代氯仿中的核磁共振氫譜。以此圖譜為例，說明不同手性兩親共聚物的成功合成。與圖1(b)相比，該核磁圖譜顯得更為復(fù)雜，有多個(gè)新峰出現(xiàn)在圖譜里。如圖1所示，c和d分別是PDMAEMA與氧原子和氮原子相連兩個(gè)亞甲基，它們各自峰的積分面積與化學(xué)位移在δ＝2.29ppm(與氮原子相連的兩個(gè)甲基)處的積分面積接近為1:3，這與它們?cè)趩误w中的比例是基本一致；同時(shí)，它們與化學(xué)位移在δ＝2.57ppm(亞甲基)的積分面積比為1:1；與δ＝0.89-1.14ppm(甲基)處峰的面積積分比為2:3，這些都說明PDMAEMA的成功聚合。通過將化學(xué)位移在δ＝4.33-4.39ppm(聚乳酸鏈端的次甲基的特征峰)處峰的積分面積設(shè)置為2，得到h和c處峰的積分面積，即可求出聚合度進(jìn)而求出Y型兩親共聚物的分子量。

凝膠滲透色譜(GPC)

樣品的分子量及其分子量分布使用waters公司的waters 1515儀器進(jìn)行測(cè)試。儀器配置為：三根LP柱串聯(lián)，柱形：Styragel凝膠色譜柱(孔的尺寸為102,103和)。流動(dòng)相DMF，流速1mL/min，柱溫45℃，PEO標(biāo)樣校正。

樣品配制方法：取10mg樣品，溶于1mL色譜純DMF，并用孔徑為0.22μm的有機(jī)膜過濾。

測(cè)試方法：首先開機(jī)走基線，待基線走平后，取20μL的樣品注入儀器，開始檢測(cè)。制備共聚物PDLA-b-PDMAEMA和共聚物PLLA-b-PDMAEMA膠束溶液

準(zhǔn)確稱取100mg共聚物PDLA-b-PDMAEMA和共聚物PLLA-b-PDMAEMA，將其分別放入干凈的100mL單口圓底燒瓶中并向其中加入6mL新蒸的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，攪拌使其溶解。待其完全溶解之后，使用精密型恒壓滴液漏斗以30s/滴的速率向兩個(gè)反應(yīng)瓶中各滴加20mL二次蒸餾水。待二次蒸餾水滴加完畢后，繼續(xù)攪拌2.5h，然后將其轉(zhuǎn)移至2000Da的透析袋中并將透析袋置于盛有二次蒸餾水的燒杯中進(jìn)行透析4天。待透析袋中的DMF被完全置換出來，將透析袋中的溶液轉(zhuǎn)移至200mL的容量瓶中，用二次蒸餾水定容至刻度線得到濃度為0.5mg/mL的共聚物PDLA-b-PDMAEMA膠束溶液(母液)和共聚物PLLA-b-PDMAEMA膠束溶液(母液)，靜置，備用。

制備PDLA/PLLA-b-PDMAEMA(sc-PLA-b-PDMAEMA)的立構(gòu)復(fù)合膠束溶液

分別準(zhǔn)確稱取50mg共聚物PDLA-b-PDMAEMA和共聚物PLLA-b-PDMAEMA于一個(gè)干燥干凈的100mL單口圓底燒瓶中，用6mL新蒸DMF攪拌溶解，待其完全溶解后繼續(xù)攪拌6h。然后用精密恒壓滴液漏斗以30s/滴的速率向瓶子中滴加25mL二次蒸餾水。待二次蒸餾水滴加完畢后，繼續(xù)攪拌4h，然后將其轉(zhuǎn)移至2000Da的透析袋中并將透析袋置于盛有二次蒸餾水的燒杯中進(jìn)行透析4天。待透析袋中的DMF被完全置換出來，將透析袋中的溶液轉(zhuǎn)移至200mL的容量瓶中，用二次蒸餾水定容至刻度線得到濃度為0.5mg/mL的聚合物膠束溶液(母液)，靜置，備用。

熒光光譜(FL)的測(cè)定

樣品配置方法：首先將10uL芘的丙酮溶液(c＝6×10^-4mol/L)加至10mL容量瓶中，待丙酮完全揮發(fā)后向其中加入不同體積的膠束溶液然后將其定容，配置成一系列濃度梯度的含有芘的膠束溶液。超聲3次(2min/次)，靜置6h進(jìn)行測(cè)試。

采用美國Perkin Elmer公司的LS-45/55/熒光/磷光/發(fā)光分光光度計(jì)行測(cè)試。將掃描模式設(shè)置為發(fā)射，掃描范圍為350-450nm，激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)置為336nm。將配置好樣品倒入石英比色皿中(溶液約占比色皿體積的2/3)，換樣時(shí)用母液潤(rùn)洗，然后放入儀器中進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試按照濃度從小到大的順序。

動(dòng)態(tài)光散射(DLS)

采用英國馬爾文Zs-90納米激光粒度儀進(jìn)行測(cè)試。首先將聚合物膠束溶液用孔徑為0.45μm的水系濾膜過濾，靜置過夜。然后取適量的樣品(高度為1.5cm)于聚苯乙烯樹脂比色皿中，將樣品室溫度設(shè)置為25℃，平行測(cè)試3次。

透射電鏡(TEM)

使用日本JEOL公司的JEM 2010透射電鏡進(jìn)行測(cè)試。

樣品制備方法：將聚合物膠束溶液用0.45μm的水膜過濾，濾液靜置一天；然后取一滴靜置后的濾液滴于鍍有碳膜的銅網(wǎng)上，待其自然晾干后，在透射電鏡中觀察膠束形貌。

差示掃描量熱儀(DSC)

使用德國Netzsch公司的Photo-DSC 204F1 Phoenix儀器進(jìn)行差示掃描量熱的測(cè)試。樣品測(cè)試在氮?dú)鈿夥罩羞M(jìn)行。首先稱取一定量的樣品于小鋁鍋中，在專用壓蓋機(jī)上將蓋子壓緊，放入儀器中。然后選擇儀器自帶的校正方法進(jìn)行溫度和靈敏度校正，設(shè)置參數(shù)(吹掃氣40mL/min；保護(hù)氣60mL/min；起始溫度20℃；終止溫度300℃；升溫速度10℃/min)進(jìn)行測(cè)試。每組實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用液氮冷卻。

紫外可見光光譜(UV-vis)

采用美國Agilent公司的cary 100型紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)試。將樣品倒入石英比色皿中(溶液約占比色皿體積的2/3)，換樣時(shí)用母液潤(rùn)洗，然后放入儀器中進(jìn)行測(cè)試，測(cè)試按照濃度從小到大的順序。

制備共聚物PLLA-b-PDMAEMA載藥膠束

準(zhǔn)確稱取6mg鹽酸阿霉素和適量的三乙胺(其中三乙胺與鹽酸阿霉素的投料摩爾比為3:1)于一個(gè)干凈干燥的100mL圓底燒瓶瓶中，然后向其中加入6mL共溶劑N,N-二甲基甲酰胺(DMF)攪拌2h后向其中加入60mg共聚物PLLA-b-PDMAEMA，待其完全溶解后將其轉(zhuǎn)移至3500Da的透析袋中，并將其置于盛有二次蒸餾水的燒杯中，每4h換一次水，透析24h。接著將透析袋中的溶液進(jìn)行冷凍干燥，稱重并將其放置于-20℃的環(huán)境中待用。

制備立構(gòu)復(fù)合物sc-PLA-b-PDMAEMA載藥膠束

準(zhǔn)確稱取6mg鹽酸阿霉素和適量的三乙胺(其中三乙胺與鹽酸阿霉素的投料摩爾比為3:1)于一個(gè)干凈干燥的100mL圓底燒瓶瓶中，然后向其中加入3mL共溶劑N,N-二甲基甲酰胺(DMF)攪拌2h后向其中加入立構(gòu)復(fù)合物(其中共聚物PDLA-b-PDMAEMA和共聚物PLLA-b-PDMAEAM分別為30mg)，繼續(xù)攪拌2h后將其轉(zhuǎn)移至3500Da的透析袋中，并將其置于盛有二次蒸餾水的燒杯中，每4h換一次水，透析24h。接著將透析袋中的溶液進(jìn)行冷凍干燥，稱重并將其放置于-20℃的環(huán)境中待用。

聚合物膠束的載藥量和包封率以及體外釋放均通過紫外–可見光光譜進(jìn)行測(cè)試，

MTT法檢測(cè)兩親嵌段共聚物的細(xì)胞毒性

我們采用小鼠L929纖維母細(xì)胞進(jìn)行研究：96孔板內(nèi)，L929細(xì)胞以每孔1×10⁴個(gè)這樣的密度種入DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5％的CO₂的條件下培育24h。除去培養(yǎng)基，加入不同濃度(0.005mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mL)的聚合物培養(yǎng)基溶液，并且用不加任何聚合物的培養(yǎng)基作為控制對(duì)照組。培養(yǎng)72h，然后用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的存活率。

圖9為不同濃度的聚合物對(duì)于小鼠L929細(xì)胞的影響。從圖中可以分析，當(dāng)濃度高達(dá)0.5mg/mL時(shí)經(jīng)過72h培養(yǎng)，小鼠細(xì)胞仍舊保持著較高的存活率，這說明合成的聚合物具有良好的生物相容性。

通過在體外對(duì)細(xì)胞蛋白進(jìn)行染色來進(jìn)一步研究聚合物的生物相容性。

小鼠L929纖維母細(xì)胞，24孔板內(nèi)，L929細(xì)胞以每孔2×10⁴個(gè)這樣的密度種入DMEM(含有0.005mg/mL和0.5mg/mL聚合物)培養(yǎng)基中，以不加聚合物的培養(yǎng)基為控制對(duì)照組，于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5％的CO₂的條件下培育48h后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熒光染色。除去培養(yǎng)基，在室溫下將細(xì)胞放入2.5wt％的聚甲醛溶液中進(jìn)行固定15min，然后進(jìn)行沖洗并將其放在2wt％BSA溶液中進(jìn)行培養(yǎng)。接著在室溫條件下，將這些細(xì)胞用FITC-鬼筆環(huán)肽培養(yǎng)1h，然后用PBS沖洗接著在室溫條件下用DAPI進(jìn)行染核培養(yǎng)。用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的形貌

圖10為細(xì)胞毒性熒光圖。在本實(shí)驗(yàn)中，用FITC-鬼筆環(huán)肽(綠色熒光)DAPI(藍(lán)色)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了染色。從圖中我們發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞在含有不同濃度聚合物培養(yǎng)基中進(jìn)行48h培養(yǎng)后，其形貌于控制對(duì)照組相比，并沒有顯著的變化。這進(jìn)一步說明所合成的聚合物具有良好的生物相容性。

綜上所述，熒光、透射電鏡和動(dòng)態(tài)光散射分析結(jié)果表明，相比于聚合物膠束，立構(gòu)復(fù)合物膠束具有更低的臨界膠束濃度值和更小的粒徑。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明，聚合物及立構(gòu)復(fù)合物均具有良好的生物相容性。通過包載和釋放阿霉素研究了聚合物膠束的體外釋放藥物能力，結(jié)果表明，與聚合物載藥膠束相比，立構(gòu)復(fù)合物載藥膠束表現(xiàn)出較緩慢的體外釋放速度，這是立構(gòu)復(fù)合作用增強(qiáng)了膠束的穩(wěn)定性導(dǎo)致的。

以上實(shí)施例描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征及優(yōu)點(diǎn)，本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明原理的范圍下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)均落入本發(fā)明保護(hù)的范圍內(nèi)。