本發(fā)明涉及生物技術領域，具體涉及一種人皮膚成纖維細胞培養(yǎng)液及培養(yǎng)方法。

背景技術：

隨著人皮膚成纖維細胞分離、培養(yǎng)技術的成熟以及生物醫(yī)學工程等技術的發(fā)展，以培養(yǎng)人皮膚成纖維細胞為基礎的生物人工皮膚逐漸發(fā)展起來，人們一直希望采用這種體外皮膚支持的方法來代替患者損傷的皮膚功能，為患者等待皮膚移植或自身皮膚再生創(chuàng)造條件。目前認為，生物人工皮膚要達到理想支持效果至少需要10¹⁰以上數量級的細胞，而在保障細胞活性的條件下，人皮膚成纖維細胞數量越多，其支持及治療效果將越佳，因此，人皮膚成纖維細胞體外大規(guī)模培養(yǎng)技術已成為生物人工皮膚技術發(fā)展的核心技術。

雖然人皮膚成纖維細胞體外大規(guī)模培養(yǎng)技術己取得了許多重大的進展，目前仍難于滿足生物人工皮膚發(fā)展的需要，存在著以下問題：

1、動物培養(yǎng)環(huán)境中抑制因素的積累是提高細胞密度的主要限制因素。1)體外動物細胞培養(yǎng)中氨離子的積累是抑制細胞生長的主要因素之一，對細胞有很大的毒害作用。2)高乳酸濃度抑制細胞生長。

2、氧氣供應相對不足。氧氣是動物細胞生長的必要物質，且人皮膚成纖維細胞更是一種高耗氧量細胞，在人皮膚成纖維細胞大規(guī)模培養(yǎng)過程中，消耗大量氧氣，可導致溶氧急劇降低。這種氧的缺乏也不僅可直接造成細胞的損害，影響細胞的生長速度，還促進培養(yǎng)基中葡萄糖的無氧酵解，增加乳酸的產生，使得培養(yǎng)基中的PH值急劇下降，又對人皮膚成纖維細胞造成進一步的損害。

3、機械損傷。人皮膚成纖維細胞是錨定依賴性細胞，其功能的有效發(fā)揮必須依賴于對支架材料等支持物的貼附，而在眾多的體外人皮膚成纖維細胞規(guī)模培養(yǎng)方法中，微載體懸浮培養(yǎng)技術較其它培養(yǎng)技術具有以下優(yōu)點：1)表面積/體積比大，單位體積細胞培養(yǎng)基細胞產率高；2)兼有懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點；3)培養(yǎng)基利用率高；4)放大容易，可以達到幾升以上的容積，細胞收獲過程不復雜；5)可用簡單的顯微鏡即可觀察細胞在微載體表面的生長情況；因而被廣泛應用人皮膚成纖維細胞體外規(guī)?；呙芏热S培養(yǎng)術中。但是，在細胞培養(yǎng)過程中許多作用力(如端流和氣泡產生的剪切力、微載體間的碰撞)的作用下，貼在微載體上生長的細胞會受到損傷，抑制細胞生長，并導致細胞死亡。

綜上所述，大規(guī)模細胞培養(yǎng)過程中，維持細胞高的活力是個富有挑戰(zhàn)性的課題。最初的研究似乎表明細胞死亡大多由于壞死，而人們逐漸認識到至少是一些細胞系在生物反應器中細胞死亡主要原因是由于氧氣、營養(yǎng)物質的缺乏和氨、乳酸等代謝產物蓄積所引起細胞凋亡所致。隨著細胞凋亡分子機制研究的不斷深入，細胞凋亡的發(fā)生被認為是大規(guī)模細胞培養(yǎng)過程的重要制約環(huán)節(jié)，預防并控制細胞凋亡也因此成為研究熱點。

因此，需要研發(fā)一種人皮膚成纖維細胞培養(yǎng)液，其可在同等條件下有效減輕規(guī)?；囵B(yǎng)中各種培養(yǎng)環(huán)境因素對人皮膚成纖維細胞造成的損傷，并抑制人皮膚成纖維細胞凋亡的發(fā)生，達到進一步提高人皮膚成纖維細胞規(guī)?；囵B(yǎng)的密度和功能狀態(tài)的效果。

技術實現要素：

有鑒于此，本發(fā)明提供了一種人皮膚成纖維細胞培養(yǎng)液，所述對人皮膚成纖維細胞的規(guī)?；囵B(yǎng)具有良好的效果。

為了實現上述目的，本發(fā)明提供如下技術方案：

本發(fā)明公開了一種人皮膚成纖維細胞培養(yǎng)液，包括：培養(yǎng)基、保護劑、胎牛血清和HEPES；

所述保護劑包括：刺玫果總黃酮提取物、黃芪多糖和胰島素。

優(yōu)選的，所述培養(yǎng)液包括以下組分：

在本發(fā)明提供的一實施例中，所述培養(yǎng)液包括以下組分：

在本發(fā)明提供的另一實施例中，所述培養(yǎng)液包括以下組分：

在本發(fā)明提供的另一實施例中，所述培養(yǎng)液包括以下組分：

優(yōu)選地，所述刺玫果總黃酮提取物的制備方法包括以下步驟：

a)將刺玫果干燥粉碎，用12～16體積倍量的70～80％乙醇微波提取3次，每次提取的時間為40min、20min和10min，過濾后合并提取液；

b)將步驟a得到的提取液上大孔吸附樹脂柱，經水洗至無色后，用70～90％乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇得浸膏，干燥至恒重。

優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基為DMEM。

山刺玫(Rosa davurica Pall.)為薔薇科薔薇屬落葉灌木植物,主要分布于我國東北地區(qū),其果實為刺玫果。傳統醫(yī)學將刺玫果列為補藥,據《中華大辭典》稱:刺玫果具有健脾理氣、養(yǎng)血調經之功效?，F代醫(yī)學研究發(fā)現,刺玫果具有抗衰老、抗疲勞、耐缺氧,增強人體免疫功能作用,長期服用能顯著提高人體中SOD含量。

刺玫果為藥食同源的寶貴資源，其富含有機酸,黃酮、香豆素、昌醇、三菇、烯烴、皂試、揮發(fā)油、多種礦物質、微量元素等多種活性成分,其中的黃酮類化合物具有抗氧化、降低脂質過氧化反應、抗衰老和抗自由基等作用。

組分中的黃芪多糖等可有效保護細胞膜和線粒體膜的完整性，從而減少各種培養(yǎng)環(huán)境因素對人皮膚成纖維細胞的損傷，能有效保護人皮膚成纖維細胞膜的完整性。

氧自由基不僅通過對生物膜中不飽和脂肪酸進行過氧化引起細胞損傷，而且還能通過脂氫過氧化物的分解產物引起細胞損傷，自由基(或氧化應激)在細胞凋亡過程起重要的誘導作用。本發(fā)明組分中的刺玫果總黃酮提取物是一種天然的水溶性抗氧化劑，它能通過淬滅生物膜內的自由基活性保護人皮膚成纖維細胞膜，使人皮膚成纖維細胞免受氧化損害。此外，刺玫果總黃酮提取物中富含多種水溶性物質，亦能夠清除0^2-，減少H₂0₂的產生，還可能阻斷羥自由基的產生，可非常有效地減輕活性氧分子對細胞膜及細胞器膜的損傷。

Ca²⁺是細胞凋亡發(fā)生過程中重要的信息分子，Ca²⁺持續(xù)升高可使核酸內切酶激活，使DNA片段化，因此鈣離子的內穩(wěn)定失調強與人皮膚成纖維細胞損傷的發(fā)生具有非常重要的關系，并被認為是轉化至不可逆期的界限步驟。本發(fā)明中的刺玫果總黃酮提取物具有良好的鈣阻滯作用。

黃芪多糖不僅可在缺氧條件下經無氧酵解，產生ATP，且不產生有害的代謝產物，還作為一種能量合成促進劑，在缺血、缺氧等應激狀態(tài)下，激活磷酸果糖激酶和丙酣酸激酶，促進對糖的利用，更快、更多地為人皮膚成纖維細胞提供了能量，使鈣泵在缺氧狀態(tài)下仍能維持一定的生理活性，保持了鈣離子內低外高的穩(wěn)態(tài)，從能有效的保護人皮膚成纖維細胞膜的完整性和細胞的功能而減輕人皮膚成纖維細胞損害，抑制了人皮膚成纖維細胞的凋亡。

胰島素可通過作用于人皮膚成纖維細胞表面的胰島素受體，增強人皮膚成纖維細胞對葡萄糖的攝入和利用，促進人皮膚成纖維細胞蛋白內蛋白合成，從而進一步增強人皮膚成纖維細胞的功能與活力。

本發(fā)明提供了一種人皮膚成纖維細胞培養(yǎng)方法，包括：采用本發(fā)明提供的人皮膚成纖維細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)人皮膚成纖維細胞。

作為優(yōu)選，人皮膚成纖維細胞培養(yǎng)方法采用微載體培養(yǎng)方法。

綜上所述，本發(fā)明公開的人皮膚成纖維細胞培養(yǎng)液能通多種機制在人皮膚成纖維細胞規(guī)?；囵B(yǎng)過程有效地減輕各種因素對人皮膚成纖維細胞的損傷，并抑制人皮膚成纖維細胞凋亡的發(fā)生，從而達到進一步提高人皮膚成纖維細胞規(guī)?；囵B(yǎng)的密度和功能狀態(tài)，并有效延長人皮膚成纖維細胞的體外生存時間的目的。

附圖說明

圖1示實施例1細胞的生長曲線；

圖2示實施例1負載細胞的微載體在倒置顯微鏡下觀察及DAPI染色后熒光倒置顯微鏡下觀察結果；其中2-1示實驗組倒置顯微鏡觀察結果，2-2示實驗組DAPI染色結果，2-3示對照組1倒置顯微鏡觀察結果；2-4示對照組1DAPI染色結果；2-5示對照組2倒置顯微鏡觀察結果；2-6示對照組2DAPI染色結果；2-7示對照組3倒置顯微鏡觀察結果；2-8示對照組3DAPI染色結果；2-9示對照組4倒置顯微鏡觀察結果；2-10示對照組4DAPI染色結果；

圖3示實施例2負載細胞的微載體在倒置顯微鏡下觀察及DAPI染色后熒光倒置顯微鏡下觀察結果；其中3-1示實驗組倒置顯微鏡觀察結果，3-2示實驗組DAPI染色結果，3-3示對照組1倒置顯微鏡觀察結果；3-4示對照組1DAPI染色結果；3-5示對照組2倒置顯微鏡觀察結果；3-6示對照組2DAPI染色結果；3-7示對照組3倒置顯微鏡觀察結果；3-8示對照組3DAPI染色結果；3-9示對照組4倒置顯微鏡觀察結果；3-10示對照組4DAPI染色結果；

圖4示實施例3負載細胞的微載體在倒置顯微鏡下觀察及DAPI染色后熒光倒置顯微鏡下觀察結果；其中4-1示實驗組倒置顯微鏡觀察結果，4-2示實驗組DAPI染色結果，4-3示對照組1倒置顯微鏡觀察結果；4-4示對照組1DAPI染色結果；4-5示對照組2倒置顯微鏡觀察結果；4-6示對照組2DAPI染色結果；4-7示對照組3倒置顯微鏡觀察結果；4-8示對照組3DAPI染色結果；4-9示對照組4倒置顯微鏡觀察結果；4-10示對照組4DAPI染色結果。

具體實施方式

本發(fā)明提供了一種人皮膚成纖維細胞培養(yǎng)液及培養(yǎng)方法，所述人皮膚成纖維細胞培養(yǎng)液對人皮膚成纖維細胞的規(guī)?；囵B(yǎng)具有良好的效果。

下面將結合本發(fā)明具體實施例對本發(fā)明的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例只是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。本領域技術人員應當理解，對本發(fā)明的具體實施例進行修改或者對部分技術特征進行同等替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的精神，均應涵蓋在本發(fā)明保護的范圍中。

實施例中使用的試劑和組分均為市售或自制來源。

如：

胰島素來源于市售(Sigma)

DMEM培養(yǎng)基來源于市售(Gbico)

胎牛血清來源于市售(Gbico)

黃芪多糖來源于國產市售

刺玫果總黃酮提取物來源于自制

人皮膚成纖維細胞來源于本實驗室保存

微載體cytodex3源于市售

HEPES來源于國產市售

DAPI染料來源于市售(Sigma)

實施例1：利用本發(fā)明公開的培養(yǎng)液規(guī)模化培養(yǎng)人皮膚成纖維細胞

1、配制培養(yǎng)液

試驗組：在1L DMEM(高糖型)培養(yǎng)基中含有60mL胎牛血清、35mmol HEPES、60mg刺玫果總黃酮提取物、20mg黃芪多糖和10^-7mmol胰島素。

對照組1：在1L DMEM(高糖型)培養(yǎng)基中含有60mL胎牛血清和35mmol HEPES。

對照組2：在1L DMEM(高糖型)培養(yǎng)基中含有60mL胎牛血清、35mmol HEPES、120mg刺玫果總黃酮提取物。

對照組3：在1L DMEM(高糖型)培養(yǎng)基中含有60mL胎牛血清、35mmol HEPES、40mg黃芪多糖。

對照組4：在1L DMEM(高糖型)培養(yǎng)基中含有60mL胎牛血清、35mmol HEPES、2×10^-7mmol胰島素。

2、微載體cytodex3預處理：將0.25g微載體cytodex3置于50ml塑料離心管中，用0.lmol/L、pH為7.0無鈣續(xù)磷酸續(xù)緩沖液(PBS)浸泡過夜后，吸去PBS，再用PBS洗滌3次，經121℃高壓滅菌30分鐘后，吸出PBS，用培養(yǎng)基洗滌2次，最后用以上配制的培養(yǎng)液浸泡10小時以上，備用。

3、濃縮靜止接種法接種細胞：消化收集平板培養(yǎng)的人皮膚成纖維細胞懸液，總量為2×10⁷的細胞懸液放入上述微載體中，輕輕混勻，在無菌條件下取出50ml無菌高橫截面微重力旋轉培養(yǎng)瓶，打開瓶蓋和兩個孔閥門，用注射器將含微載體cytodex3的人皮膚成纖維細胞懸液經注射孔緩緩注入微重力旋轉培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)添加上述培養(yǎng)液至30ml，取出兩個注射器，蓋上瓶蓋并將其稍稍扭松，靜止橫放于二氧化碳孵箱中，培養(yǎng)條件為溫度:37℃，二氧化碳濃度:5％。每8小時取出輕輕搖晃1分鐘。24小時后取出微重力旋轉培養(yǎng)瓶置于紫外消毒后的超凈臺中，用75％酒精擦拭瓶蓋和瓶壁3次，打開瓶蓋，將兩支無菌10ml注射器(其中一支裝有培養(yǎng)液，另一支不裝培養(yǎng)基)分別連接在兩個取樣孔上，打開取樣孔閥門，將注射器中的培養(yǎng)液緩慢注入容器內，容器內氣泡從另一支空的注射器中排出(培養(yǎng)過程中始終保持容器內無氣泡，以避免形成渦流)，將整個容器充滿后再用75％酒精擦拭瓶口和瓶壁3次，最后將其移入二氧化碳培養(yǎng)箱中，安裝在培養(yǎng)裝置上，并根據所接種微載體和細胞的量調整容器的轉速，以微載體在旋轉過程中不貼附在容器的內外壁上為宜。本試驗中設定旋轉初速度為7.6rpm。

4、微載體cytodex3生長細胞的DAPI染色法：取出樣品后用DAPI染色，置于37℃下0.5小時后，在熒光顯微鏡下觀察，長有細胞的多孔微載體為藍色，未長細胞的微載體仍為背景色。

試驗結果：

1、試驗組和對照組在為期7天的培養(yǎng)中細胞生長曲線(參見圖1)，可見實驗組中的細胞密度高于均對照組，且懸浮細胞數較少；

2、在培養(yǎng)的第5天，熒光倒置顯微鏡下及DAPI染色(參見圖2)后，可見實驗組中多個微載體相互聚集在一起，且己完全被細胞所包裹，且微載體上的貼壁細胞數較對照組密集，細胞活力較好，說明本發(fā)明的培養(yǎng)液具有較好的人皮膚成纖維細胞保護功能，可促進進一步地規(guī)?；囵B(yǎng)。

實施例2：利用本發(fā)明公開的培養(yǎng)液規(guī)模化培養(yǎng)人皮膚成纖維細胞

試驗組：在1L DMEM(高糖型)培養(yǎng)基中含有60mL胎牛血清、35mmol HEPES、50mg刺玫果總黃酮提取物、30mg黃芪多糖和10^-8mmol胰島素。

對照組1：在1L DMEM(高糖型)培養(yǎng)基中含有60mL胎牛血清和35mmol HEPES。

對照組2：在1L DMEM(高糖型)培養(yǎng)基中含有60mL胎牛血清、35mmol HEPES、100mg刺玫果總黃酮提取物。

對照組3：在1L DMEM(高糖型)培養(yǎng)基中含有60mL胎牛血清、35mmol HEPES、60mg黃芪多糖。

對照組4：在1L DMEM(高糖型)培養(yǎng)基中含有60mL胎牛血清、35mmol HEPES、2×10^-8mmol胰島素。

按照與實施例1相同的方法進行微載體cytodex3預處理、濃縮靜止接種法接種細胞和DAPI染色計數。結果如下：

在培養(yǎng)的第5天，熒光倒置顯微鏡下及DAPI染色(參見圖3)后，可見實驗組中多個微載體相互聚集在一起，且己完全被細胞所包裹，且微載體上的貼壁細胞數較對照組密集，細胞活力較好，說明本發(fā)明的培養(yǎng)液具有較好的人皮膚成纖維細胞保護功能，可促進進一步地規(guī)?；囵B(yǎng)。

實施例3：利用本發(fā)明公開的培養(yǎng)液規(guī)模化培養(yǎng)人皮膚成纖維細胞

試驗組：在1L DMEM(高糖型)培養(yǎng)基中含有60mL胎牛血清、35mmol HEPES、80mg刺玫果總黃酮提取物、40mg黃芪多糖和10^-6mmol胰島素。

對照組1：在1L DMEM(高糖型)培養(yǎng)基中含有60mL胎牛血清和35mmol HEPES。

對照組2：在1L DMEM(高糖型)培養(yǎng)基中含有60mL胎牛血清、35mmol HEPES、160mg刺玫果總黃酮提取物。

對照組3：在1L DMEM(高糖型)培養(yǎng)基中含有60mL胎牛血清、35mmol HEPES、80mg黃芪多糖。

對照組4：在1L DMEM(高糖型)培養(yǎng)基中含有60mL胎牛血清、35mmol HEPES、2×10^-6mmol胰島素。

按照與實施例1相同的方法進行微載體cytodex3預處理、濃縮靜止接種法接種細胞和DAPI染色計數。結果如下：

在培養(yǎng)的第5天，熒光倒置顯微鏡下及DAPI染色(參見圖4)后，可見實驗組中多個微載體相互聚集在一起，且己完全被細胞所包裹，且微載體上的貼壁細胞數較對照組密集，細胞活力較好，說明本發(fā)明的培養(yǎng)液具有較好的人皮膚成纖維細胞保護功能，可促進進一步地規(guī)?；囵B(yǎng)。