1.一種3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸的制備方法,其特征在于:以鵝去氧膽酸為底物,在NAD、乳酸脫氫酶、丙酮酸鈉以及緩沖溶液存在的條件下,用7α-類固醇脫氫酶催化鵝去氧膽酸制備3α-羥基-7氧代-5β膽烷酸,所述7α-類固醇脫氫酶來(lái)源于羊種布魯氏菌Brucella melitensis,所述乳酸脫氫酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示,在整個(gè)催化反應(yīng)體系中,所述底物的濃度為50~100mg/mL,所述NAD的濃度為0.01~0.25mg/mL,所述丙酮酸鈉的濃度為10~30mg/mL。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸的制備方法,其特征在于:控制所述催化過(guò)程在溫度為25~35℃,pH值為7.5~8.5的條件下進(jìn)行。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸的制備方法,其特征在于:所述緩沖溶液為50~100mM磷酸鉀緩沖液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸的制備方法,其特征在于,所述制備方法還包括如下提純步驟:待所述催化過(guò)程反應(yīng)結(jié)束后,調(diào)節(jié)pH值為1.0~2.0,攪拌20~30min,待冷卻后再經(jīng)過(guò)濾水洗干燥后即得3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸成品。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸的制備方法,其特征在于所述7α-類固醇脫氫酶為如下(a)或(b)的蛋白質(zhì):
(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白質(zhì),
(b)在(a)限定的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸并且在NAD存在下以鵝去氧膽酸為底物具有比氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的親本高的7α-類固醇脫氫酶催化活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸的制備方法,其特征在于所述7α-類固醇脫氫酶與如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比在選自至少一個(gè)下述位點(diǎn)處具有至少一個(gè)突變:第91位、第92位、第117位、第118位、第195位、第241位以及第243位。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸的制備方法,其特征在于所述7α-類固醇脫氫酶具有至少一個(gè)下述突變:D91K、L92R、N117I、V118R、S195A、I241R以及T243A。
8.一種7α-類固醇脫氫酶,其特征在于:所述7α-類固醇脫氫酶來(lái)源于羊種布魯氏菌Brucella melitensis,用于催化鵝去氧膽酸制備3α-羥基-7氧代-5β膽烷酸,所述7α-類固醇脫氫酶為如下(a)或(b)的蛋白質(zhì):
(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白質(zhì),
(b)在(a)限定的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸并且在NAD存在下以鵝去氧膽酸為底物具有比氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的親本高的7α-類固醇脫氫酶催化活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的7α-類固醇脫氫酶,其特征在于所述7α-類固醇脫氫酶與如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比在選自至少一個(gè)下述位點(diǎn)處具有至少一個(gè)突變:第91位、第92位、第117位、第118位、第195位、第241位以及第243位。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的7α-類固醇脫氫酶,其特征在于所述7α-類固醇脫氫酶具有至少一個(gè)下述突變:D91K、L92R、N117I、V118R、S195A、I241R以及T243A。