本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種熒光定量RT-PCR檢測鼠腦心肌炎病毒的引物對、探針、試劑盒及方法。

背景技術(shù)：

鼠腦心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMV)屬于小RNA病毒科心病毒屬成員，只有1個(gè)血清型。鼠是EMV的天然儲存宿主，EMV可感染多種宿主動物，包括哺乳動物、嚙齒類動物、節(jié)肢動物和人，其中豬的感染最普遍，也是最嚴(yán)重的動物。小鼠對EMV極為易感，主要表現(xiàn)為急性腦炎、心肌炎、糖尿病、睪丸炎、眼結(jié)膜炎等。EMV為單股正鏈的RNA病毒，基因組全長約7.8kb，有一個(gè)大的開放性閱讀框(ORF)，其基因組結(jié)構(gòu)與其他微小RNA病毒相似。豬源和鼠源毒株基因組同源性高達(dá)99.93％。有此可見，該病毒可在鼠和豬之間跨物種傳播，能引致母豬繁殖障礙和仔豬致死性心肌炎，致死率可達(dá)100％。目前EMV流行范圍越來越廣，EMV也是一種重要的人獸共患病致病因子，有研究發(fā)現(xiàn)人類食用感染的豬肉，血清中檢測到了EMV的病毒抗體。此病給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，有研究表明豬與豬之間基本不會發(fā)生病原的傳播，或者說傳播能力極其的有限，基本都是通過跨種間傳播，而小鼠便是EMV的天然儲存宿主，所以從小鼠的源頭扼殺EMV的傳播，最為理想，可以大大的減少EMV在豬及其他有經(jīng)價(jià)值的飼養(yǎng)動物中的流行和感染，從而減少經(jīng)濟(jì)損失。

在各種生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中，大鼠和小鼠是使用量最大、用途最多的實(shí)驗(yàn)動物。建立一種小鼠腦心肌炎病毒的可靠檢測方法，對及時(shí)發(fā)現(xiàn)并監(jiān)測動物的健康狀況，降低因感染造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，防止工作人員感染十分重要。目前，國內(nèi)和國際上常用的鼠腦心肌炎病毒(EMV)感染的檢測方法是血清學(xué)ELISA檢測，其中鼠的采血，血清分離都是特別繁瑣和耗時(shí)的，特別是在大型的實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)機(jī)構(gòu)，每年的實(shí)驗(yàn)鼠的檢測，采用傳統(tǒng)ELISA方法太過于繁瑣了，且現(xiàn)如今市場上有的鼠腦心肌炎病毒感染檢測ELISA試劑盒，大部分為進(jìn)口試劑盒，價(jià)格都在2000-3000元左右，而且僅可以檢測96乘以2個(gè)樣。因此，傳統(tǒng)的方法存在著繁瑣、局限性、靈敏度低、價(jià)格高等不足。

本發(fā)明擬建立一種快速、簡便、敏感、特異的EMV熒光定量PCR檢測方法，旨在為監(jiān)測EMV提供方法支持。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于此，為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種熒光定量RT-PCR檢測鼠腦心肌炎病毒的引物對、探針、試劑盒及方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案：

一種熒光定量RT-PCR檢測鼠腦心肌炎病毒的引物對，所述引物對具有如SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的堿基序列。

本發(fā)明還提供了一種熒光定量RT-PCR檢測鼠腦心肌炎病毒的探針，采取了以下技術(shù)方案：

一種熒光定量RT-PCR檢測鼠腦心肌炎病毒的探針，所述探針具有如SEQ ID No:3所示的堿基序列。

在其中一些實(shí)施例中，所述探針的5’結(jié)合有FAM，所述探針的3’結(jié)合有BHQ1。

本發(fā)明還提供了一種熒光定量RT-PCR檢測鼠腦心肌炎病毒的試劑盒，采取了以下技術(shù)方案：

一種熒光定量RT-PCR檢測鼠腦心肌炎病毒的試劑盒，所述試劑盒包括如SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的引物對、以及SEQ ID No:3所示的探針。

本發(fā)明還提供了一種熒光定量RT-PCR檢測鼠腦心肌炎病毒的方法，采取了以下技術(shù)方案：

一種熒光定量RT-PCR檢測鼠腦心肌炎病毒的方法，包括以下步驟：以鼠的腦組織的cDNA為模板，SEQ ID No:1和SEQ ID No:2為引物，SEQ ID No:3為探針，進(jìn)行熒光定量RT-PCR擴(kuò)增，采集熒光信號。

在其中一些實(shí)施例中，所述熒光定量RT-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：Premix Ex Taq10μL、ROX Reference Dye II0.2μL、cDNA模板2μL、SEQ ID No:1引物0.4μL、SEQ ID No:2引物0.4μL、SEQ ID No:3探針0.8μL、加滅菌蒸餾水至20μL。

在其中一些實(shí)施例中，所述熒光定量RT-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30sec；95℃變性5sec，60℃退火延伸34sec，40個(gè)循環(huán)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

1、本發(fā)明通過設(shè)計(jì)出特異性的引物對和探針，優(yōu)化熒光定量RT-PCR檢測方法的反應(yīng)條件，從而快速、準(zhǔn)確、特異性地針對小鼠體內(nèi)鼠腦心肌炎病毒核酸(EMV)進(jìn)行檢測，不僅可以實(shí)現(xiàn)對實(shí)驗(yàn)鼠的大樣本篩查，也可以對細(xì)胞系和生物原材料進(jìn)行外源因子檢測；

2、本發(fā)明的熒光定量RT-PCR檢測方法只需收集能提取到微量的cDNA的組織即可，EMV主要在小鼠的腦、心、胰腺等器官大量復(fù)制，為了更好的監(jiān)測效果，應(yīng)該盡量收集腦、心、胰腺等組織樣本進(jìn)行cDNA的提取，且本發(fā)明僅需要合成引物對，探針，染料試劑盒，便可方便快捷精確的檢測幾千個(gè)樣本，便捷廉價(jià)；

3、本發(fā)明的熒光定量RT-PCR檢測方法的最低檢測限為3個(gè)拷貝數(shù)/μL，約10fg DNA，高于普通PCR方法1000倍，常見的小鼠病毒株均無特異性擴(kuò)增，沒發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)，批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于2％，靈敏度、重復(fù)性和特異性都可以保證。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1的臨床樣本的檢測結(jié)果(X-軸表示PCR循環(huán)數(shù)，Y-軸表示擴(kuò)增反應(yīng)的熒光值)；

圖2為本發(fā)明試驗(yàn)例1中熒光定量PCR檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(X-軸表示PCR循環(huán)數(shù)，Y-軸表示擴(kuò)增反應(yīng)的熒光值)；

圖3為本發(fā)明試驗(yàn)例1中熒光定量PCR檢測方法的動力學(xué)曲線圖；其中，1-8號對應(yīng)模板濃度依次為：3×10⁷、3×10⁶、3×10⁵、3×10⁴、3×10³、3×10²、3×10¹、3×10⁰拷貝數(shù)/μL；9為陰性對照；

圖4為本發(fā)明試驗(yàn)例1中普通PCR的檢測結(jié)果，其中1-6號孔的模板濃度依次為3×10⁶、3×10⁵、3×10⁴、3×10³、3×10²、3×10¹拷貝數(shù)；

圖5為本發(fā)明試驗(yàn)例1中熒光定量PCR檢測方法的特異性結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。

下列實(shí)施例中，未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按常規(guī)條件，如《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(F.M.奧斯伯,R.E.金斯頓,J.G.塞德曼等主編，馬學(xué)軍,舒躍龍的譯.北京：科學(xué)出版社，2004)中所述的方法進(jìn)行。

實(shí)施例1熒光定量RT-PCR檢測鼠腦心肌炎病毒

1、實(shí)驗(yàn)樣品

來自上海實(shí)驗(yàn)動物研究中心的小鼠的腦樣品病料120份。

2、cDNA合成

取一小塊小鼠的腦組織，加PBS加鋼珠放入震蕩器中震蕩1min左右，離心4000rpm，2min，吸去上清，提取RNA。提取方法參照TIANamp Virus RNA Kit提取盒說明書，提取的核酸RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

模板為提取的病毒RNA，引物對為OligdT18，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系(40μL)為：RNA模板20μL，引物對2μL，5×反轉(zhuǎn)錄Buffer 8μL，dNTP(10mmol/L)4μL，Ribonuclease Inhibitor(40U/μL)1μL，Prime Script反轉(zhuǎn)錄酶(200U)1μL，DEPC水4μL。42℃水浴1h，70℃水浴10min，冰浴4min。-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3、設(shè)計(jì)引物對和探針

根據(jù)NCBI上發(fā)表的鼠腦心肌炎病毒PEC9毒株全基因組序列(DQ288856.1)，在其保守特異區(qū)域919-1022nt處，設(shè)計(jì)了引物對和探針：

上游引物對qRT-EMV-F，其序列為：

5’-CCACCTCCTCAGACAAGAATAAC-3’(SEQ ID No:1)

下游引物對qRT-EMV-R，其序列為：

5’-GCAGAGAG GTCAATGGAGTTT-3’(SEQ ID No:2)，

Taqman探針FAM-EMV，其序列為：

5’-FAM-CCTCGGAAGGCAATGAAGGTGTGA-3’-BHQ1(SEQ ID No:3)。

4、TaqMan熒光定量PCR檢測

熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體系為20μL，其中：

Premix Ex Taq(Probe qPCR)(2×)10μL

ROX Reference Dye II(50×)0.2μL

cDNA模板2μL

引物SEQ ID No:1(10μmol/L)0.4μL

引物SEQ ID No:2(10μmol/L)0.4μL

探針SEQ ID No:3(10μmol/L)0.8μL

加滅菌蒸餾水至20μL。

熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30sec；95℃變性5sec，60℃退火延伸34sec，40個(gè)循環(huán)，采集熒光。

5、檢測結(jié)果

檢測結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，上海實(shí)驗(yàn)動物研究中心的小鼠中未出現(xiàn)鼠腦心肌炎病毒(EMV)的感染，利用本實(shí)施例的檢測方法可以實(shí)現(xiàn)針對鼠腦心肌炎病毒的監(jiān)控目的。在圖1中，1：EMV標(biāo)準(zhǔn)品；2：小鼠微小病毒；3：小鼠細(xì)小病毒；4：小鼠肺炎病毒；5：小鼠肝炎病毒A59株；6：仙臺病毒；7：鼠呼腸孤病毒3型；8：鼠痘病毒；9：陰性對照。

試驗(yàn)例1熒光定量RT-PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及最佳線性范圍的確定

本試驗(yàn)例檢測了實(shí)施例1建立的EMV的TaqMan探針熒光定量RT-PCR方法的特異性，敏感性和穩(wěn)定性。

1、標(biāo)準(zhǔn)曲線和動力學(xué)曲線的繪制

人工合成鼠腦心肌炎病毒PEC9毒株(DQ288856.1)全基因組的919-1022nt DNA序列，合成并連接pUC57質(zhì)粒中，構(gòu)建EMV的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pUC-EMV，作為EMV標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。按EMV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品3×10⁸拷貝數(shù)/μL為起始模板濃度，以倍比稀釋次數(shù)(分別為3×10⁷、3×10⁶、3×10⁵、3×10⁴、3×10³、3×10²、3×10¹、3×10⁰拷貝數(shù)/μL)和相應(yīng)的Ct值繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線和動力學(xué)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，從圖2可知，當(dāng)EMV的最終濃度分別在3×10⁷～3×10⁰拷貝數(shù)/μL時(shí)，其相關(guān)系數(shù)R²＝0.9974，標(biāo)準(zhǔn)曲線都具有良好的線關(guān)系，各個(gè)稀釋度相關(guān)性好，誤差較??；反應(yīng)的擴(kuò)增效率E＝2.28，說明擴(kuò)增體系和條件優(yōu)化的較好。動力學(xué)曲線如圖3所示，EMV靈敏度可以達(dá)到30個(gè)拷貝/μL，且動力學(xué)擴(kuò)增曲線指數(shù)增長階段和平臺期都完整，熒光定量PCR的結(jié)果是可靠的。

2、敏感性試驗(yàn)

將EMV的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品分別做8個(gè)稀釋度從3×10⁷～3×10⁰拷貝數(shù)/μL，以倍比稀釋為模板分別進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，Ct值大于35，視為陰性，同時(shí)利用引物對SEQ ID No:1和SEQ ID No:2進(jìn)行常規(guī)RT-PCR擴(kuò)增。

檢測結(jié)果如圖3和圖4所示，結(jié)果表明，利用本發(fā)明的方法檢測EMV標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的靈敏度可達(dá)3×10⁰拷貝數(shù)/μL，而普通PCR最低可以檢測到3×10³拷貝數(shù)/μL，說明本發(fā)明的方法高于普通PCR方法1000倍。

3、特異性試驗(yàn)

通過本發(fā)明實(shí)施例1的檢測方法，分別對小鼠通常感染的病毒，小鼠微小病毒(MVM)、小鼠肺炎病毒(PVM)、小鼠肝炎病毒A59株(MHV-A59)、仙臺病毒(SEV)、小鼠呼腸孤病毒3型(Reo-3)和鼠痘病毒(ECT)均由上海實(shí)驗(yàn)動物研究中心提供。MVM和ECT提取病毒DNA，PVM、MHV-A59、SEV和Reo-3提取病毒總RNA，再反轉(zhuǎn)錄為DNA。在調(diào)整濃度后，分別作為模板進(jìn)行EMV的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，進(jìn)行檢測，驗(yàn)證方法的特異性。結(jié)果如圖5所示，結(jié)果表明，除EMV標(biāo)準(zhǔn)品會有特征性的擴(kuò)增曲線外，其他病毒均沒有特征性的擴(kuò)增曲線，證明本發(fā)明建立的熒光定量PCR檢測方法特異性強(qiáng)，與其他常見的鼠類病毒株均無交叉反應(yīng)。

4、重復(fù)性試驗(yàn)

以EMV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品中的3×10⁶和3×10⁴拷貝數(shù)/μL兩個(gè)稀釋度的作為模板，對這兩個(gè)稀釋度在不同時(shí)間段進(jìn)行2次重復(fù)測定，每次對同一模板同時(shí)進(jìn)行3次重復(fù)測定及設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，按照本發(fā)明實(shí)施例1所述的方法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。其中：變異系數(shù)(β)＝標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)/平均數(shù)(X)，結(jié)果見表1。

表1.熒光定量PCR檢測方法的重復(fù)性

表1結(jié)果表明批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于2％，說明本發(fā)明建立的熒光定量PCR檢測方法具有較好的重復(fù)性，結(jié)果穩(wěn)定可靠。

以上所述實(shí)施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實(shí)施例中的各個(gè)技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說明書記載的范圍。

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。

序列表

＜110＞中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所

＜120＞熒光定量RT-PCR檢測鼠腦心肌炎病毒的引物對、探針、試劑盒及方法

＜130＞ 3

＜170＞PatentIn version 3.1

＜210＞ 1

＜211＞ 23

＜212＞DNA

＜213＞人工序列

＜400＞ 1

ccacctcctcagacaagaataac 23

＜210＞ 2

＜211＞ 21

＜212＞ DNA

＜213＞人工序列

＜400＞ 2

gcagagaggtcaatggagtt t 21

＜210＞ 3

＜211＞ 24

＜212＞ DNA

＜213＞人工序列

＜400＞ 3

cctcggaaggcaatgaaggtgtga 24