本發(fā)明屬于分子診斷
技術領域：
，具體涉及一種焦磷酸測序法快速檢測CYP2D6基因拷貝數(shù)的試劑盒及其應用。
背景技術：
：人細胞色素P450(cytochromeP450s，CYP)是由許多同工酶組成的超大家族，主要位于肝微粒體中，參與生物體內源性和外源性物質的生物轉化，在調節(jié)機體與外界環(huán)境的相互作用以及保持機體內環(huán)境穩(wěn)定中起重要作用。目前已知人類的P450有三十多種，重要的有七種，CYP2D6即是其中的一種。CYP2D6又稱異喹胍4-羥化酶，最早于1984年從快代謝者肝臟微粒體中提純獲得，主要分布于肝臟、小腸和腦組織中，僅占CYP450酶系總量的2％，但是臨床上約25％的藥物由其催化代謝，且有著高度的基因多態(tài)性。CYP2D6等位基因多態(tài)性可使酶呈現(xiàn)不同的活性，即決定了其表型的多樣性，其表型大致可分為4種：慢代謝(poormetabolism，PM)型、中間代謝(intermediatedmetabolism，IM)型、快代謝(extensivemetabolism，EM)型和超快代謝(ultrametabolism，UM)型。其中CYP2D6基因拷貝數(shù)可以引起重要的代謝類型多態(tài)性，功能型等位基因(*1、*2、*35)拷貝數(shù)(基因拷貝數(shù)大于2，如*1×2/*1或*1×2/*2×2的表達可以引起酶活性增加，攜帶這類基因的個體CYP450酶活性高，被稱為超快代謝者。攜帶非功能型或功能下調型的等位基因拷貝數(shù)的個體酶活性并未增加。若缺失這個基因，這類基因的個體酶活性降低，被稱為慢代謝者。通過對肝臟CYP2D6基因拷貝數(shù)的檢測，可預知侯選藥物在體內的藥代動力學特性及其代謝物，而研究這些代謝物的活性和毒性，也將有助于我們尋找更為安全、合理和有效的CYP2D6酶系統(tǒng)氧化代謝多態(tài)性的遺傳分子機制不僅具有深遠的理論意義，同時也具有重要的實際臨床應用價值。但是由于目前用于CYP2D6基因拷貝數(shù)的檢測方法成本高、可靠性低，使得很多研究者心有余力不足，同時迫于經(jīng)濟原因，基因檢測用于個體化治療的開展進展緩慢。焦磷酸測序技術為短片段DNA快速測序技術，不同于傳統(tǒng)的測序方法。它無需制膠電泳，也無需熒光染色和同位素，操作簡便，需時少，成本低，一次最多可檢測96個樣本。既可對樣本進行短片段測序，又可進行單核苷酸(SNP)分析，結果簡單易讀。本專利采用PCR擴增和焦磷酸測序技術結合，先用PCR擴增出CYP2D6基因相關目的片段，再通過設計測序引物，運用焦磷酸測序技術檢測其拷貝數(shù)，建立一種快速、準確、高靈敏度和高通量的藥物代謝預測的分子診斷方法。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明需要解決的技術問題是，提供一種操作簡便、成本低廉、快捷、準確的檢測CYP2D6基因拷貝數(shù)的試劑盒。本發(fā)明還要解決的技術問題是提供上述試劑盒在檢測CYP2D6基因拷貝數(shù)中的應用。為解決以上技術問題，本發(fā)明采用如下技術方案：檢測CYP2D6基因拷貝數(shù)的引物，包括如下引物：(1)擴增CYP2D6基因的引物對：其上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；其中，下游引物的5’端用生物素標記；(2)CYP2D6基因拷貝數(shù)的測序引物：其核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。一種檢測CYP2D6基因拷貝數(shù)的試劑盒，該試劑盒包括如下試劑：(1)DNA提取試劑；(2)反應液：PCR緩沖液，SEQIDNO：1～2所示的PCR引物10μmol/L，MgCl225mmol/L，dNTPs10mmol/L，TaqDNA聚合酶5U/μL，甘油；(3)單鏈純化試劑：體積分數(shù)為75％乙醇水溶液，0.2mol/LNaOH，10mmol/LpH7.6Tris-Acetate溶液，結合緩沖液，退火緩沖液；(4)測序試劑：DNA聚合酶，SEQIDNO：3所示的測序引物；ATP硫酸化酶，熒光素酶，三磷酸腺苷雙磷酸酶，底物APS，熒光素和dNTP。其中，所述的結合緩沖液包括：10mMTris-HCl、2MNaCl、1mMEDTA、0.1％(v/v)Tween20。其中，所述的退火緩沖液包括：pH7.620mMTris-Acetate、2mM醋酸鎂。上述檢測CYP2D6基因拷貝數(shù)的試劑盒在利用焦磷酸測序技術檢測CYP2D6基因拷貝數(shù)中的應用在本發(fā)明中的應用。一種焦磷酸測序法檢測CYP2D6基因拷貝數(shù)的方法，該方法包括如下步驟：(1)提取標本組織中的基因組DNA；(2)以步驟(1)中所得基因組DNA為模板，SEQIDNO：1～2所示的核苷酸序列為引物，PCR擴增CYP2D6基因相關片段；(3)將步驟(2)得到的基因片段與親和素標記的磁珠結合進行單鏈純化；(4)將步驟(3)得到的單鏈純化產(chǎn)物進行焦磷酸測序；(5)測序結果分析。步驟(2)中，所述的PCR擴增：PCR體系為50μL，其中DNA模板2μL，10×PCRbuffer5μL，MgCl24μL，dNTP3μL，上下游引物每對各取0.15μL混合于一管，TaqDNA聚合酶0.3μL，甘油2.5μL，加水補充至50μL；PCR條件為：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，35個循環(huán)；72℃10min。CYP2D6基因是一個完整的功能基因，可表達有功能的蛋白質，基因全長為7kb，含有9個外顯子和8個內含子，編碼堿基序列全長1491bp，共編碼497個氨基酸。而編碼CYP2D6的基因位于第22號染色體長臂q13.1CYP2D6-8基因簇，與CYP2D7P和CYP2D8P假基因連鎖，共存于29kb的片段中。CYP2D6、CYP2D7、CYP2D8它們三者之間具有高度同源性，尤其CYP2D7基因與CYP2D6基因有97％的核酸序列同源性。由于CYP2D7在體內也存在著拷貝數(shù)，而CYP2D8只存在著1個拷貝且比較穩(wěn)定，因此本專利利用焦磷酸測序方法，將CYP2D8作為對照，通過設計測序引物用來檢測CYP2D6的拷貝數(shù)，設計原理如圖所示：首先查找出CYP2D6與CYP2D8的共同部分序列，但區(qū)別于CYP2D7的序列設計引物，通過PCR可以同時將CYP2D6與CYP2D8基因相關片段進行擴增，而后將PCR擴增產(chǎn)物用于焦磷酸測序，通過焦磷酸測序同時測出CYP2D6與CYP2D8基因的部分序列，由于所測序列不完全相同，CYP2D8的堿基有別于CYP2D6中的堿基，且CYP2D8只存在著1個拷貝，因此可以將CYP2D8基因與CYP2D6基因所測序列中同一位置處不同堿基的峰高比值作比較，比如將CYP2D8基因所測序列中的堿基G與CYP2D6中的堿基AT的峰高比值作比較，從而得出CYP2D6的拷貝數(shù)。引物設計原理見圖5。本發(fā)明的有益效果：(1)本發(fā)明所涉及的引物擴增出的出片段在100bp左右，大大提高了標本提取DNA后PCR的擴增效率。(2)本發(fā)明所涉及的測序引物將CYP2D6與CYP2D8的不同堿基明顯區(qū)分開，且容易計算出兩者的比率。(3)本發(fā)明采用的焦磷酸測序技術可以快速、準確地進行短DNA序列分析，便于構建標準化操作流程；具有高通量、低成本等特點；PCR產(chǎn)物即可直接用于測序，不需進行產(chǎn)物純化等二次處理，操作極為簡便，所需樣品量小?？傊景l(fā)明提供了一種焦磷酸測序技術檢測CYP2D6基因拷貝數(shù)檢測試劑盒及其應用。應用焦磷酸測序技術可以快速準確檢測CYP2D6基因拷貝數(shù)，可廣泛應用于臨床上個體化醫(yī)療方案制定及預防。與現(xiàn)有技術相比，其應用在個性化醫(yī)療上有較大的推廣應用價值，也可以將該平臺運用于其他疾病相關基因多態(tài)性檢測。附圖說明圖1為本發(fā)明CYP2D6基因缺失的焦磷酸測序的結果圖。圖2為本發(fā)明CYP2D6基因1個拷貝的焦磷酸測序的結果圖。圖3為本發(fā)明CYP2D6基因2個拷貝的焦磷酸測序的結果圖。圖4為本發(fā)明CYP2D6基因3個拷貝的焦磷酸測序的結果圖。圖5引物設計原理。具體實施方式根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內容僅用于說明本發(fā)明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。實施例1：試劑。(1)DNA提取試劑：購自QIAGEN公司。(2)反應液：PCRBuffer：購自美國Fermentas公司；引物SEQIDNO：1～2，由上海英俊生物科技有限公司合成；MgCl2：購自美國Fermentas公司；0.2mMdNTPs：購自美國Fermentas公司；2U/μLTaqDNA聚合酶：購自美國Fermentas公司。(3)單鏈純化試劑：75％(v/v)乙醇溶液：購于杭州長征化學試劑有限公司；0.2mol/LNaOH：購于上海試四赫維化工有限公司；10mmol/LTris-Acetate(pH7.6)：Tris-base購于美國Sigma公司，無水乙酸購于杭州化學試劑有限公司；結合緩沖液：由10mMTris-HCl(Tris-base購于美國Sigma公司，鹽酸購于杭州化學試劑有限公司)，2MNaCl(購于上海試四赫維化工有限公司)，1mMEDTA(購于杭州化學試劑有限公司)，0.1％(v/v)Tween20(購于美國Sigma公司)組成；退火緩沖液：由20mMTris-Acetate(pH7.6)(Tris-base購于美國Sigma公司，無水乙酸購于杭州化學試劑有限公司)，2mM醋酸鎂(購于上海試四赫維化工有限公司)組成；親和素標記的磁珠(購于GEhealthcareBioscienceAB)。(4)測序試劑：測序引物SEQIDNO：3，由上海英俊生物科技有限公司合成；DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶：購于QIAGEN公司；底物APS和熒光素：購于QIAGEN公司；四種dNTP(dATPS，dTTP，dCTP，dGTP)：購于QIAGEN公司。實施例2：檢測方法。儀器：Bio-RadS1000PCR儀，BeckmanMicrofuge22R臺式微量冷凍離心機，QIAGENPyroMarkQ96ID測序儀。(1)提取全血標本中的DNA：參考公開的文獻，采用相應的商品化DNA抽提試劑盒，按照試劑盒說明書制備血液中基因組DNA，作為PCR反應模板備用。DNA溶解后用Nano-Space紫外分光光度計進行核酸濃度測定，核酸濃度大于50ng/uL視為合格，保存核酸標本至4℃冰箱；(2)以步驟(1)所得DNA為模板，利用特異性引物進行PCR擴增；其中，PCR擴增采用50μl體系，其中DNA模板2μL，10×PCRbuffer5μL，MgCl2(25mmol/L)4μL，dNTP(10mmol/L)3μL，10μmol/L濃度上下游引物(SEQIDNO：1-6)各取0.15μL混合于一管，Taq酶(5U/μL)0.3μL，甘油2.5μL，加水補充至50μL。反應條件94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，35個循環(huán)；72℃10min。(3)將步驟(2)得到的PCR擴增產(chǎn)物與親和素標記的磁珠結合進行單鏈純化：A.在使用前，保證所有溶液都達到室溫；B.在PSQ96板中加入45μLannealingbuffer，然后每孔加入測序引物SEQIDNO：3(10uM)1uL；C.使用Vertex混勻Sepharosebeads,將需要使用的sepharoebeads總量(每樣本3μL)轉移到一個Eppendorf管中，在sepharosebead中加入bindingbuffer，使得平均每個樣品約有50μL的體積，將混合物混勻；D.將以上混合物加入PCR產(chǎn)物(50μL反應體積)中，每樣本50μL，將PCR產(chǎn)物在常溫下混勻10分鐘，使得beads與生物素結合；E.在Vacuumprepworkstation中，四個樣品板中依次加入180mL高純水、70％乙醇、washingbuffer和120mlDenaturationbuffer；F.打開vacuumprepworkstation的泵，將vacuumpreptool在高純水中清洗30秒,然后將vacuumpreptool移到PCR板中，抓取sepharosebeads，將vacuumpreptool放入70％乙醇中5秒，然后移到denatureationbuffer中5秒，再移到washingbuffer中清洗10秒，把吸頭放在相應含有測序引物的板孔的上方，不要接觸液面，關掉泵，將vacuumpreptool放入含有測序引物的板中，搖動，釋放sepharosebeads；G.使用高純水清洗vacuumpreptool。H.將放有樣品的PSQ96板放在ThermoPlate上加熱到80℃2分鐘，再冷卻到室溫后放入測序儀中。(4)將步驟(3)得到的單鏈純化產(chǎn)物進行焦磷酸測序；(5)測序結果根據(jù)CYP2D6與CYP2D8中不同堿基的峰高比來判斷CYP2D6基因的拷貝數(shù)。將本發(fā)明所述的試劑盒用于抽取50例臨床患者血液樣本的核酸，檢測所述的CYP2D6基因拷貝數(shù)，檢測結果如下表：數(shù)字PCR是一種核酸分子絕對定量技術。因此我們采用數(shù)字PCR作為參考方法，分別對CYP2D6片段、CYP2D8片段設計引物，特異擴增CYP2D6片段及CYP2D8片段，并將CYP2D8片段作為內參基因，最后通過公式計算目的基因與內參基因的拷貝數(shù)比值得到拷貝數(shù)。將檢測結果統(tǒng)計如下表：拷貝數(shù)人數(shù)(總人數(shù)＝50)頻率cyp2d6x012.00％cyp2d6x11836.00％cyp2d6x22754.00％cyp2d6x348.00％如圖1～4所示，圖1中T含量為0，故為CYP2D6片段缺失；圖2T/G比值約為1，為1個拷貝；圖3T/G比值約為2，為2個拷貝；圖4T/G比值約為3，為3個拷貝。將50例標本進行統(tǒng)計分析，CYP2D6的拷貝數(shù)中以2個拷貝的居多，有27例，占54.17％；其次為1個拷貝，有18例，占37.50％；3個拷貝的有4例，占8.33％；缺失的有1例，占2％；未檢測到3個拷貝數(shù)以上的。與數(shù)字PCR檢測結果相比，其符合率達100％。綜上所述，焦磷酸測序是一種準確、可靠及高通量的檢測技術，15分鐘可檢測96個樣品，并可同時測定多態(tài)性位點附近的多個堿基。本試劑盒建立的單管PCR-Pyrosequencing檢測CYP2D6基因的拷貝數(shù)，更具有節(jié)省操作時間與成本的優(yōu)勢；結合CYP2D6基因多態(tài)性的位點檢測，能對患者起到指導用藥的作用，在個性化醫(yī)療上有很大的推廣價值?？梢詫⒃撈脚_運用于其他疾病相關的基因診斷上。SEQUENCELISTING<110>杭州迪安醫(yī)學檢驗中心有限公司<120>焦磷酸測序法快速檢測CYP2D6基因拷貝數(shù)的試劑盒及其應用<130>SG20161222001<160>3<170>PatentInversion3.5<210>1<211>19<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>擴增CYP2D6基因上游引物<400>1gtggtggctgacctgttct19<210>2<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>擴增CYP2D6基因下游引物<400>2gggctcacgctgcacatc18<210>3<211>19<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>CYP2D6基因拷貝數(shù)的測序引物<400>3gtggtggctgacctgttct19當前第1頁1 2 3