本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種準(zhǔn)確快速捕獲循環(huán)腫瘤細胞的方法。

背景技術(shù)：

循環(huán)腫瘤細胞(ctc)是指從腫瘤上脫落并進入循環(huán)系統(tǒng)的癌細胞，ctc非常稀少，每毫升血液中10⁹血細胞只有幾個ctc。ctc可以作為癌癥的生物標(biāo)志物，指示腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及轉(zhuǎn)移惡變。大部分癌癥相關(guān)死亡由轉(zhuǎn)移引起，轉(zhuǎn)移過程中腫瘤細胞脫離原發(fā)灶，通過血流到達新的組織，并在一定條件下發(fā)展為轉(zhuǎn)移灶。循環(huán)腫瘤細胞(ctc)早在140多年前就被發(fā)現(xiàn)，但由于其含量非常少以及分離檢測方法的局限，直到近年才日益受到廣泛關(guān)注。大部分ctcs在伴隨外周循環(huán)的過程中發(fā)生凋亡，或直接被血細胞吞噬，只有少數(shù)能逃逸并發(fā)展成為轉(zhuǎn)移灶(cancerres2003；63:3805)。這提示著我們：分離、鑒定和研究最具轉(zhuǎn)移潛能的ctc是關(guān)鍵。

ctc具有特定的標(biāo)志物，利用針對這些標(biāo)志物的抗體可以標(biāo)記、分離或檢測?，F(xiàn)有大多是將標(biāo)志物抗體偶聯(lián)在磁珠或其他固體介質(zhì)上進行ctc捕獲，其難點在于ctc數(shù)量非常低，難以進行分離提取。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種簡單可行的準(zhǔn)確快速捕獲循環(huán)腫瘤細胞的方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

一種準(zhǔn)確快速捕獲循環(huán)腫瘤細胞的方法，篩選出兩個高親合力抗體，兩個所述抗體同時結(jié)合到ctc標(biāo)志物兩個臨近的抗原表位上，分別偶聯(lián)單鏈核苷酸；

所述兩個抗體結(jié)合完成后，加入第三個單鏈核苷酸，所述第三個單鏈核苷酸與一個抗體上偶聯(lián)的單鏈核苷酸的3’端及另一個抗體上偶聯(lián)的單鏈核苷酸的5’端互補，通過退火和連接，兩個抗體上的核苷酸連接成一條完整的核苷酸鏈，與熒光探針進行雜交，利用流式分選儀對標(biāo)有熒光探針的ctc進行捕獲。

作為優(yōu)選，兩個所述抗體分別偶聯(lián)單鏈核苷酸時，核苷酸序列在人基因組中不存在。

作為優(yōu)選，所述退火和連接的條件為37℃的條件下溫浴1小時。

作為優(yōu)選，所述雜交是將熒光探針稀釋至100nm，在稀釋后的反應(yīng)溶液中加入鮭魚精dna減少非特異結(jié)合，將該溶液加入細胞中，混合均勻后置于37℃溫浴1小時。

作為優(yōu)選，兩個所述抗體分別為ec1和ac2。

本發(fā)明具有以下有益效果：

利用鄰位連接技術(shù)，通過用兩個抗體同時結(jié)合一個標(biāo)志物，可以有效的捕獲到目的ctc，同時基于鄰位連接技術(shù)，兩個抗體上的ssdna高效地連成了一條完整的dna分子，并被熒光探針分子識別。流式分析儀篩選計數(shù)標(biāo)本，篩選到的ctc細胞的特異性可達到99％。

附圖說明

圖1為用于捕獲目的ctc的雙標(biāo)抗體的表達和純化；

圖2為蛋白免疫共沉淀實驗證明特異性的雙標(biāo)抗體可以與ctc表面的抗原蛋白分子特異性結(jié)合；

圖3為雙標(biāo)抗體在分別混有1個ctc，10個ctc和100個ctc的10ml血液中，可以有效捕獲目的ctc；

圖4為被雙標(biāo)抗體捕獲后的ctc，同時分子交聯(lián)在雙標(biāo)抗體分子上的ssdna，退火后連接成為一條完整的dna鏈可以被熒光探針識別，并通過熒光顯微鏡檢測到。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式作進一步說明。在此需要說明的是，對于這些實施方式的說明用于幫助理解本發(fā)明，但并不構(gòu)成對本發(fā)明的限定。此外，下面所描述的本發(fā)明各個實施方式中所涉及的技術(shù)特征只要彼此之間未構(gòu)成沖突就可以相互組合。

一種準(zhǔn)確快速捕獲循環(huán)腫瘤細胞的方法，篩選出兩個高親合力抗體，兩個所述抗體同時結(jié)合到ctc標(biāo)志物兩個臨近的抗原表位上，分別偶聯(lián)單鏈核苷酸。

如圖1所示，利用大腸桿菌表達目標(biāo)抗體，破壁，再利用鎳柱親和純化目標(biāo)蛋白，采用咪唑洗脫，得到純化的目標(biāo)蛋白，用于后續(xù)的捕獲實驗。通過上述的純化手段用于后續(xù)檢測實驗的抗體的純化，以使實驗結(jié)果準(zhǔn)確。

如圖2所示，通過蛋白免疫共沉淀實驗證明，特異性的雙標(biāo)抗體可以與ctc表面的抗原蛋白分子特異性結(jié)合。圖2中，抗體1為ec1，抗體2為ac2，均是可識別epcam的蛋白；對照抗體是h10，不能喝目標(biāo)蛋白epcam結(jié)合。

兩個抗體結(jié)合完成后，加入第三個單鏈核苷酸，所述第三個單鏈核苷酸與一個抗體上偶聯(lián)的單鏈核苷酸的3’端及另一個抗體上偶聯(lián)的單鏈核苷酸的5’端互補，通過退火和連接，兩個抗體上的核苷酸連接成一條完整的核苷酸鏈，與熒光探針進行雜交，利用流式分選儀對標(biāo)有熒光探針的ctc進行捕獲。

其中，兩個所述抗體分別偶聯(lián)單鏈核苷酸時，核苷酸序列在人基因組中不存在。

退火和連接的條件為37℃的條件下溫浴1小時。

如圖3所示，雙標(biāo)抗體在分別混有1個ctc，10個ctc和100個ctc的10ml血液中，可以有效捕獲目的ctc。同時分子交聯(lián)在雙標(biāo)抗體分子上的ssdna，退火后連接成為一條完整的dna鏈，被realtimepcr實驗檢出。

如圖4所示，被雙標(biāo)抗體捕獲后的ctc，同時分子交聯(lián)在雙標(biāo)抗體分子上的ssdna，退火后連接成為一條完整的dna鏈可以被熒光探針識別，并通過熒光顯微鏡檢測到。

雜交是將熒光探針用濃度為1mg/ml的bsa稀釋至100nm，在稀釋后的反應(yīng)溶液中加入濃度為300ng/ml的鮭魚精dna減少非特異結(jié)合，將該溶液加入細胞中，混合均勻后置于37℃溫浴1小時。

雜交體系為：1mg/mlbsa；300ng/mlsalmonspermdna；1×ssc；0.05％tween20；100nm熒光探針；dh2o。其中，bsa用于封閉細胞中蛋白質(zhì)的非特異結(jié)合，降低雜交背景；salmonspermdna(鮭魚精dna)用于封閉細胞中dna的非特異結(jié)合位點，降低雜交背景、提高雜交特異性。1xssc：dna雜交緩沖液；tween20(吐溫20)，非離子型表面活性劑，減少探針的非特異性結(jié)合。熒光探針：和靶序列互補的dna片段，帶有熒光信號，用于檢測。

以上結(jié)合附圖對本發(fā)明的實施方式作了詳細說明，但本發(fā)明不限于所描述的實施方式。對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，在不脫離本發(fā)明原理和精神的情況下，對這些實施方式進行多種變化、修改、替換和變型，仍落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。

技術(shù)特征：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種準(zhǔn)確快速捕獲循環(huán)腫瘤細胞的方法，篩選出兩個高親合力抗體，兩個所述抗體同時結(jié)合到CTC標(biāo)志物兩個臨近的抗原表位上，分別偶聯(lián)單鏈核苷酸；所述兩個抗體結(jié)合完成后，加入第三個單鏈核苷酸，所述第三個單鏈核苷酸與一個抗體上偶聯(lián)的單鏈核苷酸的3’端及另一個抗體上偶聯(lián)的單鏈核苷酸的5’端互補，通過退火和連接，兩個抗體上的核苷酸連接成一條完整的核苷酸鏈，與熒光探針進行雜交，利用流式分選儀對標(biāo)有熒光探針的CTC進行捕獲。本發(fā)明的優(yōu)點是：能準(zhǔn)確快速地捕獲循環(huán)腫瘤細胞。

技術(shù)研發(fā)人員：薛峰
受保護的技術(shù)使用者：云南赫斯提雅生物科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：2017.04.01
技術(shù)公布日：2017.08.18