本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)分離純化
技術(shù)領(lǐng)域：
。更具體地，涉及嗜水氣單胞菌表面特異性抗原ahsa及其多克隆抗體和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：嗜水氣單胞菌是養(yǎng)殖及野生魚類常見的致病菌之一，魚類的嗜水氣單胞菌病往往呈爆發(fā)性流行趨勢，造成魚類的大面積死亡而導(dǎo)致養(yǎng)殖漁業(yè)的嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)該菌也可通過生物鏈感染人體，造成人體的多種疾病。目前，魚類嗜水氣單胞菌病的診斷方法主要是根據(jù)發(fā)病的季節(jié)進(jìn)行調(diào)查訪問，并對(duì)患病魚體進(jìn)行解剖檢查，診斷速度和診斷準(zhǔn)確性都受到一定程度的限制。有條件的情況下可利用抗嗜水氣單胞菌多克隆抗體為基礎(chǔ)的免疫學(xué)檢查；另一方面，魚類嗜水氣單胞菌病的治療主要依靠各種抗生素，對(duì)環(huán)境、魚體以及消費(fèi)者均有不利影響?？股氐拈L期使用造成的耐藥菌株的出現(xiàn)，也對(duì)抗生素的使用構(gòu)成挑戰(zhàn)而魚類嗜水氣單胞菌病的預(yù)防方面也缺乏有效的疫苗。現(xiàn)有的研究顯示，嗜水氣單胞菌中致病因子主要有氣溶素(aerolysin)、溶血素(hemolysin)、細(xì)胞毒性腸毒素(cytolyticen-terotoxin)、胞外蛋白酶(extracellularprotease)、載鐵體、s層蛋白及ⅳ型菌毛等。其中胞外蛋白酶是最重要的致病因子之一，而ahsa蛋白則是嗜水氣單胞菌中典型的胞外蛋白酶。由于目前缺乏對(duì)該蛋白的高效表達(dá)純化，無法對(duì)基于此蛋白制備的多克隆抗體進(jìn)行相關(guān)研究。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明旨在解決嗜水氣單胞菌表面特異性抗原ahsa蛋白異源表達(dá)含量低，濃度差等技術(shù)問題，制備得到高純度，高濃度嗜水氣單胞菌表面特異性抗原ahsa，該蛋白特異性地表達(dá)于嗜水氣單胞菌表面，利用該蛋白制備出相應(yīng)的多克隆抗體，可成功檢測嗜水氣單胞菌，進(jìn)而為該菌的臨床診斷及預(yù)防提供理論支持。本發(fā)明的技術(shù)方案如下：嗜水氣單胞菌表面特異性抗原ahsa，由基因片段在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)，并經(jīng)過純化制備得到；所述的基因片段序列如下：tcagctgccgctctgggggtcgtcgatcaccagcttgccatccttgaccgggatggtggcgccgggggccttgttcatgcggatcaccccttcctgaccggcgaggcggtaggtgacgtcatagccaagggtgcgggtgctgctctcttgcaccgtcttgcagcgctgttcggtggtggtgtaggtatcaccggcctgcatgttgccctgcacctggttgccggcatagccacccgccacggcgcctgcggcggtcgccaccttcttgccgttgccgccaccaaactggttgccgagcaccccgcccagcgccgcaccgaccacggtacccaggatcttgtgctcgtcctgcaccggtttgcggtgggtcacgctgacgttgcgacactcctgacggggggtcttgatggtctcggtcaccgctttgctggccagcacttcggcgaactgaggctgtgatgaaaacagggatccgctggcggcggctgacaaggccagcgcagaggccacaccgatcccgactcctgccaacatggatttgttcat。該基因序列收錄于genebank中，基因號(hào)為：abk39242.1；在大連寶生物公司合成其基因。進(jìn)一步的，經(jīng)純化制備的抗原ahsa濃度為10mg/l。進(jìn)一步的，制備方法為：將所述的基因片段的編碼區(qū)克隆進(jìn)pet-28a載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21感受態(tài)細(xì)菌；待感受態(tài)細(xì)菌生長至對(duì)數(shù)生長期前期，以0.5mmiptg誘導(dǎo)表達(dá)ahsa蛋白，25℃誘導(dǎo)24小時(shí)后離心收集菌體；將收集的菌體以20mmtris-hcl,150mmnacl重懸，超聲裂解，離心取裂解液上清液，將上清液通過鎳柱純化，以咪唑溶液洗脫，再進(jìn)行凝膠過濾純化。本發(fā)明同時(shí)請(qǐng)求保護(hù)利用所述的嗜水氣單胞菌表面特異性抗原ahsa制備的抗體，制備方法如下：s1.原核表達(dá)和純化表面特異性抗原ahsa；s2.免疫四次家兔，間隔分別為一周、兩周、三周，獲得含嗜水氣單胞菌多克隆抗體的血清；s3.利用間接elisa效價(jià)檢測純化血清，獲得純化的基于嗜水氣單胞菌表面特異性抗原ahsa的多克隆抗體。本發(fā)明同時(shí)請(qǐng)求保護(hù)所述的嗜水氣單胞菌表面特異性抗原ahsa制備的抗體在特異性的識(shí)別嗜水氣單胞菌方面的應(yīng)用。利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)且按照本發(fā)明所述的純化方法得到的高純度、高濃度ahsa蛋白的相關(guān)應(yīng)用(如做成晶體解析出其三維結(jié)構(gòu))也都在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明成功獲得了純度和濃度都較好的嗜水氣單胞菌表面特異性抗原ahsa；并利用制備的抗原免疫動(dòng)物，制備出基于嗜水氣單胞菌表面特異性抗原ahsa的多克隆抗體，可用于嗜水氣單胞菌的檢測和魚類嗜水氣單胞菌病的診斷，該抗原ahsa可用于魚類嗜水氣單胞菌病的治療，同時(shí)也為開發(fā)出預(yù)防嗜水氣單胞菌的疫苗奠定了基礎(chǔ)。附圖說明圖1為目的基因ahsa-pet-28a(+)pcr擴(kuò)增電泳檢測圖；其中：m:dl2000marker，1,2：ahsa-pet-28a(+)目的基因。圖2為ahsa-pet-28a(+)ni-ntasds檢測圖；其中：m:blueplusiimarker,1:250mm咪唑洗脫目的蛋白。圖3為ahsa-pet-28a(+)凝膠過濾峰譜檢測圖；其中：m:blueplusiimarker,1,2,3,4,5,6,7,8,9:凝膠過濾洗脫蛋白。圖4為ahsa-pet-28a(+)經(jīng)濃縮到200μl后上樣1μlsds檢測圖；其中：m:blueplusiimarker,1:濃縮后1μl蛋白。圖5為制備出的多克隆抗體識(shí)別免疫原蛋白westernblot檢測圖；(m:blueplusiimarker：1:免疫原ahsa蛋白，2：牛血清蛋白)其中：m1:blueplusiimarker；m2:westernblotmarker；1:免疫原ahsa蛋白，2：牛血清蛋白。圖6為三免后抗血清e(cuò)lisa效價(jià)檢測的圖片；圖7為終放抗血清效價(jià)檢測的圖片；圖8為終放后抗體效價(jià)檢測的圖片。具體實(shí)施方式以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明：如無特殊說明，本發(fā)明所用原料均市售可得。實(shí)施例1按照本發(fā)明的方法制備嗜水氣單胞菌表面特異性抗原ahsas1.將嗜水氣單胞菌表面抗原蛋白基因編碼區(qū)克隆進(jìn)pet-28a載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21感受態(tài)細(xì)菌；待細(xì)菌生長至對(duì)數(shù)生長期前期，以0.5mmiptg誘導(dǎo)表達(dá)ahsa融合蛋白，25℃誘導(dǎo)24小時(shí)后離心收集菌體；s2.以20mmtris-hcl，150mmnacl將菌體重懸，超聲裂解bl21細(xì)菌，離心取裂解液上清。通過鎳柱純化嗜水氣單胞菌ahsa融合蛋白，以包含咪唑溶液洗脫蛋白；將蛋白進(jìn)行凝膠過濾進(jìn)一步提純，以sds-page確定蛋白濃度與純度；結(jié)果顯示純度達(dá)90％以上，濃度達(dá)10mg/ml。如圖1-圖4所示。實(shí)施例2采用常規(guī)方法制備嗜水氣單胞菌表面特異性抗原ahsa首先，將上述的基因片段與本領(lǐng)域常用的pproex-hta質(zhì)粒載體連接，將構(gòu)建成功的質(zhì)粒載體在大腸桿菌bl21中進(jìn)行表達(dá)純化，并用sds-page檢測。結(jié)果顯示本次純化出的蛋白濃度并不是很高，濃度大約在3mg/ml。實(shí)施例1與2的結(jié)果對(duì)比可知，按照本發(fā)明制備抗原的方法，得到的抗原ahsa具有濃度高和純度高的特點(diǎn)。實(shí)施例3制備基于嗜水氣單胞菌表面特異性抗原ahsa的多克隆抗體s1.純化后的蛋白用于免疫家兔，多次免疫后，獲得含嗜水氣單胞菌蛋白多克隆抗體的血清；s2.間接elisa檢測1.將抗原用0.05mol/l碳酸鹽(ph＝9.6)按0.2ug/孔包板，100ul/孔，4℃孵育過夜。2.洗板：取出用0.05％tween-20(pbst)洗滌三次，3分鐘/次。3.封閉：每孔加入5％脫脂奶粉100ul封閉液，37℃封閉60分鐘。4.洗板：取出用0.05％tween-20(pbst)洗滌三次，3分鐘/次。5.加一抗：將家兔的血清分別按照1:1000稀釋，然后倍比稀釋，37℃孵育1小時(shí)。6.洗板：取出用0.05％tween-20(pbst)洗滌三次，3分鐘/次。7.加二抗：辣根酶標(biāo)記山羊抗兔igg(h+l)，貨號(hào)：ab10058,抗體公司：生工生物工程(上海)有限公司；1:8000稀釋，37℃孵育45min。8.洗板：取出用0.05％tween-20(pbst)洗滌五次，3分鐘/次。9.顯色：加入底物溶液(tmb)100ul/孔，反應(yīng)15min，最后加入100ul2mol/l硫酸終止反應(yīng)。10.測od值：用酶標(biāo)儀(科華st-360)在450nm波長下測定od值。測定結(jié)果如下表1、2、3。表1為三免后抗血清e(cuò)lisa效價(jià)酶標(biāo)儀數(shù)據(jù)陰性空白1k2k4k8k16k32k64k128k256k512k0.0180.0071.3441.1331.0430.7530.5520.3540.1910.1070.0610.0390.0160.0151.1660.8510.6580.4250.2650.1560.0900.0510.0430.024表2為終放抗血清效價(jià)酶標(biāo)儀數(shù)據(jù)陰性空白1k2k4k8k16k32k64k128k256k512k0.0010.0011.3491.2881.2711.1010.9740.7450.4850.3060.2290.1320.0010.0031.3581.2020.9620.8140.6640.4300.2370.1290.0730.040表3為終放后抗體效價(jià)酶標(biāo)儀數(shù)據(jù)陰性空白1k2k4k8k16k32k64k128k256k512k0.0210.0091.0250.9320.9020.7790.6030.4430.3010.2040.1270.0920.0150.0051.0990.9641.0080.9100.7730.6300.4300.3230.2020.134將表1-3中血清效價(jià)值≥2.5×陰性值的數(shù)值做出標(biāo)記。由圖6-圖8抗體的效價(jià)檢測圖可以看出制備的抗體具有良好的效果。由圖5看出，制備出的多克隆抗體可以與ahsa蛋白特定結(jié)合，而不能識(shí)別牛血清蛋白，說明該抗體可以特異識(shí)別嗜水氣單胞菌，而不能識(shí)別其他菌?；诖私Y(jié)果，該抗體可用在臨床上用于檢測嗜水氣單胞菌的感染等方面也都在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。<110>大連民族大學(xué)<120>嗜水氣單胞菌表面特異性抗原ahsa及其抗體和應(yīng)用<160>1<210>1<211>546<212>dna<400>1tcagctgccgctctgggggtcgtcgatcaccagcttgccatccttgaccgggatggtggcgccgggggccttgttcatgcggatcaccccttcctgaccggcgaggcggtaggtgacgtcatagccaagggtgcgggtgctgctctcttgcaccgtcttgcagcgctgttcggtggtggtgtaggtatcaccggcctgcatgttgccctgcacctggttgccggcatagccacccgccacggcgcctgcggcggtcgccaccttcttgccgttgccgccaccaaactggttgccgagcaccccgcccagcgccgcaccgaccacggtacccaggatcttgtgctcgtcctgcaccggtttgcggtgggtcacgctgacgttgcgacactcctgacggggggtcttgatggtctcggtcaccgctttgctggccagcacttcggcgaactgaggctgtgatgaaaacagggatccgctggcggcggctgacaaggccagcgcagaggccacaccgatcccgactcctgccaacatggatttgttcat當(dāng)前第1頁12