本發(fā)明涉及真菌菌絲體樣品在rna和dna提取時的樣品預(yù)處理方法，具體屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

真菌是很大的一個微生物類群，可應(yīng)用于多個領(lǐng)域，在食藥用真菌、抗生素生產(chǎn)、酶制劑、食品發(fā)酵、紡織工業(yè)、石油脫蠟和環(huán)境有害污染物的降解等領(lǐng)域有諸多的研究和應(yīng)用。其中有多個真菌類群可以產(chǎn)生菌絲體，作為真菌的主要營養(yǎng)體。

近年來，隨著對真菌研究的深入，尤其對真菌分子生物學(xué)的研究，對真菌菌絲體中提取的rna和dna要求越來越高。以真菌菌絲體為材料提取rna和dna時，經(jīng)常使用液氮預(yù)處理真菌菌絲體，以便研磨獲得真菌菌絲體機械破碎的粉沫。但由于真菌菌絲體的材質(zhì)問題，其含有較多的多糖類物質(zhì)，在提取生長在培養(yǎng)皿固體培養(yǎng)基上的真菌菌絲體中的rna和dna時可能會出現(xiàn)下述情況：（1）刮取真菌菌絲體時可能會同時取到培養(yǎng)基；（2）在加入液氮以后，溫度低往往導(dǎo)致菌絲體結(jié)塊，不方便研磨，或者研磨時結(jié)塊的菌絲體打滑不容易固定，這為研碎菌絲體帶來一定的困難。而等溫度上升以后研磨，盡管可以磨碎菌絲體，但也會導(dǎo)致核酸酶的釋放，影響rna和dna的完整性；（3）菌絲體水份多的時候，菌絲體沾在研缽底部，加入液氮后沾住的菌絲體不容易研碎。這些情況的出現(xiàn)，為快速和大量樣品的處理帶來困難，尤其在進行實時熒光定量pcr的分析時，處理的樣品量非常大，這需要解決上述出現(xiàn)的樣品預(yù)處理問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供一種從真菌菌絲體中提取rna和dna時的樣品預(yù)處理方法。

本發(fā)明一種真菌菌絲體樣品預(yù)處理方法為：

(1)真菌菌絲體培養(yǎng)在pda培養(yǎng)基上，生長在培養(yǎng)皿中。

(2)將步驟(1)培養(yǎng)的真菌菌絲體連同培養(yǎng)皿一起放入超低溫冰箱中，控制溫度﹣45～﹣80℃，以溫度在﹣60℃至﹣80℃為宜，冷凍時間不少于3h。

(3)將研缽、缽杵和不銹鋼藥匙用酒精灼燒或在180℃溫度下處理2h，冷卻后用滅菌的紙將處理過的研缽、缽杵和不銹鋼藥匙包裹在一起，其后放入超低溫冰箱中，控制溫度﹣60～﹣80℃，冷凍時間不少于3h。

(4)用步驟(3)冰凍處理的不銹鋼藥匙迅速刮取冷凍處理的真菌菌絲體，并置于冷凍處理的研缽中，用冷凍處理的缽杵迅速研磨，使真菌菌絲體成粉末狀，得到用于提取rna或dna的真菌菌絲體樣品。

有益效果：本發(fā)明方法可應(yīng)用于產(chǎn)生菌絲體的所有真菌中，且整個提取過程不需要加入液氮，預(yù)處理方便，速度快，效率高，能夠?qū)崿F(xiàn)大批量不同菌絲體樣品的安全處理。

附圖說明

圖1：本發(fā)明蛹蟲草（cordycepsmilitaris）總rna電泳圖；

圖2：本發(fā)明毛霉屬真菌mucorardhlaengiktusrsc1菌絲體基因組dna的提取電泳圖；

圖中，1號泳道中為基因組dna，2號泳道中為dnamarkerdl-2000。

具體實施方式

實施例1

蛹蟲草菌絲體rna的提取

步驟1.將蛹蟲草的菌種在pda培養(yǎng)基上進行活化。

步驟2.將活化的菌種接種在培養(yǎng)皿的pda培養(yǎng)基上，接種時可以采用劃線的方式，也可以采用挑取菌絲塊，三點或者四點均勻接種在培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基上。

步驟3.接種有蛹蟲草的培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中遮光或光照培養(yǎng)（根據(jù)對菌絲體培養(yǎng)的性狀要求而定），溫度在25℃，培養(yǎng)時間為3-7d，除非特殊需要，以菌絲體不長滿培養(yǎng)皿為好。

步驟4.蛹蟲草菌絲體培養(yǎng)結(jié)束后，培養(yǎng)有菌絲體的培養(yǎng)皿無需其他處理，用塑料袋包裹后迅速放入-80℃超低溫冰箱冷凍處理，處理時間3h以上，以在-80℃超低溫冰箱中過夜為好。

步驟5.在處理蛹蟲草菌絲體的同時也對研磨用的研缽進行處理：將研缽和缽杵用酒精灼燒或者用180℃處理2h，同時每個研缽配一把不銹鋼藥匙并放在研缽中進行同樣處理。冷卻后用滅菌的牛皮紙或舊報紙將處理過的研缽包裹起來，缽杵和不銹鋼藥匙同研缽包裹在一起，包裹后也和菌絲體的處理一樣放入-80℃超低溫冰箱中進行同樣冷凍處理。

步驟6.步驟4中冷凍在培養(yǎng)皿固體培養(yǎng)基上的菌絲體已經(jīng)變脆，刮取時將不會同時將培養(yǎng)基取下來。用步驟4中冷凍處理的不銹鋼藥匙迅速刮取冷凍在培養(yǎng)皿固體培養(yǎng)基上的菌絲體后置于冷凍的研缽中，用冷凍的缽杵迅速研磨，使成粉沫狀。按重量（g）:體積（ml）=0.05～0.1:1的比例，將菌絲體粉沫加入trozol試劑中進行rna的提取，經(jīng)氯仿抽提、異丙醇對rna的沉淀和75%乙醇洗滌rna沉淀后可獲得理想的可用于相關(guān)研究的rna（見圖1）。

實施例2

一株毛霉屬真菌m.ardhlaengiktusrsc1菌絲體基因組dna的提取

步驟1.將毛霉屬真菌m.ardhlaengiktusrsc1菌種在pda培養(yǎng)基上進行活化。

步驟2.將活化的菌種接種在培養(yǎng)皿的pda培養(yǎng)基上，接種時采用劃線的方法。

步驟3.接種有毛霉屬真菌m.ardhlaengiktusrsc1培養(yǎng)皿在溫度28℃下培養(yǎng)時間為3d。

步驟4.毛霉屬真菌m.ardhlaengiktusrsc1培養(yǎng)結(jié)束后，培養(yǎng)有菌絲體的培養(yǎng)皿無需其他處理，用塑料袋包裹后迅速放入-80℃超低溫冰箱冷凍處理，處理時間3h以上，以在-80℃超低溫冰箱中過夜為好。

步驟5.在處理毛霉屬真菌m.ardhlaengiktusrsc1菌絲體的同時也對研磨用的研缽進行處理：將研缽和缽杵用酒精灼燒或者用180℃處理2h，同時每個研缽配一把不銹鋼藥匙并放在研缽中進行同樣處理。冷卻后用滅菌的牛皮紙或舊報紙將處理過的研缽包裹起來，缽杵和不銹鋼藥匙同研缽包裹在一起，包裹后也和菌絲體的處理一樣放入-80℃超低溫冰箱中進行同樣冷冰處理。

步驟6.將步驟4中冰凍在培養(yǎng)皿固體培養(yǎng)基上的菌絲體用步驟5中冷凍處理的不銹鋼藥匙迅速刮取后置于冰凍的研缽中，用冰凍的缽杵迅速研磨，使成粉沫狀。按重量（g）:體積（ml）=0.05～0.1:1的比例，將菌絲體粉沫加入sds提取液中進行dna的提取，經(jīng)氯仿抽提、乙醇沉淀和75%乙醇洗滌dna沉淀后可獲得理想的可用于相關(guān)研究的dna（見圖2）。

技術(shù)特征：

技術(shù)總結(jié)
一種真菌菌絲體樣品的預(yù)處理方法,是從真菌中提取RNA和DNA時，真菌菌絲體樣品的預(yù)處理方法。接種在PDA固體培養(yǎng)基上真菌培養(yǎng)合適時間后，連同培養(yǎng)皿直接放入超低溫冰箱中，控制溫度﹣45～﹣80℃，以溫度在﹣60℃至﹣80℃為宜，冷凍處理時間不少于3?h；同時滅菌處理的研缽、缽杵和不銹鋼藥匙用無菌牛皮紙包裹后同樣冷凍處理。處理后培養(yǎng)皿中的菌絲體將變脆，方便用冷的不銹鋼藥匙直接刮取，并迅速用冷的缽杵研磨成粉沫狀，這樣預(yù)處理的樣品可用于提取RNA和DNA之用。該方法不需要用液氮處理，更安全，方便對大量不同樣品的處理。此外，該方法處理時不會將培養(yǎng)基取出而混入菌絲體中，適用于生物技術(shù)、醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)等多個領(lǐng)域的研究。

技術(shù)研發(fā)人員：付鳴佳;鐘雪晴;葉德曉;楊志海;毛玉梅;李琴
受保護的技術(shù)使用者：江西師范大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：2017.04.25
技術(shù)公布日：2017.07.21