本發(fā)明涉及一株肉桂鏈霉菌（streptomycescinnamoneus）sk43.002及其生產(chǎn)磷脂酶d的方法，屬于食品生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
磷脂酶d（pld）（ec3.1.4.4）是一類催化磷酸二酯鍵水解和堿基交換反應(yīng)的酶的總稱，主要底物是磷脂酰膽堿（pc），將其水解成磷脂酸（pa）和膽堿。磷脂酶d廣泛存在于動植物和微生物體內(nèi)，植物體內(nèi)的磷脂酶d在信號傳導(dǎo)、膜運(yùn)輸?shù)确矫婢哂兄匾饔?；動物體內(nèi)的磷脂酶d多為膜結(jié)合酶；微生物來源的pld主要有鏈霉菌、棒狀桿菌、大腸桿菌、假單胞菌、沙門氏桿菌等，其中又以源自鏈霉菌屬的pld的轉(zhuǎn)磷酯活性最為突出。
磷脂酶d主要應(yīng)用于磷脂轉(zhuǎn)化和改性，制備高純度的磷脂產(chǎn)品，如磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油等；同時(shí)在油脂深加工中，較多利用磷脂酶d進(jìn)行大豆油脫膠等；磷脂酶d也可以應(yīng)用在醫(yī)藥工業(yè)中，其可將一些多肽、核苷和多糖類藥物通過配位鍵連接在磷脂載體上，制成具有特殊療效作用的脂質(zhì)體。利用磷脂酶d還可合成一些抗腫瘤試劑等。
目前，關(guān)于磷脂酶d的制備和研究主要針對鏈霉菌，鏈霉菌來源的磷脂酶d具有較高的水解和轉(zhuǎn)酰基活力，本發(fā)明中所利用的肉桂鏈霉菌同樣具有較高的酶學(xué)活性，可以進(jìn)一步大規(guī)模生產(chǎn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一株肉桂鏈霉菌及其生產(chǎn)磷脂酶d的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案：一株肉桂鏈霉菌是從油脂廠附近的土壤中篩選分離得到的一株可以高產(chǎn)磷脂酶d的鏈霉菌，分類命名為肉桂鏈霉菌（streptomycescinnamoneus）sk43.002，巳保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，筒稱cctcc，保藏編號為cctccno：m2017010。
用所述肉桂鏈霉菌cctccno：m2017010發(fā)酵生產(chǎn)磷脂酶d的方法，步驟如下：
（1）磷脂酶d的發(fā)酵液制備：對肉桂鏈霉菌（streptomycescinnamoneus）sk43.002進(jìn)行斜面、種子、發(fā)酵三級培養(yǎng)；
a、斜面培養(yǎng)：isp培養(yǎng)基（g/l）：酵母提取物2，麥芽提取物10，葡萄糖15，瓊脂15~20，自然ph，115℃滅菌30min，培養(yǎng)溫度28~30℃，培養(yǎng)時(shí)間5~8天；
b、種子培養(yǎng)：培養(yǎng)基（g/l）：葡萄糖10~20，酵母膏10~20，蛋白胨5~15，k2hpo40.1~2，mgso4?7h2o0.1~2，自然ph，115℃滅菌30min，培養(yǎng)條件：28℃、200rpm搖床培養(yǎng)24h；
c、發(fā)酵培養(yǎng)：培養(yǎng)基（g/l）：葡萄糖10~30，酵母膏5~20，蛋白胨10~20，k2hpo40.1~2，mgso4?7h2o0.1~2，自然ph，115℃滅菌30min，發(fā)酵條件：接種量5%、28℃、200rpm搖床培養(yǎng)5～8天，發(fā)酵得到含有磷脂酶d的發(fā)酵液，經(jīng)檢測酶活達(dá)到1～30u/ml；
（2）磷脂酶d的分離純化：對步驟（1）所得到的含有磷脂酶d發(fā)酵液進(jìn)行離心過濾以去除菌體得到發(fā)酵上清，再經(jīng)過硫酸銨分離沉淀目的蛋白、緩沖液透析、離子交換層析、凝膠過濾層析，超濾濃縮，最后將得到的純酶液體冷凍干燥成磷脂酶d酶粉。
本發(fā)明中的磷脂酶d活性，是將磷脂酶d作用于磷脂酰膽堿，分解生成膽堿，利用酶聯(lián)比色法檢測生成的膽堿的量而測定的。該酶的酶活單位定義為每分鐘生成1μmol的膽堿所需要的酶量。
本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明利用肉桂鏈霉菌作為磷脂酶d的生產(chǎn)菌株，該菌株培養(yǎng)方便，發(fā)酵工藝簡單。其酶為胞外酶，易于提取，酶活力高，性質(zhì)穩(wěn)定，具有廣闊的市場應(yīng)用前景。
生物材料樣品保藏：一株肉桂鏈霉菌，分類命名為肉桂鏈霉菌（streptomycescinnamoneus）sk43.002，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡稱cctcc，地點(diǎn)：中國武漢市武漢大學(xué)，保藏編號為cctccno:m2017010，保藏日期：2017年1月5日。
具體實(shí)施方式
以下是肉桂鏈霉菌（streptomycescinnamoneus）sk43.002進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)磷脂酶d的實(shí)施例，但本發(fā)明的技術(shù)范圍并不限于所列出的幾個(gè)實(shí)例，在不改變其要點(diǎn)的前提下，可做各種改變進(jìn)行實(shí)施。另外，本發(fā)明的技術(shù)范圍延及均等的范圍。
實(shí)施例1
將肉桂鏈霉菌（streptomycescinnamoneus）sk43.002在下述條件下進(jìn)行發(fā)酵：
斜面培養(yǎng)：isp培養(yǎng)基（g/l）：酵母提取物2，麥芽提取物10，葡萄糖15，瓊脂15，自然ph，115℃滅菌30min，培養(yǎng)溫度28℃，培養(yǎng)時(shí)間5天。
種子培養(yǎng)：培養(yǎng)基（g/l）：葡萄糖10，酵母膏20，蛋白胨5，k2hpo42，mgso4·7h2o0.5，自然ph，115℃滅菌30min。培養(yǎng)條件：28℃、200rpm搖床培養(yǎng)24h。
發(fā)酵培養(yǎng)：培養(yǎng)基（g/l）：葡萄糖10，酵母膏5，蛋白胨5，k2hpo42，mgso4·7h2o0.5，自然ph，115℃滅菌30min。發(fā)酵條件：接種量5%、28℃、200rpm搖床培養(yǎng)5天，得到含有磷脂酶d的發(fā)酵液，酶活力7.8u/ml。
實(shí)施例2
將肉桂鏈霉菌（streptomycescinnamoneus）sk43.002在下述條件下進(jìn)行發(fā)酵：
斜面培養(yǎng)：isp培養(yǎng)基（g/l）：酵母提取物2，麥芽提取物10，葡萄糖15，瓊脂15，自然ph，115℃滅菌30min，培養(yǎng)溫度28℃，培養(yǎng)時(shí)間5天。
種子培養(yǎng)：葡萄糖15，酵母膏15，蛋白胨15，k2hpo40.5，mgso4?7h2o2，自然ph，115℃滅菌30min，培養(yǎng)條件：28℃、200rpm搖床培養(yǎng)24h；
發(fā)酵培養(yǎng)：葡萄糖30，酵母膏20，蛋白胨15，k2hpo40.1~2，mgso4?7h2o2，自然ph，115℃滅菌30min，發(fā)酵條件：接種量5%、28℃、200rpm搖床培養(yǎng)8天，發(fā)酵得到含有磷脂酶d的發(fā)酵液，經(jīng)檢測酶活達(dá)到28.5u/ml。
實(shí)施例3
磷脂酶d酶粉制備：
將實(shí)施例1所得到的發(fā)酵液于4℃、8000rpm離心20min，取上清，再經(jīng)過20%~70%干燥的硫酸銨粉末分離沉淀目的蛋白、用ph=8的0.1m磷酸鹽緩沖液透析除去鹽離子，再依次經(jīng)過deae-ff16/10離子交換層析和superdex75凝膠過濾層析，用1萬da截留分子量超濾膜濃縮，冷凍干燥即成磷脂酶d酶粉，酶活力576u/mg。