本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體屬于一種轉(zhuǎn)染jurkat細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
外源基因轉(zhuǎn)移是一種運(yùn)用物理、化學(xué)或生物學(xué)的方法將外源基因轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞內(nèi)，并使之在胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)基因擴(kuò)增和表達(dá)的技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代生命科學(xué)研究和臨床醫(yī)學(xué)基因治療中。常用的外源基因轉(zhuǎn)移策略主要采用磷酸鈣沉淀法、deae-葡萄糖法和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法等，尤其是脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法受到了廣泛推廣。然而，脂質(zhì)體法僅適用于貼壁細(xì)胞，對懸浮細(xì)胞難以獲得令人滿意的轉(zhuǎn)染效率。目前懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染主要采用電穿孔技術(shù)，不僅需要特定的電轉(zhuǎn)儀，而且對細(xì)胞損傷較大、難以保證細(xì)胞活力。慢病毒和腺病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)雖然在一定程度上解決了轉(zhuǎn)染效率低的問題，然而操作過程繁瑣、安全風(fēng)險(xiǎn)大、應(yīng)用于基因治療容易引起嚴(yán)重的免疫反應(yīng)。因此，如何在高效轉(zhuǎn)染懸浮細(xì)胞的同時(shí)保證細(xì)胞活力成為以懸浮細(xì)胞為材料研究靶基因特定功能的一個亟待解決的問題。
jurkat細(xì)胞來源于急性t-淋巴細(xì)胞白血病患者的外周血，屬于懸浮細(xì)胞，是研究急性t-淋巴細(xì)胞白血病發(fā)病機(jī)制和治療藥物中應(yīng)用最廣泛的細(xì)胞系之一?，F(xiàn)有的轉(zhuǎn)染方法，如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、鈣轉(zhuǎn)和電擊轉(zhuǎn)染等方法轉(zhuǎn)染jurkat細(xì)胞普遍存在轉(zhuǎn)染效率低、細(xì)胞活力差的問題，這就大大限制了jurkat細(xì)胞在白血病機(jī)制研究和藥物研發(fā)中的應(yīng)用。因此，找到高效且安全的轉(zhuǎn)染方法，是以jurkat細(xì)胞為材料研究t淋巴細(xì)胞白血病的發(fā)病機(jī)制和靶向治療白血病的技術(shù)難題。
賴氨酸是一種帶正電荷的氨基酸，分子量大于70kd的多聚賴氨酸可以用于促進(jìn)細(xì)胞貼壁生長。多聚-d-賴氨酸和多聚-l-賴氨酸都可以用于促進(jìn)細(xì)胞的貼壁。李墨林等在2012年10月10日公開的方法中用到1mg/ml的多聚-l-賴氨酸處理細(xì)胞培養(yǎng)板并增加了懸浮細(xì)胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染效率。但是，此方法不適用于jurkat細(xì)胞。原因是多聚-l-賴氨酸可以被細(xì)胞消化并吸收，攝入過多的多聚-l-賴氨酸會產(chǎn)生一定的細(xì)胞毒性，且使用的濃度很大(1mg/ml)，造成了試劑的浪費(fèi)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種轉(zhuǎn)染效率高、安全的轉(zhuǎn)染jurkat細(xì)胞的方法。
本發(fā)明提供的一種轉(zhuǎn)染jurkat細(xì)胞的方法，包括以下步驟：
a.向24孔板內(nèi)加入150～500μl含有0.1mg/ml多聚-d-賴氨酸的pbs，向24孔板的另外一孔加入150～500μlpbs作為對照組，4度冰箱靜置過夜；所述多聚-d-賴氨酸分子量為150～300kd；
b.吸掉上清，pbs洗3～5次，將0.5～1.5×106個jurkat細(xì)胞重懸于500μl含有10％的新生牛血清且不含抗生素的rpmi1640培養(yǎng)基，在37度、5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10～16小時(shí)，然后吸掉未貼壁的細(xì)胞，用pbs洗3次，加入200～500μlpbs顯微鏡下觀察jurkat細(xì)胞貼壁情況計(jì)算相對貼壁率；
c.當(dāng)相對貼壁率大于3時(shí)，按照貼壁細(xì)胞的轉(zhuǎn)染方法，用3～9μl的脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染1～3μg的含有g(shù)fp表達(dá)序列的pll3.7質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后4～6小時(shí)，更換含有10％的新生牛血清的rpmi1640培養(yǎng)基，24小時(shí)后熒光顯微鏡下觀察gfp的表達(dá)情況，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。
用0.1mg/ml的多聚-d-賴氨酸與1.5×106個jurkat細(xì)胞作用38～46小時(shí)，mtt法測細(xì)胞活力，無顯著影響。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：
1)本發(fā)明用分子量為150～300kd的多聚-d-賴氨酸提前包被24孔細(xì)胞培養(yǎng)板后接種jurkat細(xì)胞，將懸浮的jurkat細(xì)胞變成“貼壁”細(xì)胞，再利用脂質(zhì)體2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，克服了jurkat細(xì)胞難轉(zhuǎn)染的問題，轉(zhuǎn)染效率達(dá)90％以上。
2)另外，在轉(zhuǎn)染過程所經(jīng)歷的42小時(shí)內(nèi)，低濃度的多聚-d-賴氨酸(0.1mg/l)對jurkat細(xì)胞的活力無顯著影響。因此，本發(fā)明提供了一種能高效無毒的傳遞dna進(jìn)入jurkat細(xì)胞的方法。此方法可為研究t淋巴細(xì)胞白血病的發(fā)病機(jī)制和靶向治療提供技術(shù)支持。
附圖說明
圖1本發(fā)明實(shí)施案例1相對貼壁率統(tǒng)計(jì)結(jié)果
圖2本發(fā)明實(shí)施案例1轉(zhuǎn)染效率統(tǒng)計(jì)結(jié)果
圖3本發(fā)明實(shí)施案例1細(xì)胞活力檢測結(jié)果
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1一種轉(zhuǎn)染jurkat細(xì)胞的方法，包括以下步驟：
a.向24孔板內(nèi)加入150μl含有0.1mg/ml多聚-d-賴氨酸的pbs，向24孔板的另外一孔加入150μlpbs作為對照組，4度冰箱靜置過夜。
b.吸掉上清，pbs洗3次，將1.5×106個jurkat細(xì)胞重懸于500μl含有10％的新生牛血清且不含抗生素的rpmi1640培養(yǎng)基，在37度、5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12小時(shí)。然后吸掉未貼壁的細(xì)胞，用pbs洗3次，每次洗5分鐘，加入300μlpbs顯微鏡下觀察jurkat細(xì)胞貼壁情況(圖1)。隨機(jī)選取8個視野，記錄每個視野的細(xì)胞數(shù)，每組的細(xì)胞數(shù)除以對照組的細(xì)胞數(shù)，得出相對貼壁率。
c.當(dāng)相對貼壁率大于3時(shí)，按照貼壁細(xì)胞的轉(zhuǎn)染方法，用脂質(zhì)體2000(3μl)轉(zhuǎn)染含有g(shù)fp表達(dá)序列的pll3.7質(zhì)粒(1μg)，轉(zhuǎn)染后6小時(shí)，更換含有10％的新生牛血清的rpmi1640培養(yǎng)基，24小時(shí)后熒光顯微鏡下觀察gfp的表達(dá)情況，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率(圖2)。轉(zhuǎn)染效率計(jì)算方法為，細(xì)胞轉(zhuǎn)染24小時(shí)后隨機(jī)選取10個視野，每個視野選定后分別在藍(lán)光和可見光下拍照，計(jì)數(shù)各個視野內(nèi)發(fā)綠色熒光的細(xì)胞數(shù)a1，a2，a3，……，a10和細(xì)胞總數(shù)b1，b2，
b3，……，b10，用a1/b1，……，a10/b10的平均值±sd做統(tǒng)計(jì)分析并做圖得到轉(zhuǎn)染效率。
用0.1mg/ml的多聚-d-賴氨酸的pbs與1.5×106個jurkat細(xì)胞作用42小時(shí)，mtt法測細(xì)胞活力(圖3)。pbs為對照組，即用等體積的pbs包被細(xì)胞培養(yǎng)板。經(jīng)過t-test檢測得出結(jié)論0.1mg/ml多聚-d-賴氨酸對jurkat細(xì)胞活力無顯著影響。