本發(fā)明涉及植物功能蛋白制備和應用，具體屬于一種來源于黍子籽?；蚴蚩返目梢哉T導腫瘤細胞程序性壞死的蛋白及其制備方法，以及該蛋白在制備抗腫瘤藥物中的應用。

背景技術：

黍子(panicummiliaceuml.)屬禾本科黍屬，一年生草本植物，主要生長在北方。籽實也叫黍子，糜子，淡黃色，去皮后俗稱黃米，常用于制作年糕，釀酒的原料，是重要的糧食作物之一。

黍子種子中含有17種氨基酸，含量較高，特別是必需氨基酸含量為4.76mg/100g，含量明顯高于小麥，且與標準食譜相近，易于人體吸收，可以作為人體營養(yǎng)的補充食物。黍子籽粒中的鈣、鎂、磷及微量元素鐵、銅、鋅含量是水稻的3.4倍、小麥的2.3倍、玉米的1.05倍，并且含有一定量的硒。這些微量元素對于活化人體免疫性和正常的生理功能，抗衰老、預防心血管病等方面有著重要的作用。此外，黍子具有一定的藥用價值，是我國傳統(tǒng)的中草藥之一。黍子性味甘、平、微寒、無毒。據(jù)《名醫(yī)別錄》記載：稷米“入脾、胃經”，功能“和中益氣、涼血解暑”。煮熟和研末食，主治氣虛乏力、中暑、頭暈、口渴等癥。黍米“入脾、胃、大腸、肺經”，功能“補中益氣、健脾益肺、除熱愈瘡”。主治脾胃虛弱、肺虛咳嗽、呃逆煩渴、泄瀉、胃痛、小兒鵝口瘡、燙傷等癥。

目前國內外關于黍子中活性物質的研究還較少，僅僅集中在其化學成分(植物多酚)和營養(yǎng)價值方面。黍糠是黍子加工過程中脫殼而得到的皮殼，也含有多種生物活性成分，是一種廉價而潛在的資源。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的來源于黍子，可誘導腫瘤細胞程序性壞死的蛋白具有較高的抗腫瘤活性，可在制備抗腫瘤藥物中應用。另外，這一發(fā)現(xiàn)將為進一步研究開發(fā)黍子高附加值產品以及黍子資源的綜合利用提供思路和依據(jù)，從而有利于推動黍子產業(yè)的規(guī)?；统掷m(xù)化發(fā)展，帶動我國半干旱、高海拔地區(qū)的經濟發(fā)展。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種可誘導腫瘤細胞程序性壞死的蛋白及其制備方法，以及將該蛋白在制備抗腫瘤藥物中得到應用。

本發(fā)明提供的一種可誘導腫瘤細胞程序性壞死的蛋白，來源于黍子(panicummiliaceuml.)籽?；蚴蚩?，其分子量為37kd，氨基酸序列為seqidno.1。

本發(fā)明提供的一種可誘導腫瘤細胞程序性壞死的蛋白，可以通過如下步驟的方法制得：

第一步：取干燥的黍子籽?；蚴蚩罚M一步粉碎后，然后按每克粉末加入10-15ml預冷的酸性蛋白提取液，4℃下攪拌4-8小時，8000-12000rpm離心10-20分鐘除去沉淀，收集上清，得到蛋白粗提液；所述的酸性蛋白提取液為20mmol/l醋酸銨緩沖液，ph4.5；

第二步：在蛋白粗提液中加入硫酸銨，至60％-80％的飽和度，在4℃攪拌3-5小時；8000-12000rpm離心20-30分鐘，收集沉淀；

第三步：用少量ph7.0的磷酸鹽緩沖液溶解沉淀，上樣于脫鹽柱，除去硫酸銨，收集蛋白峰得到蛋白粗品；

第四步：將蛋白粗品上樣于hitrap^tmsp弱陽離子交換進行分離純化，收集洗脫峰，將收集的洗脫峰蛋白上樣于凝膠層析柱，收集活性蛋白峰，真空冷凍干燥，得到可以誘導腫瘤細胞程序性壞死的蛋白。采用sds-page分析，該蛋白的分子量約為37kd。經胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶水解及肽質量指紋圖譜鑒定，并結合edman降解法測定其n端序列，確定氨基酸序列為seqidno.1。

本發(fā)明提供的腫瘤細胞程序性壞死蛋白是一種熱穩(wěn)定性較好，經紫外-可見分光光度計檢測，該蛋白在280nm和400nm處有吸收峰。

經體外抗腫瘤活性檢測顯示，該蛋白通過誘導多種腫瘤細胞發(fā)生程序性壞死，可以顯著地抑制腫瘤細胞增殖。當用終濃度為100ug/ml的該蛋白處理結腸癌細胞ht29細胞24小時，對該細胞的增殖抑制率達到60％以上，而當作用時間為48小時時，增殖抑制率達到90％以上。

本發(fā)明獲得的蛋白可以通過誘導腫瘤細胞壞死發(fā)揮抗增殖作用，因為程序性細胞壞死與經典的細胞凋亡在信號通路上存在較大的不同，當細胞凋亡通路被抑制時，在胞外信號刺激下可以誘導細胞發(fā)生程序性壞死。因此該蛋白對一些對常規(guī)藥物表現(xiàn)出抗性的細胞已具有顯著的增殖抑制作用。該蛋白可以在制備抗腫瘤藥物中應用，也可以在保健食品的制備中應用。

本發(fā)明首次從黍子中分離純化出一種可以誘導腫瘤細胞發(fā)生程序性壞死的蛋白，對多種腫瘤細胞具有顯著的增殖抑制作用。這一蛋白的發(fā)現(xiàn)為糜子高附加值產品以及糜子資源的綜合利用提供思路和依據(jù)，具有巨大的經濟價值，同時也為抗腫瘤藥物及保健食品的開發(fā)提供技術支持。

附圖說明

圖1是本發(fā)明可誘導腫瘤細胞程序性壞死的蛋白sds-page分析圖

圖2是本發(fā)明可誘導腫瘤細胞程序性壞死的蛋白紫外可見吸收光譜

圖3是本發(fā)明可誘導腫瘤細胞程序性壞死的蛋白對腫瘤細胞生長抑制圖

圖4是凋亡抑制劑z-vad和壞死抑制劑nec-1對本發(fā)明蛋白誘導細胞死亡的影響

具體實施方式

實施例1：黍子籽粒型可誘導腫瘤細胞程序性壞死的蛋白的制備

將烘干的黍子籽粒，進行粉碎后，收集粉末；稱取100g粉末，加入1000mlph4.5的20mm的醋酸鹽緩沖液，4℃提取6小時，8000rpm離心20分鐘除去沉淀，然后加入硫酸銨，至80％的飽和度；在4℃攪拌4小時，使蛋白充分沉淀，8000rpm離心30min，收集沉淀，用30mlph7.0的pbs緩沖液將沉淀重新溶解；將溶解的沉淀上樣于hiprep^tm26/10脫鹽柱，除去硫酸銨，收集蛋白峰得到蛋白粗提物；將粗提物上樣于hitrap^tmsp弱陽離子交換進行分離純化，收集氯化鈉洗脫峰，將收集的洗脫峰蛋白樣品再次上樣于hiprep^tm26/10脫鹽柱，收集蛋白峰，真空冷凍干燥，得到黍子籽粒中可誘導腫瘤細胞程序性壞死蛋白。采用folin-酚法測定蛋白濃度，經計算采用該方法制得9.1mg可誘導腫瘤細胞程序性壞死的蛋白，經sds-page分析,分子量大小為37kd。

實施例2：黍糠型可誘導腫瘤細胞程序性壞死的蛋白的制備

將黍子加工過程中的副產物黍糠，進行進一步粉碎后，收集粉末；稱取100g粉末，加入1000mlph4.0的20mm的醋酸鹽緩沖液，4℃提取4小時，8000rpm離心20min除去沉淀，上清用紗布過濾，然后加入硫酸銨，至80％的飽和度；在4℃攪拌4小時，使蛋白充分沉淀，8000rpm離心30min，收集沉淀，用30mlph7.0的pbs緩沖液將沉淀重新溶解；將溶解的沉淀上樣于hiprep^tm26/10脫鹽柱，除去硫酸銨，收集蛋白峰得到蛋白粗提物；將粗提物上樣于hitrap^tmsp弱陽離子交換柱進行分離純化，收集洗脫峰，將收集的洗脫峰蛋白樣品再次上樣于hiprep^tm26/10脫鹽柱，收集蛋白峰，真空冷凍干燥，得到黍糠中可誘導腫瘤細胞程序性壞死的蛋白。采用folin-酚法測定蛋白濃度，經計算采用該方法制得16.5mg可誘導腫瘤細胞程序性壞死的蛋白。經sds-page分析,分子量大小為37kd(見圖1)。經紫外-可見分光光度計檢測，該蛋白在280nm和400nm兩處有特征吸收峰(見圖2)。

實施例3可誘導腫瘤細胞程序性壞死的蛋白氨基酸序列的測定

經sds-page分離后，切下含有實施例2制備的蛋白的條帶，經胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶水解后，進行肽質量指紋圖譜鑒定。經胰蛋白酶水解后的樣品然后進行maldi-tof/tof-ms檢測，測得肽質量指紋譜，在數(shù)據(jù)庫中查詢識別的方式鑒定實施例2制備的蛋白。經過blast分析，找出與鑒定的蛋白同源性較高的序列。經胰凝乳蛋白酶水解后的樣品測得肽質量指紋圖譜，在數(shù)據(jù)庫中進行搜索比對，找出與數(shù)據(jù)庫中相符的肽段。將兩種酶水解后得到的肽段進行拼接，得到實施例2制備的蛋白的主體序列。將實施例2制備的蛋白應用edman降解法測定n端20個氨基酸序列。該n端序列和肽質量指紋圖譜得到的序列進行拼接，得到實施例2制備的蛋白完整的氨基酸序列，該序列如seqidno.1所示。

實施例4：可誘導腫瘤細胞程序性壞死的蛋白對腫瘤細胞生長抑制實驗(mtt法)

應用mtt法，檢測實施例2制備的蛋白對腫瘤細胞株hepg2，ht29，sw480，hct116等的生長抑制作用。取對數(shù)生長期的細胞，以1-5×10³個/孔傳入96孔培養(yǎng)板，37℃含5％的co2細胞培養(yǎng)箱中孵育24小時后，分別加入可誘導腫瘤細胞程序性壞死的蛋白，使其終濃度分別為25μg/ml,50μg/ml,75μg/ml,100μg/ml,每組濃度設5個復孔，并用等體積的ph7.0的20mm/lpbs緩沖液作為對照，孵育48h后，每孔加入20μlmtt試劑(5mg/ml)，繼續(xù)孵育4小時后，終止培養(yǎng)，棄去孔內培養(yǎng)上清，每孔加入150μldmso,振蕩10分鐘，使結晶物充分溶解，在酶標儀上490nm波長處測定其光吸收值。本發(fā)明所得黍糠腫瘤細胞程序性壞死蛋白對hepg2,sw480，hct116和ht29具有顯著的增殖抑制作用(見圖3)。

實施例5：可誘導腫瘤細胞程序性壞死的蛋白對腫瘤細胞生長抑制實驗(atp法)

細胞內atp快速降低是細胞發(fā)生壞死的一個顯著特征，通過測定細胞內atp含量，檢測實施例2制備的蛋白對腫瘤細胞株hepg2，ht29，sw480，hct116等的生長抑制作用。取對數(shù)生長期的細胞，以1-5×10³個/孔轉入不透光的96孔板，用25μg/ml,50μg/ml,75μg/ml,100μg/ml可誘導腫瘤細胞程序性壞死蛋白，分別處理細胞48h，棄去培養(yǎng)液，加入100μldmem培養(yǎng)基室溫平衡30min,添加100μlcelltiter-glo試劑，搖床混合2min,誘導細胞裂解,室溫孵育10min，穩(wěn)定發(fā)光信號,酶標儀檢測發(fā)光信號。結果顯示，本發(fā)明所得可誘導腫瘤細胞程序性壞死蛋白對hepg2，sw480，hct116和dld1細胞中atp的降低有非常顯著的效果，具有顯著的增殖抑制作用(見圖3)。

實施例6：凋亡抑制劑z-vad和壞死抑制劑nec-1對本發(fā)明蛋白誘導hct116細胞死亡的影響

當細胞內caspase酶活性被抑制，細胞的活性進一步減弱，而細胞程序性壞死抑制劑necrostatin-1(nec-1)可以特異性抑制細胞壞死，使細胞活力恢復。取對數(shù)生長期的細胞，以1-5×10³個/孔轉入96孔培養(yǎng)板，37℃含5％的co2細胞培養(yǎng)箱中孵育24小時后，分別加入終濃度為50μg/ml可誘導腫瘤細胞程序性壞死蛋白，同時加入不同濃度的抑制劑z-vad和nec-1，每組濃度設5個復孔，并用等體積的ph7.0的20mm/lpbs緩沖液作為對照，孵育48h后，每孔加入20μlmtt試劑(5mg/ml)，繼續(xù)孵育4小時后，終止培養(yǎng)，棄去孔內培養(yǎng)上清，每孔加入150μldmso,振蕩10分鐘，使結晶物充分溶解，在酶標儀上490nm波長處測定其光吸收值。結果顯示，當caspase抑制劑z-vad與可誘導腫瘤細胞程序性壞死蛋白共同作用時，顯著加強了可誘導腫瘤細胞程序性壞死蛋白誘導的細胞死亡，而壞死抑制劑nec-1顯著減弱了可誘導腫瘤細胞程序性壞死蛋白誘導的細胞死亡(見圖4)。結果表明,可誘導腫瘤細胞程序性壞死蛋白誘導的細胞死亡是程序性壞死，而不是細胞凋亡。

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<120>可誘導腫瘤細胞程序性壞死的蛋白及其制備方法和應用

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