本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，更具體地，涉及一種重組蛋白及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

心肌肥厚是機(jī)體對(duì)生理及病理上壓力所產(chǎn)生的一種適應(yīng)性應(yīng)答，它是心血管疾病患病病人死亡率升高的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。心臟為了應(yīng)答壓力負(fù)荷，個(gè)體的心肌細(xì)胞開始機(jī)械性的拉伸并且激活細(xì)胞內(nèi)的促肥厚信號(hào)途徑，導(dǎo)致胚胎期的轉(zhuǎn)錄因子再次被激活，并且各種蛋白質(zhì)的合成增多，如各種結(jié)構(gòu)蛋白及收縮相關(guān)蛋白。這些蛋白合成增多會(huì)導(dǎo)致心肌結(jié)構(gòu)紊亂，心臟收縮力降低，氧耗增多，供血不足，最終會(huì)導(dǎo)致心力衰竭，心律失?；蛘哜赖?。

諸如高血壓，心肌梗死，心臟瓣膜病變，動(dòng)脈粥樣硬化及一些遺傳性心臟病都會(huì)導(dǎo)致心肌肥厚的發(fā)生，往往我們認(rèn)為心肌肥厚是不可逆的。因此，如何有效控制心肌肥厚的發(fā)生，成為了臨床干預(yù)的基礎(chǔ)。探明心肌肥厚疾病分發(fā)病機(jī)理及尋找有效的干預(yù)方法，具有重要的臨床及研究意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的以上缺陷或改進(jìn)需求，本發(fā)明提供了一種重組蛋白及其應(yīng)用，其目的在于通過(guò)所述重組蛋白制備抗心肌肥厚及心衰的藥物，有效控制心肌肥厚的發(fā)生和臨床干預(yù)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，按照本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種抑制心肌肥厚的重組蛋白基因aggf1，所述基因的核苷酸序列為seqidno：1所示的序列。

按照本發(fā)明的另一方面，提供了一種抑制心肌肥厚的重組蛋白基因aggf1的克隆方法，使用seqidno：3所示的正向引物和seqidno：4所示的反向引物,應(yīng)用pcr方法從人的cdna中克隆得到aggf1基因。

按照本發(fā)明的另一方面，提供了一種表達(dá)抑制心肌肥厚的重組蛋白的重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒由以下步驟制得：

(1)將aggf1基因與his標(biāo)簽序列連接，所述aggf1基因的核苷酸序列為seqidno：1所示的序列；

(2)將步驟(1)中得到的連接有his標(biāo)簽序列的aggf1基因序列插入到表達(dá)載體的多克隆酶切位點(diǎn)處，得到重組質(zhì)粒。

優(yōu)選地，所述的表達(dá)載體為pet28a。

按照本發(fā)明的另一方面，提供了一種抑制心肌肥厚的重組蛋白，該蛋白的氨基酸序列為：

(1)由seqidno：2氨基酸序列所示；或

(2)與序列seqidno：2限定的氨基酸序列同源性在80％至100％編碼相同功能蛋白質(zhì)的氨基酸序列；或

(3)seqidno：2限定的氨基酸序列經(jīng)增加、缺失或替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸，具有與序列seqidno：2序列所示的蛋白質(zhì)具有同等活性的氨基酸序列。

按照本發(fā)明的另一方面，提供了一種抑制心肌肥厚的重組蛋白的制備方法，包括以下步驟：

(1)將人源aggf1基因與his標(biāo)簽序列連接后，插入到原核表達(dá)載體pet28a的多克隆酶切位點(diǎn)處，構(gòu)建含有aggf1基因的重組質(zhì)粒pet28a-aggf1，所述aggf1基因的核苷酸序列為seqidno：1所示的序列；；

(2)將步驟(1)所述的的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入原核細(xì)胞，并通過(guò)抗生素抗性篩選，得到具有抗生素抗性的陽(yáng)性細(xì)胞克??；

(3)將步驟(2)中得到的陽(yáng)性細(xì)胞克隆擴(kuò)增培養(yǎng)后，分離純化后得到所述的抑制心肌肥厚的重組蛋白。

按照本發(fā)明的另一方面，提供了一種抑制心肌肥厚的重組蛋白的應(yīng)用，其特征在于，應(yīng)用于制備抗心肌肥厚或抗心衰藥物。

按照本發(fā)明的另一方面，提供了一種藥物組合物，其特征在于，其包含如權(quán)利要求4所述的多肽和藥學(xué)上可接受的賦形劑。

按照本發(fā)明的另一方面，提供了一種如權(quán)利要求7所述的藥物組合物的制備方法，其特征在于，包括將如權(quán)利要求4所述的多肽與至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑混合。

總體而言，通過(guò)本發(fā)明所構(gòu)思的以上技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的重組aggf1蛋白能通過(guò)阻斷心肌細(xì)胞凋亡通路來(lái)保護(hù)心肌細(xì)胞，提高左心室射血分?jǐn)?shù)和左心室縮短分?jǐn)?shù)，抑制心肌肥厚，最終抑制心衰的發(fā)生。因此，本發(fā)明含有his標(biāo)簽的重組aggf1蛋白能制備抗心肌肥厚及心衰藥物，用于心肌肥厚疾病的治療。

附圖說(shuō)明

圖1是實(shí)施例3假手術(shù)組，對(duì)照治療組及aggf1治療組心肌肥厚小鼠的心臟心態(tài)學(xué)染色；

圖2是實(shí)施例3假手術(shù)組，對(duì)照治療組及aggf1治療組的心肌肥厚小鼠心功能參數(shù)；圖2a是射血分?jǐn)?shù)，圖2b是縮短分?jǐn)?shù)；

圖3是實(shí)施例3重組aggf1蛋白抑制心肌梗死導(dǎo)致的心臟纖維化結(jié)果；

圖4是實(shí)施例3的光學(xué)顯微鏡下的tunel實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；

圖5是實(shí)施例3的tunel實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。此外，下面所描述的本發(fā)明各個(gè)實(shí)施方式中所涉及到的技術(shù)特征只要彼此之間未構(gòu)成沖突就可以相互組合。

為了去有效控制心肌肥厚的發(fā)生及臨床干預(yù)。探明心肌肥厚疾病分發(fā)病機(jī)理及尋找有效的干預(yù)方法。本發(fā)明提供一種體外純化的重組蛋白，即aggf1蛋白，制備抗心肌肥厚藥物，具有治療心肌肥厚并且抑制心衰的效果。本發(fā)明提供的一種重組蛋白，編碼所述重組蛋白的核酸序列為：

(1)由seqidno.1所示的核酸序列編碼的蛋白質(zhì)；或

(2)與序列seqidno.1限定的核酸序列同源性在80％至100％編碼相同功能蛋白質(zhì)的核酸序列；或

(3)seqidno.1所示的核酸序列經(jīng)增加、缺失或替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸具有同等活性的由(1)衍生的序列。

所述重組蛋白命名為aggf1蛋白，其編碼基因通過(guò)基因連鎖定位分析，在先天性靜脈畸形骨肥大綜合征(klippel-trenaunaysyndrome，簡(jiǎn)稱kts)中發(fā)現(xiàn)并克隆出的新基因。aggf1蛋白在內(nèi)皮細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞及成骨細(xì)胞中有著極高的表達(dá)量。并且在各種組織的血管中，都能檢測(cè)到aggf1的較高表達(dá)量。雞胚絨毛實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，重組的aggf1蛋白和vegf一樣，有強(qiáng)烈的促血管生成能力。并且aggf1裸質(zhì)粒注射能顯著提高后肢缺血小鼠的缺血后肢血流灌注并且抑制缺血后肢的組織壞死。使用aggf1的純化蛋白治療急性心肌梗死小鼠，能提高小鼠生存率和心功能。

實(shí)施例1

aggf1重組蛋白的制備

在大腸桿菌bl21中表達(dá)aggf1蛋白表達(dá)質(zhì)粒pet28-aggf1，其中aggf1序列如seqno.1所示。將表達(dá)菌株在20ml卡那霉素抗性的lb培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)。第二天，將這20ml培養(yǎng)基加入到1l卡那霉素抗性的lb培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)2.5小時(shí)。然后加入1mm的iptg誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。iptg是一種高度穩(wěn)定的乳糖類似物，它可以抑制lac阻遏蛋白，誘導(dǎo)β-半乳糖苷酶的合成。這種酶能促進(jìn)乳糖的利用。iptg能用來(lái)誘導(dǎo)被lac操縱子調(diào)控的目的基因的表達(dá)。加入iptg誘導(dǎo)后，大腸桿菌在培養(yǎng)基中繼續(xù)生長(zhǎng)5.5小時(shí)。再離心培養(yǎng)基，4000rpm，4℃，10mins。如果不立即分離蛋白，則把大腸桿菌沉淀儲(chǔ)存在-20℃。純化重組蛋白采用的是qiaexpressionist高水平表達(dá)和六聯(lián)組氨酸標(biāo)記蛋白純化手冊(cè)(qiagen)。配制6ml緩沖液(50mmnah2po4,300mmnacl,20mmimidazole,0.05％tween-20,ph8.0)，加入蛋白酶抑制劑混合物(6μg/mlchymostatin,1μg/mle64,2μg/mlaprotinin,0.5μg/mlphosphoramidon,1μg/mlpepstatina,5μg/mlleupeptin,5μg/mlantipain,0.1mmbenzamidine(sigma))。將緩沖液加入到1l培養(yǎng)基離心后的大腸桿菌沉淀中，重懸菌體，在懸浮液中加入1mg/ml溶菌酶(invitrogen)，冰浴30分鐘。利用超聲波破碎儀的超聲探頭破碎懸浮液。功率300w，每次超聲時(shí)間10s，間隙時(shí)間10s，進(jìn)行6次。將破碎后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入ep管中，離心，12000rpm，4℃，50mins。吸取上清液，保存在冰上。ni-nta瓊脂糖珠用來(lái)從上清液中純化帶his-tag標(biāo)簽的蛋白。ni-nta金屬螯合親和層析對(duì)帶有六聯(lián)組氨酸標(biāo)簽的生物分子有非常高的親和力。ni-nta珠子用5ml的pbs洗兩次，將上清液加入到珠子中(每份珠子加1ml上清液)，混合液在4℃搖床孵育過(guò)夜。第二天，離心棄上清。珠子用緩沖液(50mmnah2po4,300mmnacl,20mmimidazole,0.05％tween-20,ph8.0)洗三次，減少非特異性結(jié)合蛋白。6x-histag標(biāo)記蛋白用1ml洗脫液(50mmnah2po4,300mmnacl,250mmimidazole,0.05％tween-20,ph8.0)洗脫。洗脫下來(lái)的蛋白透析兩次，在4℃1xpbs中用spectra/pordialysistubing(spectrumlaboratories,inc.,usa)進(jìn)行透析。透析后將純化的蛋白質(zhì)分裝保存在-80℃，即為本發(fā)明提供的重組蛋白。

實(shí)施例2

aggf1同源重組蛋白制備

對(duì)含有aggf1重組蛋白質(zhì)氨基酸序列有100％，99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，84％，83％，82％、81％及80％同源性的蛋白質(zhì)(通過(guò)aggf1蛋白序列截短或者突變獲得的同源性蛋白)制備。以真核表達(dá)的pcdna3.1-aggf1為模板，pcr擴(kuò)增出aggf1基因的全長(zhǎng)和各個(gè)截短片段，所獲得的各截短片段經(jīng)雙酶切后克隆至pet28蛋白表達(dá)質(zhì)粒中，將構(gòu)建的aggf1全長(zhǎng)以及各截短質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入ecolibl21中,采用iptg誘導(dǎo)aggf1基因截短融合蛋白表達(dá),采用westernblotting法鑒定aggf1基因截短融合蛋白的表達(dá)。制備方法同實(shí)施例1。

實(shí)施例3

實(shí)施例1中合成的重組蛋白促血管生成效果及在制備抗心肌梗死藥物中的應(yīng)用

將c57bl/6小鼠分為4組：假手術(shù)組給安慰劑組(sham+pbs)，假手術(shù)給aggf1蛋白組(sham+aggf1)，心肌肥厚手術(shù)給安慰劑組(tac+pbs)，心肌肥厚手術(shù)給重組aggf1蛋白組(tac+aggf1),每組小鼠12只。pbs為磷酸緩沖液。在手術(shù)前及心肌肥厚手術(shù)后，用小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)對(duì)小鼠的心功能進(jìn)行評(píng)估。手術(shù)后一天，小鼠用超聲檢測(cè)，確定細(xì)節(jié)肥厚手術(shù)成功。手術(shù)成功2周后，通過(guò)小鼠尾靜脈注射重組aggf1蛋白或者相同劑量的pbs做為對(duì)照，一周兩次，持續(xù)4周。蛋白給藥劑量為0.25mg/kg。

如圖1所示：對(duì)比用重組aggf1蛋白治療的心肌肥厚小鼠及使用對(duì)照pbs治療的心肌肥厚小鼠心臟，aggf1蛋白能顯著抑制心臟肥厚，從圖1中可以看出，用重組aggf1蛋白治療過(guò)的心肌肥厚的小鼠的心臟體積比使用對(duì)照pbs治療的心肌肥厚小鼠心臟要小得多。

此外，本發(fā)明實(shí)施例中，假手術(shù)組給安慰劑組(sham+pbs)，假手術(shù)給aggf1蛋白組(sham+aggf1)，心肌肥厚手術(shù)給安慰劑組(tac+pbs)，心肌肥厚手術(shù)給重組aggf1蛋白組(tac+aggf1)小鼠的心功能。相比對(duì)照pbs治療組的小鼠，重組aggf1蛋白治療的心肌肥厚小鼠心功能有明顯好轉(zhuǎn)，其心功能指標(biāo)：射血分?jǐn)?shù)lvef(圖2a)，縮短分?jǐn)?shù)(圖2b)相比對(duì)照組顯著升高并且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。lvef指左心室射血分?jǐn)?shù)，fs指左心室短軸縮短率，是評(píng)價(jià)心臟收縮功能的指標(biāo)，心肌肥厚的小鼠在aggf1重組蛋白的治療下，心臟的lvef和縮短分?jǐn)?shù)提高，說(shuō)明心臟收縮能力增強(qiáng)，心臟功能好轉(zhuǎn)。圖3的he染色顯示，給予aggf1治療的tac小鼠的心臟，與pbs安慰劑治療的tac小鼠心臟相比，心肌膠原纖維增生明顯減少，心肌細(xì)胞肥大以及壞死性變化明顯減少。說(shuō)明重組aggf1蛋白治療的急性心肌梗死小鼠能顯著抑制心肌梗死導(dǎo)致的心臟纖維化(圖3)。圖4，小鼠心臟切片進(jìn)行tunel凋亡檢測(cè)。原理是熒光素(fluorescein)標(biāo)記的dutp在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(tdtenzyme)的作用下，可以連接到凋亡細(xì)胞中斷裂dna的3’-oh末端，并與連接辣根過(guò)氧化酶(hrp，horse-radishperoxidase)的熒光素抗體特異性結(jié)合，后者又與hrp底物二氨基聯(lián)苯胺(dab)反應(yīng)產(chǎn)生很強(qiáng)的顏色反應(yīng)(呈深棕色)，特異準(zhǔn)確地定位正在凋亡的細(xì)胞，因而在光學(xué)顯微鏡下即可觀察凋亡細(xì)胞；由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒(méi)有dna斷裂，因而沒(méi)有3'-oh形成，很少能夠被染色。陽(yáng)性信號(hào)為細(xì)胞核呈棕黃色，不著色為陰性。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，給予aggf1治療的tac小鼠的心臟，與pbs安慰劑治療的tac小鼠心臟相比，tunel陽(yáng)性信號(hào)細(xì)胞明顯減少，顯示使用重組aggf1蛋白治療心肌梗死能抑制心肌細(xì)胞凋亡，圖5為統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)(p<0.01)。

綜上所述，本發(fā)明中的含有his標(biāo)簽的重組aggf1蛋白能通過(guò)抗小鼠心肌肥厚，改善小鼠心功能，抑制心肌細(xì)胞凋亡和心臟纖維化，最終抑制心衰。因此，本發(fā)明含有his標(biāo)簽的重組aggf1蛋白能制備抗心肌肥厚及心衰藥物，用于心肌肥厚及心衰疾病的治療。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>華中科技大學(xué)

<120>抑制心肌肥厚的重組蛋白基因及其表達(dá)產(chǎn)物和應(yīng)用

<130>4

<160>4

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