本發(fā)明涉及一種sgrna導(dǎo)向序列及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：crispr/cas9基因編輯系統(tǒng)是基于ii類crispr/cas系統(tǒng)改造而來的。cas9蛋白是唯一所需要的，用來介導(dǎo)外源dna沉默的cas蛋白。2012年，jinek通過體外實驗證實cas9蛋白對原間隔序列進(jìn)行切割不僅僅需要與原間隔序列互補(bǔ)的成熟的crrna，還需要tracrrna；通過對切割后的片段測序發(fā)現(xiàn)，tracrrna：crrna指導(dǎo)cas9蛋白切割位點是具有位點特異性的，無論是環(huán)狀質(zhì)粒還是線性dna片段，切割位點均在pam序列上游的3bp處；cas9蛋白包含hnh及ruvc內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域，無論對哪個結(jié)構(gòu)域進(jìn)行突變，均無法有效的進(jìn)行切割，只是在雙鏈dna上產(chǎn)生切口，實驗證實hnh結(jié)構(gòu)域會對與crrna互補(bǔ)鏈進(jìn)行切割，而ruvc結(jié)構(gòu)域則會對另一條鏈進(jìn)行切割；對于眾多的crispr/cas系統(tǒng)，識別自我與非我的關(guān)鍵就在于保守的pam序列，對于ii類crispr/cas系統(tǒng)，pam序列為ngg，當(dāng)對pam序列進(jìn)行突變后，將無法進(jìn)行有效的切割；此外，還成功的將crrna與tracrrna兩條鏈成功的融合成一條大約100nt的單鏈向?qū)na(guiderna，grna)，并能正常發(fā)揮crrna：tracrrna的功能。這項工作為crispr/cas系統(tǒng)由細(xì)菌的天然防御系統(tǒng)向基因編輯工具的轉(zhuǎn)變奠定了基礎(chǔ)。2013年1月，麻省理工學(xué)院以及哈佛醫(yī)學(xué)院同時再science上首次發(fā)表了使用crispr/cas系統(tǒng)對哺乳動物細(xì)胞進(jìn)行基因編輯。在麻省理工學(xué)院的研究中，使用釀膿鏈球菌的ii類crispr/cas系統(tǒng)，針對人的emx1位點設(shè)計的crrna能夠高效的在人的293ft細(xì)胞基因組的emx1位點上產(chǎn)生突變。針對該基因的不同pam序列設(shè)計crrna以及crrna與tracrrna嵌合在一起的chirna，對細(xì)胞進(jìn)行基因編輯，crrna均能產(chǎn)生有效的突變，但可能由于rna的二級結(jié)構(gòu)的影響，并不是所有的chirna都能進(jìn)行高效的位點突變，此外，利用該系統(tǒng)對基因組進(jìn)行切割后，不僅能夠通過非同源性末端接合(nhej)的方式進(jìn)行修復(fù)，獲得在切割位點附近的堿基缺失或是插入，還可以通過同源重組修復(fù)(hdr)的方式，實現(xiàn)特異基因片段的重組，此外，通過針對同一基因的兩個位點設(shè)計crrna，可以成功的進(jìn)行一段片段的基因敲除。使用ruvc結(jié)構(gòu)域突變的cas9蛋白也能夠通過同源重組的修復(fù)方式進(jìn)行修復(fù)，但無法獲得非同源性末端接合的突變。哈佛醫(yī)學(xué)院也獲得了類似的結(jié)果，且crispr/cas9系統(tǒng)的基因編輯效率與先前出現(xiàn)的talen效率類似，并能夠同時針對多個位點進(jìn)行基因編輯。進(jìn)一步證實了crispr/cas9系統(tǒng)終將成為真核生物基因編輯領(lǐng)域強(qiáng)大的基因編輯工具。insulinlikegrowthfactorbindingprotein3(igfbp3)基因?qū)儆谏L激素超家族基因。主要作用是與igf1基因和igf2結(jié)合使igf1和igf2基因在體內(nèi)能正常運輸。igfbp3基因主要表達(dá)組織：早期胚胎，內(nèi)胚層，間充質(zhì)細(xì)胞，消化道系統(tǒng)，心血管系統(tǒng)，淋巴系統(tǒng)，肝膽系統(tǒng)，骨骼肌，神經(jīng)系統(tǒng)，生殖系統(tǒng)，泌尿系統(tǒng)。igfbp3基因單敲除后小鼠表行沒有變化，igfbp3基因雙敲除后，主要表型為白色脂肪組織減少，體重增加，肝臟重增加，肌肉重量增加。同時，對高糖和高油脂食物出現(xiàn)耐受。這些表型的出現(xiàn)一般認(rèn)為是igfbp3基因敲除后，igfbp2基因出現(xiàn)補(bǔ)償效應(yīng)，igfbp2基因的表達(dá)量升高，導(dǎo)致igf1基因在血液中含量增高，最終導(dǎo)致小鼠體重的增加。同時，基因敲除小鼠的采食量相比于正常小鼠沒有發(fā)生顯著性改變。在豬中研究表明，igfbp3基因與豬屠體重和背膘厚呈顯著相關(guān)。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明目的在于提供一種特異靶向豬igfbp3基因的sgrna導(dǎo)向序列及其應(yīng)用，該sgrna導(dǎo)向序列可以用于敲除豬igfbp3基因，為制備轉(zhuǎn)基因豬奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明特異靶向豬igfbp3基因的sgrna導(dǎo)向序列為igfbp3-sgrna1，其核苷酸序列為：5’-cgtctcgcgcttggactcag-3’，如seqidno：1所示，位于基因igfbp3第二外顯子。上述特異靶向豬igfbp3基因的sgrna導(dǎo)向序列在敲除豬igfbp3基因中的應(yīng)用，具體方法如下：一、在豬igfbp3基因的sgrna導(dǎo)向序列的5’端加上cacc得到正向寡核苷酸；同時根據(jù)導(dǎo)向序列獲得得其對應(yīng)的dna互補(bǔ)鏈，并且再起5’端加上aaac得到反向寡核苷酸；分別合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，將合成的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸變性，退火，形成雙鏈；二、將步驟一制得的雙鏈dna與crispr/cas9載體連接，得到重組敲除表達(dá)載體；三、將步驟二制得的重組表達(dá)載體連接入藥物篩選抗性基因序列；四、將步驟三制得的重組敲除表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，得到成功敲除igfbp3基因的細(xì)胞。進(jìn)一步的，步驟二中所述的crispr/cas9載體為px330載體。進(jìn)一步的，步驟三中所述的藥物篩選抗性基因序列為g418抗性基因序列。進(jìn)一步的，步驟四中所述轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法為脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法。進(jìn)一步的，步驟四中所述的細(xì)胞為豬成纖維細(xì)胞。上述特異靶向豬igfbp3基因的sgrna導(dǎo)向序列在特異識別和靶向修飾豬igfbp3基因中的應(yīng)用。上述特異靶向豬igfbp3基因的sgrna導(dǎo)向序列在構(gòu)建豬igfbp3基因突變庫中的應(yīng)用。特異靶向豬igfbp3基因的sgrna導(dǎo)向序列，能產(chǎn)生基因插入突變、基因序列置換、基因序列缺失等多種類型igfbp3基因突變體，可以在構(gòu)建豬igfbp3基因突變庫中的應(yīng)用。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果：本發(fā)明根據(jù)sgrna導(dǎo)向序列設(shè)計合成兩條單鏈核苷酸序列，退火形成雙鏈，然后與cas9載體連接，利用cas9載體將sgrna及crispr系統(tǒng)引入目標(biāo)細(xì)胞中，cas9蛋白會在sgrna的引導(dǎo)下找到與其匹配的基因組dna序列，進(jìn)行剪切，實現(xiàn)豬基因igfbp3的敲除。(1)利用質(zhì)粒載體px330將sgrna以及crispr系統(tǒng)引入細(xì)胞中，cas9蛋白會在sgrna的引導(dǎo)下找到與其匹配的dna序列，進(jìn)行剪切。質(zhì)粒載體安全性高，不會引起細(xì)胞的免疫反應(yīng)。(2)載體中含有g(shù)418抗性基因，利用g418對細(xì)胞進(jìn)行篩選，未轉(zhuǎn)入px330載體的細(xì)胞將在篩選過程中被淘汰。(3)本發(fā)明提供的特異靶向豬igfbp3基因的sgrna導(dǎo)向序列，可通過crispr/cas9系統(tǒng)敲除或編輯igfbp3基因，進(jìn)而消除igfbp3的表達(dá)，為制備igfbp3轉(zhuǎn)基因豬奠定基礎(chǔ)。附圖說明圖1是特異靶向豬igfbp3基因的sgrna導(dǎo)向序列及其位置示意圖。圖2是pcr擴(kuò)增豬igfbp3基因外顯子2片段電泳圖。具體實施方式下面對本發(fā)明的實施例做詳細(xì)說明，以下實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實施，給出了詳細(xì)的實施方案和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實施例。以下實施例中所使用的細(xì)胞為原代培養(yǎng)豬成纖維細(xì)胞，px330，pegfp-c1載體購自addgene，內(nèi)切酶bbsi，bsmbi購自neb，g418和細(xì)胞培養(yǎng)基購自sigma。實施例1：(1)sgrna設(shè)計根據(jù)豬igfbp3基因的基因組序列(geneid：001005156)，設(shè)計1個靶向豬igfbp3基因的sgrna。20nt的寡核苷酸sgrna導(dǎo)向序列為：igfbp3-sgrna1:5’-cgtctcgcgcttggactcag-3’，位于基因igfbp3第二外顯子；在其5’端加上cacc得到正向寡核苷酸序列；根據(jù)導(dǎo)向序列獲得其對應(yīng)的dna互補(bǔ)鏈，并且在其5’端加上aaac得到反向寡核苷酸。分別合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，將合成的正向和反向sgrna寡核苷酸序列：95℃變性5min，72℃退火10min；退火后可以形成帶有粘性末端的雙鏈dna，具體寡核苷酸序列見表1。表1sgrna導(dǎo)向序列的寡核苷酸序列核苷酸序列(5’至3’)sg1-fcacccgtctcgcgcttggactcagsg1-raaacctgagtccaagcgcgagacg(2)構(gòu)建表達(dá)sgrna的載體質(zhì)粒載體px330有bbsi酶切位點，用bbsi酶切，其中，酶切體系為10μl體系：bbsi1μl；10×nebuffer1μl；質(zhì)粒2μl；ddh2o6μl；酶切條件為：37℃酶切過夜；將酶切后載體px330與步驟(1)制得的退火雙鏈利用t4連接酶進(jìn)行連接，連接體系為10μl體系：px330載體2μl，退火雙鏈sgrna6μl，10nebt4dnaligasebuffer1μl，t4ligase1μl；連接條件為16℃連接過夜；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌dh5α，具體轉(zhuǎn)化方法為：-80℃取出感受態(tài)細(xì)菌dh5α，在冰浴溶解；然后100μl感受態(tài)細(xì)菌中加入10μl的上述連接產(chǎn)物，混勻后冰浴30min；42℃水浴100s熱激活，冰浴2min；然后加入900μlsoc培養(yǎng)基，37℃搖床60min；涂amp+(100μg/ml)固體soc培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)過夜，挑取陽性克隆，在soc液體培養(yǎng)基中37℃搖床過夜，之后用tiangen質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒并測序驗證，得到表達(dá)sgrna的px330-igfbp3-sg1質(zhì)粒載體。實施例2：(1)g418抗性基因的獲得根據(jù)質(zhì)粒pegfp-c1載體中g(shù)418抗性基因設(shè)計引物，引物寡核苷酸序列5’端加入bsmbi酶切位點，kana-f：5-ggcgtctccgggatgtgcgcggaacccctatttg-3，kana-r：5-ggcgtctcgcgcgcaatctaaagtatatatgagtaacc-3，分別合成上下游引物序列，以質(zhì)粒pegfp-c1為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，pcr反應(yīng)體系為50μl體系：pegfp-c1質(zhì)粒1μl，2×pcrmix25μl，上下游引物各1μl，ddh2o22μl。pcr反應(yīng)條件為：94℃5min，94℃30s，60℃45s，72℃1min40s，共33個循環(huán)，之后72℃延伸10min。獲得的dna片段命名為kana。表2擴(kuò)增kana片段的引物序列序列(5’至3’)kana-fggcgtctccgggatgtgcgcggaacccctatttgkana-rggcgtctcgcgcgcaatctaaagtatatatgagtaacc(2)構(gòu)建含有g(shù)418抗性基因的載體質(zhì)粒將px330-igfbp3-sg1質(zhì)粒載體和kana片段dna分別用bsmbi酶切，酶切體系為20μl體系：bbsi1μl；10×nebuffer2μl；質(zhì)?；騞na片段4μl；ddh2o13μl；酶切條件為：37℃酶切過夜；將酶切后的px330-igfbp3-sg1質(zhì)粒載體和kana片段利用t4連接酶進(jìn)行連接，連接步驟同實施例1中步驟(2)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌dh5α，轉(zhuǎn)化步驟同實施例1中步驟(2)，得到連接g418抗性基因的px330-g418-igfbp3-sg1質(zhì)粒載體。實施例3：(1)豬成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)豬胎兒成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)方法參見文獻(xiàn)：信吉閣；成文敏；潘偉榮；卿玉波；查星琴；富國文；魏紅江；曾養(yǎng)志。豬胎兒成纖維細(xì)胞和耳皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)方法的研究，黑龍江畜牧獸醫(yī)，2013(9)：175-179.(2)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和陽性細(xì)胞篩選將重組質(zhì)粒px330-g418-igfbp3-sg1通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細(xì)胞，得到重組細(xì)胞。轉(zhuǎn)染的具體步驟參見脂質(zhì)體3000(invitrogen，貨號：11668019)操作說明書方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞利用1000ng/ml的g418對轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行篩選，篩選持續(xù)10d，對篩選后的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)并冷凍保存。(3)基因敲除效果鑒定根據(jù)所設(shè)計的sgrna序列設(shè)計鑒定引物，用于對敲除后目的片段進(jìn)行鑒定，所設(shè)計的引物如表3所示：表3擴(kuò)增igfbp3片段的引物序列序列(5’至3’)e2-fgtcgttaaatgccaatgaccctce2-raggtgcaccccaccccaccat利用takara公司takaraminibestuniversalgenomicdnaextractionkitver.5.0，codeno.9765.對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行基因組抽提，利用鑒定引物進(jìn)行pcr鑒定。其pcr反應(yīng)體系為50μl體系：基因組dna1μl，2×pcrmix25μl，上下游引物各1μl，ddh2o22μl。pcr反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共33個循環(huán)，之后72℃延伸10min。獲得的dna片段命名為igfbp3-e2。pcr反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后，利用gelextractionkit(takara)進(jìn)行膠回收，對膠回收產(chǎn)物進(jìn)行測序分析，測序結(jié)果如圖2所示。測序結(jié)果表明細(xì)胞基因組在基因編輯處發(fā)生了突變，對照組與野生型基因組進(jìn)行了對比沒有發(fā)生變化。本發(fā)明成功建立了敲除igfbp3基因的豬成纖維細(xì)胞。序列表<110>東北農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>一種特異靶向豬igfbp3基因的sgrna導(dǎo)向序列及應(yīng)用<160>7<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>導(dǎo)向序列igfbp3-sgrna1<400>1cgtctcgcgcttggactcag20<210>2<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>寡核苷酸序列sg1-f<400>2cacccgtctcgcgcttggactcag24<210>3<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>寡核苷酸序列sg1-r<400>3aaacctgagtccaagcgcgagacg24<210>4<211>34<212>dna<213>人工序列<220><223>序列kana-f<400>4ggcgtctccgggatgtgcgcggaacccctatttg34<210>5<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223>序列kana-r<400>5ggcgtctcgcgcgcaatctaaagtatatatgagtaacc38<210>6<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列e2-f<400>6gtcgttaaatgccaatgaccctc23<210>7<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列e2-r<400>7aggtgcaccccaccccaccat21當(dāng)前第1頁12