本發(fā)明屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種活體箱形水母蛋白類毒素的粗純方法。
背景技術(shù)：
箱形水母（chironexfleckeri）屬腔腸動(dòng)物門、缽水母綱、立方水母目、箱形水母科。箱形水母是一種淡藍(lán)色的透明水母，形狀像個(gè)箱子，有4個(gè)明顯的側(cè)面，有數(shù)十根觸須，每條觸須上布滿了儲(chǔ)存毒液的刺細(xì)胞，是世界上毒性最強(qiáng)的水母，根據(jù)美國國家科學(xué)基金會(huì)提供的數(shù)據(jù)，單是在菲律賓，每年就有20～40人死于箱形水母的毒刺。箱形水母毒素具有溶血活性、神經(jīng)毒性、皮膚肌肉毒性，是極具潛力的海洋藥物開發(fā)資源，但由于其巨大的毒性，為進(jìn)一步研究及未來生產(chǎn)帶來困難，如何安全獲得其毒素也是各國科學(xué)家研究的重點(diǎn)之一。
目前獲得水母毒素的方法主要是用自動(dòng)降解法來分離刺絲囊，將水母觸角在4℃下，一定量的海水或nacl溶液中放置1～4天，等待水母自動(dòng)降解后，采用離心法回收得到小球狀的刺絲囊，此法得到的刺絲囊細(xì)胞最純凈，活性最好，中國專利申請(qǐng)?zhí)?01010149779.5名稱為一種水母毒素去溶血毒性的方法，即采用此方法獲得水母粗毒提取液。但此法具有較多缺點(diǎn)，如水母觸角只能一次性利用，不能循環(huán)持續(xù)使用，即便水母觸手可以再生，也需7-10天才能再生完成，耗時(shí)較長，不利于工業(yè)化水母毒素采集的實(shí)現(xiàn)。而水母在有觸手的情況下，再生刺絲囊僅需2天時(shí)間，如果能單獨(dú)采集刺絲囊，不損傷水母觸手，那將縮短采集周期，有利于實(shí)現(xiàn)連續(xù)化、工業(yè)化生產(chǎn)，本發(fā)明正是為實(shí)現(xiàn)這一目的而產(chǎn)生。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供一種活體箱形水母蛋白類毒素的粗純方法。
為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明公開的技術(shù)方案特征包含如下步驟：
a)淀粉凝固體制備：淀粉20～30%（w/w），增稠劑0～20%（w/w），純化水補(bǔ)齊至100%（w/w），加熱煮沸，期間不停攪拌，待無沉淀時(shí)，停止加熱，入模（模底鋪設(shè)尼龍紗網(wǎng)）晾至室溫，即為淀粉凝固體；
b)覆網(wǎng)：在淀粉凝固體未完全凝固時(shí)，外測(cè)使用尼龍紗網(wǎng)固定，以增加淀粉凝固體的抗破損性能；
c)毒素收集：使用覆網(wǎng)淀粉凝固體模仿水母食物，接近箱形水母，誘導(dǎo)水母對(duì)其進(jìn)行防御和捕獵，等待一段時(shí)間后回收覆網(wǎng)淀粉凝固體；
d)酶解：對(duì)回收的覆網(wǎng)淀粉凝固體進(jìn)行解剖，取外層厚度1～5mm淀粉凝固體壓碎，使用組氨酸修飾的淀粉酶，于20～35℃進(jìn)行酶解，加入一定量的純化水，酶解至無大塊淀粉固體殘留時(shí)停止，獲得酶解液；
e)離心：保持4℃，對(duì)酶解液進(jìn)行離心，以除去未酶解的殘?jiān)?，保留離心上清液；
f)鎳柱層析：保持4℃，將上清液進(jìn)行循環(huán)上樣于鎳柱層析柱，保留最終的濾出液，除去淀粉酶，最后洗脫層析柱回收淀粉酶；
g)超濾除雜：保持4℃，使用截留量為1kd的水性膜對(duì)步驟f）中的濾出液進(jìn)行超濾，除去鹽、葡萄糖等小分子雜質(zhì)，并對(duì)水母毒素進(jìn)行濃縮，保留超濾液即為水母毒素粗純液。
所述的淀粉包括但不限于玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、紅薯淀粉。
所述的增稠劑包括但不限于黃原膠、卡拉膠、明膠。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：只對(duì)箱形水母刺絲囊及其毒性物質(zhì)進(jìn)行采集，對(duì)水母損害小，其再生時(shí)間短，僅需2天，生產(chǎn)可持續(xù)性極具優(yōu)勢(shì)，為未來工業(yè)化利用水母毒素提供了條件；使用酶法分解淀粉凝固體時(shí)間較水母自溶時(shí)間更短，利于縮短生產(chǎn)時(shí)間；收集的刺絲囊及其毒素，受外界蛋白污染可能性小，初步純化分離出的蛋白僅為水母毒素蛋白，為后續(xù)進(jìn)一步純化創(chuàng)造良好的基礎(chǔ)。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1：
將玉米淀粉25g、黃原膠3g、純化水72g加入不銹鋼鍋中加熱煮沸，不停攪拌至無沉淀后，倒入長20cm，寬12cm，深2cm的不銹鋼方槽中冷卻凝固，方槽中鋪上已洗凈網(wǎng)孔孔徑為2mm的尼龍紗網(wǎng)，未凝固完全時(shí)，再覆蓋上一層尼龍紗網(wǎng)，凝固后，小心脫模。將覆網(wǎng)淀粉凝固體固定在不銹鋼或塑料延長棍上，接近自然水域中或人工養(yǎng)殖的活體箱形水母8只，輕微攪動(dòng)，誘導(dǎo)水母對(duì)其進(jìn)行防御行為，每只收集10min后，回收覆網(wǎng)淀粉凝固體，用純化水稍沖洗，小心撕取下尼龍網(wǎng)，將兩面5mm厚度的淀粉凝固體用不銹鋼刀切下，使用不銹鋼板將其壓碎完全，加入200ml純化水，加入組氨酸修飾的α-淀粉酶10000u，設(shè)置溫度25℃，酶解5h，無大塊淀粉固體殘留，4℃離心，保留上清液，向上清液中加入tris-hcl，使終濃度為20mmol/l，加入nacl，使終濃度為5mol/l，使用金屬鎳親和層析法進(jìn)行純化，流速1ml/min，重復(fù)過柱一次，以除去淀粉酶。于4℃對(duì)回收的過柱液進(jìn)行超濾濃縮，以除去淀粉酶水解出的單糖及多糖以及緩沖液中的鹽，使用截留量為1kd的水性纖維素膜，向超濾液中加入純化水1l，濃縮至體積為50ml時(shí)停止?jié)饪s，即為水母毒素粗純液。
實(shí)施例2：
將土豆淀粉26g、卡拉膠2g、純化水72g加入不銹鋼鍋中加熱煮沸，不停攪拌至無沉淀后，倒入長20cm，寬12cm，深2cm的不銹鋼方槽中冷卻凝固，方槽中鋪上已洗凈網(wǎng)孔孔徑為2mm的尼龍紗網(wǎng)，未凝固完全時(shí)，再覆蓋上一層尼龍紗網(wǎng)，凝固后，小心脫模。將覆網(wǎng)淀粉凝固體固定在不銹鋼或塑料延長棍上，接近自然水域中或人工養(yǎng)殖的活體箱形水母6只，輕微攪動(dòng)，誘導(dǎo)水母對(duì)其進(jìn)行防御行為，每只收集10min后，回收覆網(wǎng)淀粉凝固體，用純化水稍沖洗，小心撕取下尼龍網(wǎng)，將兩面5mm厚度的淀粉凝固體用不銹鋼刀切下，使用不銹鋼板將其壓碎完全，加入300ml純化水，加入組氨酸修飾的α-淀粉酶10000u，設(shè)置溫度25℃，酶解4h，無大塊淀粉固體殘留，4℃離心，保留上清液，向上清液中加入tris-hcl，使終濃度為20mmol/l，加入nacl，使終濃度為5mol/l，使用金屬鎳親和層析法進(jìn)行純化，流速1ml/min，重復(fù)過柱一次，以除去淀粉酶。于4℃對(duì)回收的過柱液進(jìn)行超濾濃縮，以除去淀粉酶水解出的單糖及多糖以及緩沖液中的鹽，使用截留量為1kd的水性纖維素膜，向超濾液中加入純化水1l，濃縮至體積為50ml時(shí)停止?jié)饪s，即為水母毒素粗純液。