背景技術(shù)：

1、需要不僅能夠鑒定非整倍性風(fēng)險，而且還能夠鑒定具有其他不良圍產(chǎn)期結(jié)果(諸如早產(chǎn)、先兆子癇、小于胎齡、自發(fā)終止和非活產(chǎn))高風(fēng)險的妊娠的非侵入性產(chǎn)前測試方法。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本公開的一方面涉及一種制備源自孕婦的第一血液樣品或其級分的擴增dna制劑的方法，該制劑可用于鑒定具有早產(chǎn)、先兆子癇、小于胎齡、自發(fā)終止和/或非活產(chǎn)高風(fēng)險的妊娠，該方法包括：(a)從第一血液樣品或其級分中提取細胞游離dna，以獲得包含母體細胞游離dna和胎兒細胞游離dna的第一提取物dna；(b)通過對第一提取dna進行靶向多重擴增以在單個反應(yīng)體積中擴增200-20,000個snp基因座從而獲得擴增dna來制備第一擴增dna制劑，其中200-20,000個snp基因座位于一個或多個所關(guān)注染色體上；以及(c)通過對擴增dna進行高通量測序以獲得序列讀段并使用序列讀段確定一個或多個所關(guān)注染色體的倍性狀態(tài)來分析第一擴增dna制劑；其中小于2.8％的胎兒分數(shù)和/或一個或多個所關(guān)注染色體的倍性狀態(tài)的無判定指示具有早產(chǎn)、先兆子癇、小于胎齡、自發(fā)終止和/或非活產(chǎn)高風(fēng)險的妊娠。

2、本公開的另一方面涉及一種用于制備擴增dna制劑的方法，該制劑可用于鑒定具有早產(chǎn)、先兆子癇、小于胎齡、自發(fā)終止和/或非活產(chǎn)高風(fēng)險的妊娠，該方法包括：(a)從孕婦的第一血液樣品或其級分中提取細胞游離dna，以獲得包含母體細胞游離dna和胎兒細胞游離dna的第一提取物dna；(b)通過對第一提取dna進行靶向多重擴增以在單個反應(yīng)體積中擴增200-20,000個snp基因座從而獲得擴增dna來制備第一擴增dna制劑，其中200-20,000個snp基因座位于一個或多個所關(guān)注染色體上；(c)通過對擴增dna進行高通量測序以獲得序列讀段并使用序列讀段確定一個或多個所關(guān)注染色體的倍性狀態(tài)來分析第一擴增dna制劑；(d)從孕婦的縱向收集的第二血液樣品或其級分中提取細胞游離dna，以獲得包含母體細胞游離dna和胎兒細胞游離dna的第二提取dna；(e)通過對第二提取dna進行靶向多重擴增以在單個反應(yīng)體積中擴增200-20,000個snp基因座從而獲得擴增dna來制備第二擴增dna制劑，其中200-20,000個snp基因座位于一個或多個所關(guān)注染色體上；以及(f)通過對擴增dna進行高通量測序以獲得序列讀段并使用序列讀段確定一個或多個所關(guān)注染色體的倍性狀態(tài)來分析第二擴增dna制劑；其中針對第一血液樣品和第二血液樣品中的每一個，小于2.8％的胎兒分數(shù)和/或一個或多個所關(guān)注染色體的倍性狀態(tài)的無判定指示具有早產(chǎn)、先兆子癇、小于胎齡、自發(fā)終止和/或非活產(chǎn)高風(fēng)險的妊娠。

3、本公開的另一方面涉及一種用于制備擴增dna制劑的方法，該制劑可用于鑒定具有早產(chǎn)、先兆子癇、小于胎齡、自發(fā)終止和/或非活產(chǎn)高風(fēng)險的妊娠，該方法包括：(a)從孕婦的第一血液樣品或其級分中提取細胞游離dna，以獲得包含母體細胞游離dna和胎兒細胞游離dna的第一提取物dna；(b)通過對第一提取dna進行靶向多重擴增以在單個反應(yīng)體積中擴增200-20,000個snp基因座從而獲得擴增dna來制備第一擴增dna制劑，其中200-20,000個snp基因座位于一個或多個所關(guān)注染色體上；(c)通過對擴增dna進行高通量測序以獲得序列讀段并使用序列讀段確定一個或多個所關(guān)注染色體的倍性狀態(tài)來分析第一擴增dna制劑；(d)從孕婦的縱向收集的第二血液樣品或其級分中提取細胞游離dna，以獲得包含母體細胞游離dna和胎兒細胞游離dna的第二提取dna；(e)通過對第二提取dna進行靶向多重擴增以在單個反應(yīng)體積中擴增200-20,000個snp基因座從而獲得擴增dna來制備第二擴增dna制劑，其中200-20,000個snp基因座位于一個或多個所關(guān)注染色體上；以及(f)通過對擴增dna進行高通量測序以獲得序列讀段并使用序列讀段確定一個或多個所關(guān)注染色體的倍性狀態(tài)來分析第二擴增dna制劑；其中針對第一血液樣品和第二血液樣品中的每一個，小于2.8％、或小于2.7％、或小于2.6％、或小于2.5％、或小于2.4％、或小于2.3％、或小于2.2％、或小于2.1％、或小于2.0％的胎兒分數(shù)指示具有早產(chǎn)、先兆子癇、小于胎齡、自發(fā)終止和/或非活產(chǎn)高風(fēng)險的妊娠。在一些實施例中，使用序列讀段來量化胎兒分數(shù)。在一些實施例中，使用基于甲基化的多重ddpcr來量化胎兒分數(shù)。在一些實施例中，使用片段長度和片段計數(shù)來量化胎兒分數(shù)。

4、本公開的進一步方面涉及一種用于制備擴增dna制劑的方法，該制劑可用于鑒定具有早產(chǎn)、先兆子癇、小于胎齡、自發(fā)終止和/或非活產(chǎn)高風(fēng)險的妊娠，該方法包括：(a)從孕婦的第一血液樣品或其級分中提取細胞游離dna，以獲得包含母體細胞游離dna和胎兒細胞游離dna的第一提取物dna；(b)通過對第一提取dna進行靶向多重擴增以在單個反應(yīng)體積中擴增200-20,000個snp基因座從而獲得擴增dna來制備第一擴增dna制劑，其中200-20,000個snp基因座位于一個或多個所關(guān)注染色體上；(c)通過對擴增dna進行高通量測序以獲得序列讀段并使用序列讀段確定一個或多個所關(guān)注染色體的倍性狀態(tài)來分析第一擴增dna制劑；(d)從孕婦的縱向收集的第二血液樣品或其級分中提取細胞游離dna，以獲得包含母體細胞游離dna和胎兒細胞游離dna的第二提取dna；(e)通過對第二提取dna進行靶向多重擴增以在單個反應(yīng)體積中擴增200-20,000個snp基因座從而獲得擴增dna來制備第二擴增dna制劑，其中200-20,000個snp基因座位于一個或多個所關(guān)注染色體上；以及(f)通過對擴增dna進行高通量測序以獲得序列讀段并使用序列讀段確定一個或多個所關(guān)注染色體的倍性狀態(tài)來分析第二擴增dna制劑；其中針對第一血液樣品和第二血液樣品中的每一個，一個或多個所關(guān)注染色體的倍性狀態(tài)的無判定指示具有早產(chǎn)、先兆子癇、小于胎齡、自發(fā)終止和/或非活產(chǎn)高風(fēng)險的妊娠。

技術(shù)特征：

1.一種制備源自孕婦的第一血液樣品或其級分的擴增dna制劑的方法，所述制劑可用于鑒定具有早產(chǎn)、先兆子癇、小于胎齡、自發(fā)終止和/或非活產(chǎn)高風(fēng)險的妊娠，所述方法包括：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其進一步包括。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其進一步包括將針對所述第一血液樣品和所述第二血液樣品中的每一個具有所述一個或多個所關(guān)注染色體的倍性狀態(tài)的無判定的孕婦鑒定為具有至少40％的37周前早產(chǎn)、先兆子癇和/或小于胎齡風(fēng)險。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其進一步包括將針對所述第一血液樣品和所述第二血液樣品中的每一個具有所述一個或多個所關(guān)注染色體的倍性狀態(tài)的無判定的孕婦鑒定為具有至少50％的37周前早產(chǎn)、先兆子癇和/或小于胎齡風(fēng)險。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其進一步包括將針對所述第一血液樣品和所述第二血液樣品中的每一個具有所述一個或多個所關(guān)注染色體的倍性狀態(tài)的無判定的孕婦鑒定為具有至少15％的先兆子癇風(fēng)險。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其進一步包括將針對所述第一血液樣品和所述第二血液樣品中的每一個具有所述一個或多個所關(guān)注染色體的倍性狀態(tài)的無判定的孕婦鑒定為具有至少20％的28周前早產(chǎn)風(fēng)險。

7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其進一步包括將針對所述第一血液樣品和所述第二血液樣品中的每一個具有所述一個或多個所關(guān)注染色體的倍性狀態(tài)的無判定的孕婦鑒定為具有至少25％的34周前早產(chǎn)風(fēng)險。

8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其進一步包括將針對所述第一血液樣品和所述第二血液樣品中的每一個具有所述一個或多個所關(guān)注染色體的倍性狀態(tài)的無判定的孕婦鑒定為具有至少40％的37周前早產(chǎn)風(fēng)險。

9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其進一步包括將針對所述第一血液樣品和所述第二血液樣品中的每一個具有所述一個或多個所關(guān)注染色體的倍性狀態(tài)的無判定的孕婦鑒定為具有至少10％的小于胎齡風(fēng)險。

10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其進一步包括鑒定針對所述第一血液樣品和所述第二血液樣品中的每一個具有小于2.5％的胎兒分數(shù)的孕婦。

11.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其進一步包括對縱向收集的第三血液樣品或其級分重復(fù)步驟(d)-(f)。

12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項所述的方法，其中步驟(a)包括從所述血液樣品的血漿級分中提取細胞游離dna。

13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項所述的方法，其中步驟(b)包括使用200-20,000對靶標特異性pcr引物或者使用通用引物和200-20,000個靶標特異性引物對200-20,000個snp基因座進行pcr擴增。

14.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項所述的方法，其中步驟(b)包括使用1,000-20,000對靶標特異性pcr引物或者使用通用引物和1,000-20,000個靶標特異性引物對1,000-20,000個snp基因座進行pcr擴增。

15.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項所述的方法，其中步驟(b)包括使用5,000-20,000對靶標特異性pcr引物或者使用通用引物和5,000-20,000個靶標特異性引物對5,000-20,000個snp基因座進行pcr擴增。

16.根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項所述的方法，其中步驟(b)中的所述擴增dna各自包含從所述提取dna擴增的100bp或更少。

17.根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項所述的方法，其中步驟(b)中的所述擴增dna各自包含從所述提取dna擴增的80bp或更少。

18.根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項所述的方法，其中步驟(b)中的所述擴增dna各自包含從所述提取dna擴增的60-80bp。

19.根據(jù)權(quán)利要求1至18中任一項所述的方法，其中步驟(b)進一步包括在所述靶向多重擴增之后的加條形碼pcr。

20.根據(jù)權(quán)利要求1至19中任一項所述的方法，其中所述一個或多個所關(guān)注染色體的倍性狀態(tài)通過以下方式來確定：基于所述序列讀段來計算所述snp基因座處的等位基因計數(shù)；創(chuàng)建各自與所述所關(guān)注染色體的不同可能倍性狀態(tài)有關(guān)的多個倍性假設(shè)；針對每個倍性假設(shè)為所述所關(guān)注染色體上的所述snp基因座處的預(yù)期等位基因計數(shù)建立聯(lián)合分布模型；使用所述聯(lián)合分布模型和所述等位基因計數(shù)確定所述倍性假設(shè)中的每一個倍性假設(shè)的相對概率；以及通過選擇對應(yīng)于具有最大概率的假設(shè)的倍性狀態(tài)來判定胎兒的倍性狀態(tài)。

技術(shù)總結(jié)
本公開提供了用于制備源自孕婦的血液樣品的擴增DNA制劑的方法，所述制劑可用于鑒定具有早產(chǎn)、先兆子癇、小于胎齡、自發(fā)終止和/或非活產(chǎn)高風(fēng)險的妊娠，所述方法包括：(a)從所述血液樣品中提取細胞游離DNA；(b)對提取的DNA進行靶向多重擴增，以在單個反應(yīng)體積中擴增200?20,000個SNP基因座；以及(c)對擴增DNA進行高通量測序以獲得序列讀段并使用所述序列讀段確定一個或多個所關(guān)注染色體的倍性狀態(tài)；其中小于2.8％的胎兒分數(shù)和/或所述一個或多個所關(guān)注染色體的倍性狀態(tài)的無判定指示具有早產(chǎn)、先兆子癇、小于胎齡、自發(fā)終止和/或非活產(chǎn)高風(fēng)險的妊娠。

技術(shù)研發(fā)人員：扎卡里·德姆克,馬修·拉比諾維茨,喬治·吉梅洛斯
受保護的技術(shù)使用者：納特拉公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/9/9