背景技術(shù)：

1、c-c基序趨化因子受體8(ccr8)是一種七次跨膜g蛋白偶聯(lián)受體(gpcr)。ccr8優(yōu)先在胸腺中表達。ccr8及其配體在單核細胞趨化性和胸腺細胞凋亡的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。更具體地，ccr8可能有助于活化的t細胞在抗原性攻擊位點和淋巴組織的專門區(qū)域內(nèi)的正確定位。

2、ccr8選擇性地在2型輔助t(th2)細胞上表達，但在1型輔助t(th1)細胞上不表達。th2細胞在過敏原暴露部位發(fā)生的過敏性炎癥反應中發(fā)揮重要作用。ccr8的配體是cc趨化因子ccl1，它是th2細胞的趨化吸引因子。因此，ccr8/ccl1受體/配體對可能在哮喘、特應性皮炎和過敏性鼻炎等過敏性炎癥病癥的發(fā)展中發(fā)揮作用。該作用包括將th2細胞募集到過敏性炎癥部位、在這些部位產(chǎn)生th2細胞因子以及隨后動員嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞。

3、ccr8敲除小鼠在過敏性炎癥模型中表現(xiàn)出th2免疫反應受損。在卵清蛋白和蟑螂抗原誘導的過敏性肺部炎癥中，ccr8敲除小鼠肺部的th2細胞因子(il-4、il-5和il-13)水平和招募的嗜酸性粒細胞數(shù)量顯著降低。因此，抑制ccr8有助于改善哮喘、特應性皮炎和過敏性鼻炎等過敏性炎癥的癥狀。

4、ccr8還被確定為腫瘤浸潤性調(diào)節(jié)性t細胞(tregs)的標志物，因為在多種癌癥(包括乳腺癌、結(jié)直腸癌和肺癌)中，這些調(diào)節(jié)性t細胞中的ccr8表達選擇性上調(diào)。這些ccr8+調(diào)節(jié)性t細胞代表了高度激活和抑制的調(diào)節(jié)性t細胞亞群，在這些腫瘤類型中，ccr8+調(diào)節(jié)性t細胞的高豐度與不良預后相關(guān)。因此，ccr8是一個很有前景的治療靶點，可以消耗腫瘤中的調(diào)節(jié)性t細胞以增強抗腫瘤免疫力。

5、然而，趨化因子受體傳統(tǒng)上是非常難以開發(fā)抗體的抗原。它們在細胞表面的表達量很低，并且不太容易與抗體結(jié)合。此外，可能由于二級結(jié)構(gòu)的差異，針對與趨化因子受體胞外結(jié)構(gòu)域相對應的多肽生成的抗體往往無法識別細胞上完整的受體。

6、ccr8是一種對于抗體開發(fā)來說極具挑戰(zhàn)性的gpcr，過去在生成跨物種反應性抗體(食蟹猴和人類)方面取得的成功有限。此外，為包括ccr8在內(nèi)的gpcr尋找功能性抗體更具挑戰(zhàn)性。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本公開的各種實施方案中，提供了對人ccr8蛋白特異性的抗體和抗原結(jié)合片段。實驗測試表明，這些新鑒定的抗體可以與人ccr8蛋白強效、特異性結(jié)合，并且大多數(shù)可以與食蟹猴ccr8蛋白發(fā)生交叉反應，這與大多數(shù)基準抗體不同，使得在非人靈長類動物中證明臨床前安全性成為可能。此外，體外研究表明，大多數(shù)此類抗體可以特異性阻斷其配體ccl1誘導的ccr8信號傳導。此外，當具有完整或增強的fc功能的恒定區(qū)時，這些抗體可以誘導表達ccr8的靶細胞的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(antibody-dependent?cell-mediatedcytotoxicity，adcc)。體內(nèi)實驗表明，特別是具有增強的fc功能的恒定區(qū)的這些抗體可以有效抑制腫瘤生長。

2、根據(jù)本公開的一個實施方案，提供一種抗體或其抗原結(jié)合片段，其對人c-c基序趨化因子受體8(ccr8)蛋白具有特異性，并且包括含有vh?cdr1、vh?cdr2和vh?cdr3的重鏈可變區(qū)(vh)和含有vl?cdr1、vl?cdr2和vl?cdr3的輕鏈可變區(qū)(vl)。

3、在一個實施方案中，所述vh?cdr1包含如seq?id?no:61所示的氨基酸序列；所述vhcdr2包含如seq?id?no:62所示的氨基酸序列；所述vh?cdr3包含如seq?id?no:63或39所示的氨基酸序列；所述vl?cdr1包含如seq?id?no:64所示的氨基酸序列；所述vl?cdr2包含如seq?id?no:52所示的氨基酸序列；以及所述vl?cdr3包含如seq?id?no:57所示的氨基酸序列。

4、在另一個實施方案中，所述vh?cdr1包含如seq?id?no:22所示的氨基酸序列；所述vh?cdr2包含如seq?id?no:58所示的氨基酸序列；所述vh?cdr3包含如seq?id?no:35，36，37或38所示的氨基酸序列；所述vl?cdr1包含如seq?id?no:59所示的氨基酸序列；所述vlcdr2包含如seqid?no:49，50或51所示的氨基酸序列；以及所述vl?cdr3包含如seq?id?no:60所示的氨基酸序列。

5、在另一個實施方案中，所述vh?cdr1包含如seq?id?no:21所示的氨基酸序列；所述vh?cdr2包含如seq?id?no:25、65或66所示的氨基酸序列；所述vh?cdr3包含如seq?id?no:34所示的氨基酸序列；所述vl?cdr1包含如seq?id?no:43所示的氨基酸序列；所述vl?cdr2包含如seqid?no:48所示的氨基酸序列；所述vl?cdr3包含如seq?id?no:53所示的氨基酸序列。

6、在一些實施方案中，所述抗體或其片段是人源化的。在一些實施方案中，所述抗體或其片段包含具有增強的抗體依賴性細胞毒性(adcc)的fc片段。示例性fc片段是具有一個或多個根據(jù)eu編號選自由l234y、l235q、g236w、s239d/m、f243l、h268d、d270e、r292p、s298a、y300l、v305i、k326d、a330l/m、i332e、k334a/e、p396l組成的組的取代的人igg1片段。

7、還提供了多特異性抗體，其包含本公開的抗原結(jié)合片段和對非ccr8的靶抗原具有結(jié)合特異性的一種或多種抗體或抗原結(jié)合片段。

8、在另一個實施方案中，還提供了一種嵌合抗原受體(car)，其包含本公開的抗原結(jié)合片段、跨膜結(jié)構(gòu)域、共刺激結(jié)構(gòu)域和cd3胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。

9、還提供了多核苷酸，其編碼本公開的抗體或其抗原結(jié)合片段或car。在一些實施方案中，多核苷酸是mrna，其任選地經(jīng)過化學修飾。

10、還提供了用本公開的抗體或其抗原結(jié)合片段治療癌癥和炎癥的方法和應用。

技術(shù)特征：

1.一種抗體或其抗原結(jié)合片段，其對人c-c基序趨化因子受體8(ccr8)蛋白具有特異性，并且包括含有vh?cdr1、vh?cdr2和vh?cdr3的重鏈可變區(qū)(vh)和含有vl?cdr1、vl?cdr2和vl?cdr3的輕鏈可變區(qū)(vl)，其中：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中：

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中：

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述vh?cdr1、vh?cdr2、vhcdr3、vl?cdr1、vl?cdr2和vl?cdr3分別包含以下氨基酸序列：seq?id?no:23、31、39、46、52和57；seq?id?no:23、31、39、72、52和57；seq?id?no:23、31、39、73、52和57；seq?id?no:24、32、40、47、52和57；seq?id?no:24、32、40、74、52和57；seq?id?no:24、32、40、75、52和57；seqid?no:24、32、41、47、52和57；seq?id?no:24、32、41、74、52和57；seq?id?no:24、32、41、75、52和57；seq?id?no:24、33、42、46、52和57；seq?id?no:24、33、42、72、52和57；或seq?id?no:24、33、42、73、52和57。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中，所述vh?cdr1、vh?cdr2、vhcdr3、vl?cdr1、vl?cdr2和vl?cdr3分別包含seq?id?no:24、32、41、74、52和57所示的氨基酸序列。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中，所述vh包含選自由seq?id?no:76-79組成的組的氨基酸序列；所述vl包含選自由seq?id?no:92-95組成的組的氨基酸序列。

7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中，所述vh?cdr1、vh?cdr2、vhcdr3、vl?cdr1、vl?cdr2和vl?cdr3分別包含seq?id?no:24、32、41、47、52和57所示的氨基酸序列。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中，所述vh包含選自由seq?id?no:17和76-79組成的組的氨基酸序列；所述vl包含選自由seq?id?no:18和80-83組成的組的氨基酸序列。

9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中，所述vh?cdr1、vh?cdr2、vhcdr3、vl?cdr1、vl?cdr2和vl?cdr3分別包含seq?id?no:24、33、42、72、52和57所示的氨基酸序列。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中，所述vh包含選自由seq?idno:84-87組成的組的氨基酸序列；所述vl包含選自由seq?id?no:96-99組成的組的氨基酸序列。

11.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中，所述vh?cdr1、vh?cdr2、vhcdr3、vl?cdr1、vl?cdr2和vl?cdr3分別包含seq?id?no:24、33、42、46、52和57所示的氨基酸序列。

12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中，所述vh包含選自由seq?idno:19和84-87組成的組的氨基酸序列；所述vl包含選自由seq?id?no:20和88-91組成的組的氨基酸序列，優(yōu)選地，其中所述vh包含如seq?id?no:85所示的氨基酸序列，所述vl包含如seq?id?no:98所示的氨基酸序列。

13.根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中，所述vh包含如seq?id?no:13所示的氨基酸序列，所述vl包含如seq?id?no:14所示的氨基酸序列。

14.根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中，所述vh包含如seq?id?no:15所示的氨基酸序列，所述vl包含如seq?id?no:16所示的氨基酸序列。

15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中：(b)所述vh?cdr1包含如seqid?no:22所示的氨基酸序列；所述vh?cdr2包含如seq?id?no:58所示的氨基酸序列；所述vhcdr3包含如seq?id?no:35，36，37或38所示的氨基酸序列；所述vl?cdr1包含如seq?id?no:59所示的氨基酸序列；所述vl?cdr2包含如seq?id?no:49，50或51所示的氨基酸序列；以及所述vl?cdr3包含如seq?id?no:60所示的氨基酸序列。

16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述vh?cdr1、vh?cdr2、vhcdr3、vl?cdr1、vl?cdr2和vl?cdr3分別包含以下氨基酸序列：seq?id?no:22、26、35、44、49和54；seq?id?no:22、67、35、44、49和54；seq?id?no:22、27、36、45、50和55；seq?id?no:22、68、36、45、50和55；seq?id?no:22、28、37、44、49和54；seq?id?no:22、69、37、44、49和54；seqid?no:22、29、36、45、50和55；seq?id?no:22、70、36、45、50和55；seq?id?no:22、30、38、44、51和56；或seq?id?no:22、71、38、44、51和56。

17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述vh和vl分別包含以下氨基酸序列：seq?id?no:3和4；seq?id?no:5和6；seq?id?no:7和8；seq?id?no:9和10；或seqid?no:11和12。

18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中，所述vh?cdr1、vh?cdr2、vhcdr3、vl?cdr1、vl?cdr2和vl?cdr3分別包含以下氨基酸序列：seq?id?no:21、25、34、43、48和53；seq?id?no:21、65、34、43、48和53；或seq?id?no:21、66、34、43、48和53。

19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中，所述vh包含如seq?id?no:1所示的氨基酸序列，所述vl包含如seq?id?no:2所示的氨基酸序列。

20.根據(jù)權(quán)利要求1-19中任一項所述的抗體或其片段，其中，所述抗體或其片段為二價fab抗體，或選自f(ab')2、f(ab)2、fab'、fab、fv和scfv組成的組的片段。

21.根據(jù)權(quán)利要求1-20中任一項所述的抗體或其片段，其是人源化的。

22.根據(jù)權(quán)利要求1-21中任一項所述的抗體或其片段，其包含具有增強的抗體依賴性細胞毒性(adcc)的fc片段。

23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的抗體或其片段，其中所述fc片段是具有一個或多個根據(jù)eu編號的選自由l234y、l235q、g236w、s239d/m、f243l、h268d、d270e、r292p、s298a、y300l、v305i、k326d、a330l/m、i332e、k334a/e、p396l組成的組的取代的人igg1片段。

24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的抗體或其片段，其中所述igg1?fc片段：(a)包括s239d、a330l和i332e的取代；(b)包括s239d和i332e的取代；(c)為非巖藻糖基化的；或(d)在一條fc鏈中包括l234y、l235q、g236w、s239m、h268d、d270e和s298a中的一種或多種取代，在第二條fc鏈中包括d270e、k326d、a330m和k334e中的一種或多種取代。

25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的抗體或其片段，其中所述igg1?fc片段：(a)包括s239d、a330l和i332e的取代；(b)為非巖藻糖基化的；或(c)在一條fc鏈中包括l234y、l235q、g236w、s239m、h268d、d270e和s298a中的一種或多種取代，在第二條fc鏈中包括d270e、k326d、a330m和k334e中的一種或多種取代。

26.一種多特異性抗體，其包含如權(quán)利要求1-25中任一項所述的抗原結(jié)合片段以及對非ccr8的靶抗原具有結(jié)合特異性的一種或多種抗體或抗原結(jié)合片段。

27.一種嵌合抗原受體(car)，其包含如權(quán)利要求1-25中任一項所述的抗原結(jié)合片段、跨膜結(jié)構(gòu)域、共刺激結(jié)構(gòu)域和cd3ξ胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。

28.編碼如權(quán)利要求1-26中任一項所述的抗體或其抗原結(jié)合片段或如權(quán)利要求27所述的car的一種或多種多核苷酸。

29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的多核苷酸，其為一種或多種mrna。

30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的多核苷酸，其中所述mrna是化學修飾的。

31.一種細胞，其包含如權(quán)利要求28所述的多核苷酸。

32.一種組合物，其包含如權(quán)利要求1-26中任一項所述的抗體或其抗原結(jié)合片段或如權(quán)利要求27所述的car，以及藥學上可接受的載體。

33.一種治療有需要的患者的癌癥的方法，其包括向所述患者施用有效量的如權(quán)利要求1-26中任一項所述的抗體或其抗原結(jié)合片段或如權(quán)利要求27所述的car。

34.根據(jù)權(quán)利要求1-26中任一項所述的抗體或其抗原結(jié)合片段或根據(jù)權(quán)利要求27所述的car在制備治療癌癥的藥物中的應用。

35.一種治療有需要的患者的炎癥的方法，其包括向所述患者施用有效量的如權(quán)利要求1-26中任一項所述的抗體或其抗原結(jié)合片段。

36.如權(quán)利要求1-26中任一項的抗體或其抗原結(jié)合片段在制備治療炎癥的藥物中的應用。

37.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法或根據(jù)權(quán)利要求36所述的應用，其中所述炎癥選自由哮喘、特應性皮炎和過敏性鼻炎組成的組。

技術(shù)總結(jié)
本公開提供了抗CCR8抗體，包括鼠源抗體、人源化抗體以及具有進一步優(yōu)化的CDR序列的抗體。新公開的抗體具有很高的拮抗和ADCC活性，可用于治療癌癥和炎癥。

技術(shù)研發(fā)人員：楊園園,陳月華,蔣雯卿,崔菲菲,方磊
受保護的技術(shù)使用者：樂普創(chuàng)一生物科技（上海）有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/10