本發(fā)明涉及一種crrna及通過crispr-cas13a系統(tǒng)檢測(cè)惡性瘧原蟲的應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)。

背景技術(shù)：

1、

2、瘧原蟲紅內(nèi)期感染（血液階段）存在于所有病例中，并導(dǎo)致感染的癥狀和體征。因此，目前的診斷方法針對(duì)的是外周血中的瘧原蟲。傳統(tǒng)且成本最低的診斷方法是對(duì)厚薄血涂片進(jìn)行顯微鏡檢查。這種方法的敏感性和特異性取決于所使用的技術(shù)和鏡檢師的技能?；诿庖邔游隹乖瓩z測(cè)系統(tǒng)的快速診斷測(cè)試?(rdt)?已在許多診斷實(shí)驗(yàn)室中實(shí)施，但相較于基于核酸的檢測(cè)手段，該方法只能作為顯微鏡檢查的輔助手段。同時(shí)，在一些有條件的實(shí)驗(yàn)室，也可以使用基于pcr技術(shù)的診斷手段。然而，在非洲等實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)設(shè)施缺乏且專業(yè)性人才有限的地區(qū)，該類型技術(shù)無法普及。因此，亟需一種基于核酸的、高靈敏度、高準(zhǔn)確度、不依賴于實(shí)驗(yàn)設(shè)備的快速檢測(cè)手段。

3、近年來，crispr基因組編輯技術(shù)推進(jìn)了生物界的迅猛發(fā)展。2017年，研究人員發(fā)現(xiàn)了可用于核酸檢測(cè)的leptotrichiawadei?cas13a蛋白（lwcas13a），通過將其與重組聚合酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（reconbinase?polymerase?amplification，rpa）結(jié)合。該系統(tǒng)在實(shí)現(xiàn)等溫的同時(shí)，靈敏度提高了100萬倍，并建立了靈敏度達(dá)到單拷貝、特異性達(dá)到單堿基的高靈敏、高特異性核酸檢測(cè)方法sherlock（specific?high?sensitivity?enzymatic?reporterunlocking）。該系統(tǒng)已用于生物樣本中寨卡、登革熱以及新冠病毒等的檢測(cè)。

4、基于crispr-cas12a的detectr和基于crispr-cas13a的sherlock核酸檢測(cè)方法已經(jīng)開發(fā)出來。其中，rose?a.?lee等人的檢測(cè)方法基于crispr-cas12a，將樣本或者血清重懸在含有chelex-100的te緩沖液中95°c孵育10分鐘提取目的基因，再將所提取的目的基因加入到凍干的顆粒中，40°c孵育60分鐘，最后通過手持式熒光計(jì)或試紙條進(jìn)行瘧原蟲物種特異性檢測(cè)（lee?ra,?et?al.?proc?natl?acad?sci?u?s?a,?2020,?117(41):?25722-31）。

5、基于致死率最高的瘧原蟲種——惡性瘧原蟲對(duì)人類健康的威脅，以及現(xiàn)有技術(shù)在檢測(cè)惡性瘧原蟲方法中存在的缺乏靈敏度、準(zhǔn)確度、檢測(cè)手段過度依賴實(shí)驗(yàn)室設(shè)備的技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是基于crispr/cas13a系統(tǒng)，提供一種簡(jiǎn)便、快速檢測(cè)惡性瘧原蟲的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、基于上述目的，本發(fā)明首先提供了一種靶向惡性瘧原蟲特異基因位點(diǎn)的crrna，所述crrna對(duì)應(yīng)的dna序列由seq?id?no.4所示。

2、其次，本發(fā)明提供了一種上述crrna在crispr/cas13a系統(tǒng)中基于非診斷目的的檢測(cè)惡性瘧原蟲的應(yīng)用。crispr/cas13a系統(tǒng)是由cas13a核酸酶和crispr?rna（crrna）組成的復(fù)合物。當(dāng)與特定的crrna相結(jié)合時(shí)，cas13a可以在靶標(biāo)rna序列上特異性地切割，從而導(dǎo)致rna的降解和/或轉(zhuǎn)錄抑制。在rna的切割過程中，cas13a將自身激活，通過切割反向互補(bǔ)的rna來實(shí)現(xiàn)多個(gè)切割事件，使得cas13a可以在其靶標(biāo)rna附近產(chǎn)生強(qiáng)烈的rna干擾效應(yīng)。

3、在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述應(yīng)用包括在crispr/cas13a系統(tǒng)中檢測(cè)待測(cè)樣本中的核酸是否存在所述crrna靶向的惡性瘧原蟲特異基因位點(diǎn)。

4、在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述待測(cè)樣本為體液、血液、尿液、腦脊液、淋巴液、排泄物或者生物體活體組織。

5、在一個(gè)更為優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述應(yīng)用包括對(duì)待測(cè)樣本中的核酸進(jìn)行基因擴(kuò)增，并以獲得的基因擴(kuò)增物用于crispr/cas13a反應(yīng)。本領(lǐng)域的基因擴(kuò)增技術(shù)均可以應(yīng)用于本發(fā)明所述的應(yīng)用，pcr擴(kuò)增，等溫?cái)U(kuò)增，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（lamp）等，只要能提高樣本中的核酸含量即可。

6、更為優(yōu)選地，所述基因擴(kuò)增為重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（raa，recombinase-aidedamplification）。重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增是一種新型的基于等溫反應(yīng)的dna擴(kuò)增技術(shù)。它與pcr和lamp等dna擴(kuò)增技術(shù)相比，具有快速、高效、簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)。raa技術(shù)在擴(kuò)增過程中不需要特殊的溫度循環(huán)條件，而是在恒定的溫度下進(jìn)行反應(yīng)。

7、尤為優(yōu)選地，所述重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的上游引物的序列如seq?id?no.5所示，下游引物的序列如seq?id?no.6所示。

8、在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述cas13a為lwcas13a蛋白。

9、在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述應(yīng)用為消線法免疫層析，在所述crispr/cas13a反應(yīng)系統(tǒng)中還含有rna酶抑制劑和rna酶活性報(bào)告分子，所述rna酶活報(bào)告分子為一端標(biāo)記有生物素，一端標(biāo)記有熒光基團(tuán)fam的rna分子，其對(duì)應(yīng)的dna序列如seq?id?no.7所示。其中fam與膠體金標(biāo)記兔源抗fitc抗體結(jié)合，生物素與試紙條上的t線鏈霉親和素結(jié)合。

10、最后，本發(fā)明提供了一種上述crrna用于檢測(cè)待測(cè)樣本中惡性瘧原蟲18s?rrna基因的試劑盒，所述試劑盒還含有序列由seq?id?no.5所示的重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增上游引物和序列由seq?id?no.6所示的重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增下游引物、lwcas13a蛋白。

11、在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑盒為消線法免疫層析試劑盒，所述試劑盒還包括rna酶抑制劑和rna酶活性報(bào)告分子。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述rna酶活報(bào)告分子為一端標(biāo)記有生物素，一端標(biāo)記有熒光基團(tuán)fam的rna分子，其對(duì)應(yīng)的dna序列如seq?idno.7所示；其中，fam與膠體金標(biāo)記兔源抗fitc抗體結(jié)合，生物素與試紙條上的t線鏈霉親和素結(jié)合。

12、本發(fā)明提供的crrna分子以及crispr-cas13a系統(tǒng)通過快速裂解全血樣本或提取核酸，然后進(jìn)行raa?等溫?cái)U(kuò)增和crispr-cas13a?系統(tǒng)反應(yīng)，在資源有限的環(huán)境下使用“線消除”免疫層析試紙檢測(cè)（也稱為消線法）惡性瘧原蟲。使用該方法檢測(cè)了100份qpcr陽性的無癥狀感染者全血樣本，ct值在18~39之間，91%的檢測(cè)結(jié)果與qpcr結(jié)果一致。在核酸濃度稀釋至0.8?ng/ml時(shí)，仍可檢測(cè)到特異性基因（濃度108?am）。該方法每微升血液可檢出65只惡性瘧原蟲，低于?who?最新的瘧疾快速診斷測(cè)試性能報(bào)告中使用的每微升?200?個(gè)寄生蟲“低寄生蟲密度”測(cè)試閾值。有望在非洲等地推廣應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)及大規(guī)模社區(qū)篩查。本發(fā)明提供的crispr-cas13a系統(tǒng)也可檢測(cè)青蒿素耐藥株，并且與間日瘧原蟲沒有交叉反應(yīng)。

技術(shù)特征：

1.?一種靶向惡性瘧原蟲特異基因位點(diǎn)的crrna，其特征在于，所述crrna對(duì)應(yīng)的dna序列如seq?id?no.4所示。

2.權(quán)利要求1所述的crrna在crispr/cas13a系統(tǒng)中基于非診斷目的的檢測(cè)惡性瘧原蟲的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用包括在crispr/cas13a反應(yīng)系統(tǒng)中檢測(cè)待測(cè)樣本中核酸是否存在所述crrna靶向的惡性瘧原蟲特異基因位點(diǎn)。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述待測(cè)樣本為體液、血液、尿液、腦脊液、淋巴液、排泄物或者生物體活體組織。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用包括對(duì)待測(cè)樣本中的核酸進(jìn)行基因擴(kuò)增，并以獲得的基因擴(kuò)增物用于crispr/cas13a反應(yīng)。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述基因擴(kuò)增為重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增。

6.?根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的上游引物的序列如seq?id?no.5所示，下游引物的序列如seq?id?no.6所示。

7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述cas13a為lwcas13a蛋白。

8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用為消線法免疫層析，在所述crispr/cas13a反應(yīng)系統(tǒng)中，還含有rna酶活性報(bào)告分子，所述rna酶活報(bào)告分子為一端標(biāo)記有生物素，一端標(biāo)記有熒光基團(tuán)的rna分子,所述rna酶活報(bào)告分子對(duì)應(yīng)的dna序列如seq?idno.7所示。

9.?一種含有權(quán)利要求1所述crrna用于檢測(cè)待測(cè)樣本中惡性瘧原蟲18s?rrna基因的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還含有序列如seq?id?no.5所示的重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增上游引物和序列如seq?id?no.6所示的重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增下游引物、lwcas13a蛋白。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒為消線法免疫層析試劑盒，所述試劑盒還包括rna酶抑制劑和rna酶活性報(bào)告分子，所述rna酶活報(bào)告分子為一端標(biāo)記有生物素，一端標(biāo)記有熒光基團(tuán)的rna分子,所述rna酶活報(bào)告分子對(duì)應(yīng)的dna序列如seq?idno.7所示。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種靶向惡性瘧原蟲特異基因位點(diǎn)的crRNA，所述的crRNA在CRISPR/Cas13a系統(tǒng)中基于非診斷目的的檢測(cè)惡性瘧原蟲的應(yīng)用，以及含有所述crRNA用于檢測(cè)待測(cè)樣本中惡性瘧原蟲18S?rRNA基因的試劑盒。本發(fā)明提供的應(yīng)用通過快速裂解全血樣本或提取核酸，然后進(jìn)行RAA等溫?cái)U(kuò)增和CRISPR?Cas13a系統(tǒng)反應(yīng)，在核酸濃度稀釋至0.8?ng/ml時(shí)，仍可檢測(cè)到特異性基因，即65個(gè)瘧原蟲/微升（濃度108aM）。在資源有限的環(huán)境下使用“線消除”免疫層析試紙檢測(cè)惡性瘧原蟲，也可檢測(cè)青蒿素耐藥株，并且與間日瘧原蟲沒有交叉反應(yīng)。

技術(shù)研發(fā)人員：張夢(mèng)瑤,侯利華,吳詩坡,李浩,張金龍,宋小紅,鄭明浩
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國人民解放軍軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/10