本發(fā)明屬于生物工程，特別涉及到一種無(wú)載體共固定化苯丙氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶的制備方法及其在生產(chǎn)非天然氨基酸方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、苯丙氨酸脫氫酶(pdh)是一種氧化還原酶類(lèi)，其正反應(yīng)可在nad+存在的情況下催化l-苯丙氨酸氧化脫氨基生產(chǎn)苯丙酮酸、nadh和nh4+；逆反應(yīng)可催化苯丙酮酸、nadh和氨合成相應(yīng)的氨基酸。pdh這一催化特性使其已成為臨床檢測(cè)苯丙酮尿癥血液中苯丙氨酸含量的試劑用酶。此外，pdh還可通過(guò)還原胺化反應(yīng)合成非天然氨基酸，但在這些反應(yīng)過(guò)程中需要消耗大量昂貴的輔因子nadh。因此，利用甲酸脫氫酶(fdh)對(duì)pdh反應(yīng)消耗的nad+進(jìn)行回收利用，使反應(yīng)循環(huán)持續(xù)進(jìn)行。

2、然而，涉及到兩種或多種游離酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，由于其穩(wěn)定性差、生產(chǎn)效率低的缺點(diǎn)，在工業(yè)應(yīng)用中存在局限性。為了解決這些缺點(diǎn)，需要開(kāi)發(fā)一種多酶共固定化策略，以提高貯藏穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性和產(chǎn)量。

3、交聯(lián)酶聚集體(cross-linked?enzyme?aggregates，cleas)是一種無(wú)載體固定化技術(shù)，具有制備過(guò)程簡(jiǎn)單、對(duì)酶純度要求低、單位體積活性高、特異性好、適用范圍廣泛等優(yōu)點(diǎn)，尤其適用于多亞基酶的固定化。此外，還具有優(yōu)異的有機(jī)溶劑和高溫高壓耐受性，表現(xiàn)出良好的貯藏穩(wěn)定性和實(shí)際操作穩(wěn)定性。然而目前尚未有利用cleas技術(shù)-無(wú)載體固定化酶技術(shù)應(yīng)用于苯丙氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶固定化的研究。與單酶固定化相比，無(wú)載體共固定化酶提高輔酶nadh的使用效率，且可多次應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，降低了生產(chǎn)成本。因此，研究一種節(jié)約成本、操作簡(jiǎn)單、性能優(yōu)異且可實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的無(wú)載體固定化苯丙氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶是具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種無(wú)載體共固定化苯丙氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶的制備方法，來(lái)實(shí)現(xiàn)制備成本低、易于操作的固定化酶。

2、所述固定化苯丙氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶按照如下方法制備：

3、(1)培養(yǎng)能夠表達(dá)的苯丙氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶的重組菌株，離心收集細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞并超聲破碎，得到含有苯丙氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶的細(xì)胞破碎液；

4、(2)通過(guò)離心去除細(xì)胞碎片，收集上清液，得到含有苯丙氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶的粗酶液，加入磷酸鹽緩沖液稀釋酶液；

5、(3)向步驟(2)中得到的酶液中加入沉淀劑，進(jìn)行攪拌沉淀；

6、(4)向步驟(3)沉淀后的體系加入交聯(lián)劑，進(jìn)行攪拌交聯(lián)；

7、(5)將步驟(4)交聯(lián)后的溶液12000rpm離心10min除去上清，用磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行重復(fù)沖洗，沖洗直到洗滌液中檢測(cè)不到酶活，得到交聯(lián)苯丙氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶聚集體；

8、在發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述苯丙氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶的酶濃度均不低于20mg/ml；

9、在發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述苯丙氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶的體積比為0.7∶1.3、0.8∶1.2、0.9∶1.1、1∶1；

10、在發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述沉淀劑包括peg(10-50％)、硫酸銨(50-100％)；

11、在發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述沉淀是在3-6℃、轉(zhuǎn)速150-250rpm沉淀30-100min；

12、在發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述交聯(lián)劑為戊二醛(ga)，ga質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1-1.2％，交聯(lián)時(shí)間30-110min，轉(zhuǎn)速150-250rpm；

13、在發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述苯丙氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶粗酶液的制備方法包括：將可以表達(dá)苯丙氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶的bl21菌株接種到5ml?lb培養(yǎng)基中，于37℃、220rpm條件下培養(yǎng)12h，之后以2％的接種量將上述菌液轉(zhuǎn)移至250ml?lb培養(yǎng)基中，于37℃、220rpm條件下培養(yǎng)2h；之后加2.5ml升iptg(0.5mm)轉(zhuǎn)至16℃誘導(dǎo)20h；10000rpm離心10min收集菌體，去除上清后加入lysis(20mm的tris-hcl、0.5m的nacl、1mm的二硫蘇糖醇)重懸菌體，超聲破碎20min后10000rpm離心30min去掉破碎的菌體，得到含有苯丙氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶的酶液。

14、本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供上述無(wú)載體共固定化苯丙氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶在生產(chǎn)l-苯丙氨酸、苯丙酮酸和非天然氨基酸方面的應(yīng)用。

15、在發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述苯丙氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶的酶濃度均不低于20mg/ml；

16、在發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述苯丙氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶的體積比為0.7∶1.3、0.8∶1.2、0.9∶1.1、1∶1；

17、在發(fā)明的一種實(shí)施方式中，催化反應(yīng)時(shí)間10-60h，反應(yīng)溫度45-75℃，反應(yīng)ph?6-11。

18、本發(fā)明的有益效果：

19、本發(fā)明提供了一種pdh-fdh的共固定化交聯(lián)聚集體，具有成本低、易于操作、穩(wěn)定性高、轉(zhuǎn)化率高的優(yōu)點(diǎn)。固定化酶的溫度穩(wěn)定性和ph耐受性均具有顯著提高。以共固定化交聯(lián)酶聚集體作為催化劑進(jìn)行沙格列汀中間體((s)-3-羥基金剛烷基甘氨酸)的制備，產(chǎn)物得率均在90％以上；將固定化酶回收利用，重復(fù)使用5批次，酶活仍然保留初始酶活的50％以上，各批次產(chǎn)物得率均大于75％。本發(fā)明利用自身輔酶循環(huán)系統(tǒng)，無(wú)需外源輔酶添加，產(chǎn)品產(chǎn)率與純度高，在沙格列汀手性藥物中間體的工業(yè)化生產(chǎn)中具有極高的應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)特征：

1.一種無(wú)載體共固定化苯丙氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶，其特征在于，所述交聯(lián)苯丙氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶聚集體按照如下方法制備：

2.如權(quán)利要求1所述的無(wú)載體共固定化苯丙氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶的制備條件如下：

3.權(quán)利要求1所述的無(wú)載體共固定化苯丙氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶在生產(chǎn)非天然氨基酸方面的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)了一種無(wú)載體共固定苯丙氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶的制備方法和應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的具體方法包括以下內(nèi)容：以聚乙二醇為沉淀劑、戊二醛為交聯(lián)劑，通過(guò)無(wú)載體固定化?交聯(lián)酶聚集體法，實(shí)現(xiàn)苯丙氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶的固定化，之后利用固定化的苯丙氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶生產(chǎn)L?苯丙氨酸、沙格列汀中間體、苯丙酮酸。此法制備得到的交聯(lián)苯丙氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶聚集體的溫度穩(wěn)定性、pH耐受性和貯藏穩(wěn)定性均有提高。本發(fā)明提高了酶法制備沙格列汀中間體的效率，降低了生產(chǎn)成本和分離純化難度，適合大規(guī)模的連續(xù)化生產(chǎn)，對(duì)提高我國(guó)生產(chǎn)L?苯丙氨酸、沙格列汀中間體、苯丙酮酸的技術(shù)水平具有重大意義。

技術(shù)研發(fā)人員：劉夫鋒,陳銳派
受保護(hù)的技術(shù)使用者：天津科技大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/24