本發(fā)明涉及一種試劑盒，具體涉及基于crispr/cas12a結(jié)合萬能crrna進(jìn)行多種核酸檢測的試劑盒，屬于核酸檢測領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

1、核酸包括dna和rna，是遺傳信息的載體，可作為多種疾病，如癌癥以及病原體感染性疾病診斷的標(biāo)志物。核酸分子診斷具有靈敏度高、實(shí)時(shí)性好、操作簡便等優(yōu)勢，對癌癥以及病原體感染性疾病的早期篩查及診斷具有重要意義。目前常用核酸檢測方法主要包括基因測序法和核酸擴(kuò)增檢測法。

2、現(xiàn)有核酸檢測方法大多操作步驟復(fù)雜且依賴于昂貴的儀器設(shè)備，被譽(yù)為“基因魔剪”的crispr/cas系統(tǒng)在核酸檢測方面展現(xiàn)出巨大潛力和優(yōu)勢。規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列(clustered?regularly?interspaced?short?palindromic?repeats，crispr)是細(xì)菌中一種獲得性免疫系統(tǒng)，與cas蛋白組成crispr/cas系統(tǒng)。其中cas12a、cas13a和cas14a在特異性識別目標(biāo)分子后，激活了“反式切割”活性，會繼續(xù)非特異切割其他單鏈dna(ssdna)或rna。

3、crrna在環(huán)境中極其不穩(wěn)定且價(jià)格昂貴，傳統(tǒng)的crispr/cas系統(tǒng)中的額crrna是根據(jù)某一種病毒靶標(biāo)核酸而設(shè)計(jì)的，一種crrna只能檢測出一種病毒靶標(biāo)，面對不同病毒靶標(biāo)就需要設(shè)計(jì)不同的crrna，大大增加了檢測的難度和成本。而本發(fā)明克服了這一困難，使用同一種crrna，只需要將短鏈dna或rna靶標(biāo)結(jié)合到長track鏈上，在經(jīng)過一步擴(kuò)增后得到雙鏈dna。該擴(kuò)增的雙鏈dna區(qū)域包含萬能crrna的結(jié)合區(qū)，繼而被cas12a識別并切割reporter，產(chǎn)生信號，從而達(dá)到使用一種crrna檢測多種病毒靶標(biāo)的目的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明提供了基于crispr/cas12a結(jié)合萬能crrna進(jìn)行多種核酸檢測的試劑盒，利用cas12a的反式切割活性和一步等溫?cái)U(kuò)增達(dá)到使用一種crrna識別不同靶標(biāo)，進(jìn)而檢測多種病毒dna和rna的目的。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

3、基于crispr/cas12a結(jié)合萬能crrna進(jìn)行多種核酸檢測的試劑盒，以體系內(nèi)濃度計(jì)，包括0.5μl?20μm?crrna(500nm)、0.5μl?10μm?cas12a蛋白(250nm)、7.5μl緩沖液3.1、0.5μl?rna酶抑制劑，1μl10μm?reporter(500nm)、6.25μl緩沖液2，1μl?1μm?track鏈(100nm)，0.75μl?8000units/ml?bst?dna聚合酶(0.375units/μl)和1μl?10mm?dntp溶液(250μm)，其中，括號內(nèi)為檢測體系中的濃度。

4、在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還可以做如下改進(jìn)：

5、進(jìn)一步，所述crrna的序列為：uaa?uuu?cua?cuc?uug?uag?au?guaa?cua?gca?agaaua?cca?c。

6、進(jìn)一步，所述reporter的序列為：5’-texas?red-tgg?gat?atc?ttt?aat?ttt?atttta?aca?aga?tat?ccc?a-bhq2-3’。

7、進(jìn)一步，所述cas12a蛋白為cpf1核酸內(nèi)切酶。

8、進(jìn)一步，所述rna酶抑制劑為由大腸桿菌中純化的豬肝rna酶抑制劑得到的重組體。

9、進(jìn)一步，所述bst?dna聚合酶從大腸桿菌菌株中制備得到，所述大腸桿菌菌株含有缺乏5′→3′外切酶結(jié)構(gòu)的嗜酸乳桿菌dna聚合酶基因和編碼大腸桿菌麥芽糖結(jié)合蛋白(mbp)的基因的基因融合，融合蛋白被純化到接近均一，融合的mbp部分在體外被裂解掉，余下剩余的聚合酶被純化，不含mbp。

10、進(jìn)一步，所述的dntp溶液是超純datp、dctp、dgtp和dttp的等摩爾溶液。

11、本發(fā)明上述試劑盒的使用方法可參照如下：

12、將萬能crrna核酸檢測試劑中的track鏈、靶標(biāo)、緩沖液2加入至離心管中，從95℃降溫至25℃退火后形成二級結(jié)構(gòu)，0.75μl?8000units/ml?bst?dna聚合酶和1μl?10mm?dntp溶液，37℃反應(yīng)45min，隨后升溫至85℃滅活bst聚合酶后降至室溫。隨后加入0.5μl?20μmcrrna、0.5μl?10μmcas12a蛋白、7.5μl緩沖液3.1、0.5μl?rna酶抑制劑，1μl10μm?reporter，將所得混合物放入實(shí)時(shí)熒光pcr儀中，在47℃下反應(yīng)8000s，采集實(shí)時(shí)熒光信號。

13、本發(fā)明的有益效果在于：

14、1、本發(fā)明首次利用一種crrna對不同的dna或rna病毒進(jìn)行檢測，擴(kuò)大了crispr/cas核酸檢測范圍，適用于poct產(chǎn)品開發(fā)，克服了以往一種crrna只能檢測一種病毒核酸的現(xiàn)象，降低了成本，簡化了設(shè)計(jì)。

15、2、本發(fā)明的試劑盒可用于包括多種dna和rna病毒檢測中，具有良好的分析性能，以新冠病毒、hpv病毒核酸以及腫瘤mirna為例，最低能夠檢測到5pm。

16、3、本發(fā)明可以對hpv-16假病毒進(jìn)行有效檢測。

技術(shù)特征：

1.基于crispr/cas12a結(jié)合萬能crrna進(jìn)行多種核酸檢測的試劑盒，其特征在于，以體系內(nèi)濃度計(jì)，包括0.5μl20μmcrrna500nm、0.5μl10μmcas12a蛋白250nm、7.5μl緩沖液3.1、0.5μlrna酶抑制劑，1μl10μmreporter500nm、6.25μl緩沖液2，1μl1μmtrack鏈100nm，0.75μl8000units/mlbstdna聚合酶0.375units/μl和1μl10mmdntp溶液250μm。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述crrna的序列為：uaauuucuacucuuguagauguaacuagcaagaauaccac。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述reporter的序列為：5’-texasred-tgggatatctttaattttattttaacaagatatccc?a-bhq2-3’。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述cas12a蛋白為cpf1核酸內(nèi)切酶。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述rna酶抑制劑為由大腸桿菌中純化的豬肝rna酶抑制劑得到的重組體。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述bstdna聚合酶從大腸桿菌菌株中制備得到，所述大腸桿菌菌株含有缺乏5′→3′外切酶結(jié)構(gòu)的嗜酸乳桿菌dna聚合酶基因和編碼大腸桿菌麥芽糖結(jié)合蛋白(mbp)的基因的基因融合，融合蛋白被純化到接近均一，融合的mbp部分在體外被裂解掉，余下剩余的聚合酶被純化，不含mbp。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的dntp溶液是超純datp、dctp、dgtp和dttp的等摩爾溶液。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了基于CRISPR/Cas12a結(jié)合萬能crRNA進(jìn)行多種核酸檢測的試劑盒，屬于核酸檢測領(lǐng)域，包括：crRNA、Cas12a、緩沖液3.1、緩沖液2、RNA酶抑制劑、BstDNA聚合酶、dNTP混合液，本發(fā)明利用Cas12a反式切割活性，首次將單一類型的crRNA應(yīng)用于不同類型病毒的核酸檢測中，使用相同的crRNA，可以檢測多種病毒核酸，包括但不限于SARS?CoV?2、HPV病毒的多種亞型以及腫瘤標(biāo)志物miRNA等，拓寬了CRISPR/Cas核酸檢測的設(shè)計(jì)思路和方法，并具有良好的分析性能，在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，使用同一種crRNA，可以有效檢測多種DNA病毒和RNA病毒，并且具有較高靈敏度，可以檢測到濃度為5pM。以HPV?16假病毒為例，進(jìn)行實(shí)際樣品檢測。

技術(shù)研發(fā)人員：裴曉靜,劉思彤,徐麗,黃朝鶴,李姝靜,何一凡
受保護(hù)的技術(shù)使用者：北京工商大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19