本發(fā)明涉及生物，具體是涉及誘導(dǎo)痰單細(xì)胞懸液及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、誘導(dǎo)痰細(xì)胞學(xué)可以用于反映氣道炎癥類型，痰的檢查對支氣管哮喘、肺結(jié)核、支氣管炎、肺吸蟲病、肺部腫瘤等肺部疾病的診斷很有價值，對于指導(dǎo)氣道慢性炎癥疾病的臨床治療有較大價值。利用誘導(dǎo)痰細(xì)胞學(xué)分類，還可以判斷在臨床工作中藥物的療效。然而目前臨床誘導(dǎo)痰細(xì)胞學(xué)檢測以誘導(dǎo)痰細(xì)胞形態(tài)學(xué)為主，限制了對氣道炎癥細(xì)胞的進(jìn)步認(rèn)識，特別是炎癥細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)機(jī)制的進(jìn)一步研究。

2、目前，誘導(dǎo)痰細(xì)胞基因表達(dá)的檢測尚未有相關(guān)技術(shù)開發(fā)。

3、本發(fā)明通過開發(fā)誘導(dǎo)痰細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組方法學(xué)，有助于揭開誘導(dǎo)痰細(xì)胞基因表達(dá)，有助探究氣道炎癥發(fā)病機(jī)制及指導(dǎo)臨床治療。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、基于此，本發(fā)明的目的是提供一種誘導(dǎo)痰單細(xì)胞懸液及其制備方法和應(yīng)用，本發(fā)明所制備得到的誘導(dǎo)痰單細(xì)胞懸液能夠適用于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組方法學(xué)檢測。

2、實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案，包括如下。

3、本發(fā)明的第一目的，是提供一種誘導(dǎo)痰單細(xì)胞懸液制備方法，包括如下步驟：

4、1)獲得待檢測濾痰混懸液；

5、2)低溫離心；

6、3)樣本離心后去除上清液而不破壞細(xì)胞沉淀；

7、5)往細(xì)胞沉淀，加不含鈣、鎂離子的dpbs，輕輕地用移液管混合，反復(fù)倒置管使細(xì)胞球團(tuán)重新懸??；

8、6)過濾，用新的離心管收集濾過液；

9、7)對上步驟的收集的濾過液進(jìn)行低溫離心，去除上清液而不破壞細(xì)胞沉淀；

10、8)往上步驟細(xì)胞沉淀加適量不含鈣、鎂離子的dpbs(杜氏磷酸鹽緩沖鹽溶液)，輕輕地用移液管混合，輕輕吹吸10-15次或直到細(xì)胞完全懸??；

11、9)調(diào)整懸液體積以獲得目標(biāo)細(xì)胞濃度，即得單細(xì)胞懸液。

12、在其中一些實施例中，所述低溫離心的參數(shù)是：1200±10rpm，4℃，離心4-6min。

13、在其中一些實施例中，目標(biāo)細(xì)胞濃度為700～1200cells/ul。

14、在其中一些實施例中，步驟6)中，過濾所用的過濾網(wǎng)的孔徑為30±5um。

15、在其中一些實施例中，步驟6)中，使用過濾網(wǎng)時，應(yīng)先用1ml不含鈣、鎂離子的dpbs先潤濕過濾網(wǎng)，細(xì)胞懸液過濾完后，再往過濾網(wǎng)中加入500-1000ul的不含鈣、鎂離子的dpbs以盡量收集更多的濾過細(xì)胞。

16、本發(fā)明的第二目的，是提供通過任一上述方法制備得到的誘導(dǎo)痰單細(xì)胞懸液。

17、本發(fā)明的第三目的，是提供任一上述誘導(dǎo)痰單細(xì)胞懸液制備方法在誘導(dǎo)痰單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序方法中的應(yīng)用。

18、本發(fā)明的第四目的，是提供一種誘導(dǎo)痰單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序方法。

19、一種誘導(dǎo)痰單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序方法，包括以下步驟：

20、按照上述任一上述方法制備得到的誘導(dǎo)痰單細(xì)胞懸液，

21、進(jìn)行scrna-seq建庫和測序。

22、在其中一些實施例中，所述scrna-seq建庫和測序包括以下步驟：

23、a)gem生成和標(biāo)簽化；

24、對誘導(dǎo)痰單細(xì)胞懸液進(jìn)行單細(xì)胞分離，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實現(xiàn)標(biāo)簽化；

25、b)post?gem-rt純化和cdna擴(kuò)增；

26、c)文庫構(gòu)建和定量；

27、d)對構(gòu)建完成的文庫測序。

28、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明通過對誘導(dǎo)痰單細(xì)胞懸液進(jìn)行制備，能夠富集到大量的痰單細(xì)胞，使獲得的誘導(dǎo)痰單細(xì)胞懸液可用于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，從而可以很好地檢測痰細(xì)胞的基因表達(dá)情況，有助探究氣道炎癥發(fā)病機(jī)制及指導(dǎo)臨床治療，還可以用于支氣管哮喘、肺結(jié)核、支氣管炎、肺吸蟲病、肺部腫瘤等肺部疾病的診斷，具有巨大的臨床應(yīng)用價值。

技術(shù)特征：

1.一種誘導(dǎo)痰單細(xì)胞懸液的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述低溫離心的參數(shù)是：1200±10rpm，4℃，離心4-6min。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，目標(biāo)細(xì)胞濃度為700～1200cells/ul。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟6)中，過濾所用的過濾網(wǎng)的孔徑為30±5um。

5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的制備方法，其特征在于，步驟6)中，使用過濾網(wǎng)時，應(yīng)先用不含鈣、鎂離子的dpbs先潤濕過濾網(wǎng)，細(xì)胞懸液過濾完后，再往過濾網(wǎng)中加入500-1000ul的不含鈣、鎂離子的dpbs以盡量收集更多的濾過細(xì)胞。

6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述方法制備得到的誘導(dǎo)痰單細(xì)胞懸液。

7.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述誘導(dǎo)痰單細(xì)胞懸液的制備方法在誘導(dǎo)痰單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序方法中的應(yīng)用。

8.一種誘導(dǎo)痰單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序方法，其特征在于，包括以下步驟：

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的誘導(dǎo)痰單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序方法，其特征在于，所述scrna-seq建庫和測序包括以下步驟：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)痰單細(xì)胞懸液及其制備方法和應(yīng)用，所述制備方法包括如下步驟：獲得待檢測濾痰混懸液；低溫離心；樣本離心后去除上清液；往細(xì)胞沉淀，加不含鈣、鎂離子的DPBS，輕輕地用移液管混合，反復(fù)倒置管使細(xì)胞球團(tuán)重新懸浮；過濾，收集濾過液；對上步驟的收集的濾過液進(jìn)行低溫離心，去除上清液而不破壞細(xì)胞沉淀；往上步驟細(xì)胞沉淀加適量不含鈣、鎂離子的DPBS，輕輕地用移液管混合；調(diào)整懸液體積以獲得目標(biāo)細(xì)胞濃度，即得單細(xì)胞懸液。本發(fā)明通過對誘導(dǎo)痰單細(xì)胞懸液進(jìn)行制備，能夠富集到大量的痰單細(xì)胞，使獲得的誘導(dǎo)痰單細(xì)胞懸液可用于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，從而可以很好地檢測痰細(xì)胞的基因表達(dá)情況，有助探究氣道炎癥發(fā)病機(jī)制及指導(dǎo)臨床治療。

技術(shù)研發(fā)人員：賴克方,詹文志,羅煒
受保護(hù)的技術(shù)使用者：廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院（廣州呼吸中心）
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/10