本發(fā)明涉及制造寡核苷酸的方法。

背景技術(shù)：

1、在dna寡核苷酸、rna寡核苷酸等核酸的化學(xué)合成中，廣泛使用亞磷酰胺法。在亞磷酰胺法中，典型地，寡核苷酸是通過在合適的活化劑的存在下向核苷、核苷酸或寡核苷酸依次加成核苷亞磷酰胺而合成的。

2、在亞磷酰胺法中，通常核苷亞磷酰胺以相對于理論量為1.5～10.0倍的量使用。核苷亞磷酰胺在合成原料中也是昂貴的，因此如果能夠削減核苷亞磷酰胺的用量，則可期待生產(chǎn)成本的大幅削減。

3、然而，迄今為止尚未知有在削減核苷亞磷酰胺的用量的同時以良好的純度得到寡核苷酸的方法。

4、專利文獻(xiàn)1中，關(guān)于所使用的活化劑的量，記載了相對于核苷衍生物的量，1～20倍是適當(dāng)?shù)模瑑?yōu)選為1～10倍摩爾量，但沒有記載在抑制合成工序中的核苷亞磷酰胺的反應(yīng)容器內(nèi)殘留量、削減核苷亞磷酰胺的用量的同時以良好的純度得到寡核苷酸的方法。

5、現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

6、專利文獻(xiàn)

7、專利文獻(xiàn)1：國際公開第2006/022323號

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、發(fā)明所要解決的課題

2、本發(fā)明的目的在于，提供一種在制造寡核苷酸的方法中抑制核苷亞磷酰胺的反應(yīng)容器內(nèi)殘留量、削減核苷亞磷酰胺的用量的方法。

3、用于解決課題的手段

4、本發(fā)明者們對制造寡核苷酸的方法進(jìn)行了深入研究，其中發(fā)現(xiàn)，通過增加活化劑的用量，能夠抑制合成工序中的核苷亞磷酰胺的反應(yīng)容器內(nèi)殘留量，能夠削減核苷亞磷酰胺的用量。進(jìn)而基于該見解進(jìn)一步繼續(xù)研究，結(jié)果完成了本發(fā)明。

5、即，本發(fā)明涉及以下。

6、[1]一種制造寡核苷酸的方法，其包含在活化劑的存在下，使核苷亞磷酰胺與直接或間接負(fù)載于載體的核苷的3’位或5’位的羥基、巰基或氨基鍵合的工序，其中，所述工序中使用的所述活化劑的量為所述工序中使用的核苷亞磷酰胺的量的10.0～15.0倍當(dāng)量。

7、[2]根據(jù)[1]所述的方法，其中，所述工序中使用的所述活化劑的量為所述負(fù)載的核苷的10.0～25.0倍當(dāng)量。

8、[3]根據(jù)[1]或[2]所述的方法，其中，所述工序中使用的所述核苷亞磷酰胺的量為所述負(fù)載的核苷的1.0～2.0倍當(dāng)量。

9、[4]根據(jù)[1]～[3]中任一項(xiàng)所述的方法，其中，活化劑選自4,5-二氰基咪唑、5-(乙硫基)-1h-四唑、5-(芐硫基)-1h-四唑和鄰磺酰苯甲酰亞胺1-甲基咪唑。

10、[5]根據(jù)[1]～[4]中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述工序中的溶液的溫度為0～20℃。

11、發(fā)明效果

12、通過在制造寡核苷酸的方法中增加活化劑的用量，能夠抑制合成工序中的核苷亞磷酰胺的反應(yīng)容器內(nèi)殘留量，能夠在削減作為昂貴材料的核苷亞磷酰胺的用量的同時，以良好的純度得到寡核苷酸。另外，通過使寡核苷酸的制造中的各工序中的溶液的溫度為低溫，也能夠抑制核苷亞磷酰胺的反應(yīng)容器內(nèi)殘留量，也能夠在削減作為昂貴材料的核苷亞磷酰胺的用量的同時，以良好的純度得到寡核苷酸。

13、雖然不希望被特定的理論約束，但認(rèn)為核苷亞磷酰胺在反應(yīng)容器內(nèi)的殘留是由于核苷亞磷酰胺在偶聯(lián)工序中與通過寡核苷酸的磷酸部位的2-氰基乙基(cnet)保護(hù)基非期望地脫離而形成的羥基鍵合而發(fā)生的，變得無法參與鏈長伸長反應(yīng)(與直接或間接負(fù)載于載體的核苷的5’或3’末端羥基的反應(yīng))，其結(jié)果通過增加活化劑的用量，核苷亞磷酰胺與由于cnet保護(hù)基的脫離而形成的寡核苷酸的羥基的鍵合得到抑制，反應(yīng)容器內(nèi)所消耗的核苷亞磷酰胺量減少，實(shí)現(xiàn)了核苷亞磷酰胺的用量削減。另外，認(rèn)為通過使溶液的溫度為低溫，寡核苷酸的磷酸部位的cnet保護(hù)基的脫離得到抑制，通過與由于cnet保護(hù)基的脫離而形成的寡核苷酸的羥基鍵合而消耗的核苷亞磷酰胺量減少，實(shí)現(xiàn)了核苷亞磷酰胺的用量削減。

技術(shù)特征：

1.一種制造寡核苷酸的方法，其包含在活化劑的存在下，使核苷亞磷酰胺與直接或間接負(fù)載于載體的核苷的3’位或5’位的羥基、巰基或氨基鍵合的工序，

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述工序中使用的所述活化劑的量為所述負(fù)載的核苷的10.0～25.0倍當(dāng)量。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述工序中使用的所述核苷亞磷酰胺的量為所述負(fù)載的核苷的1.0～2.0倍當(dāng)量。

4.根據(jù)權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，活化劑選自4,5-二氰基咪唑、5-(乙硫基)-1h-四唑、5-(芐硫基)-1h-四唑和鄰磺酰苯甲酰亞胺1-甲基咪唑。

5.根據(jù)權(quán)利要求1～4中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述工序中的溶液的溫度為0～20℃。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明的目的在于提供一種在制造寡核苷酸的方法中抑制合成工序中的核苷亞磷酰胺的反應(yīng)容器內(nèi)殘留量、削減核苷亞磷酰胺的用量的方法。一種制造寡核苷酸的方法，其包含在活化劑的存在下，使核苷亞磷酰胺與直接或間接負(fù)載于載體的核苷的3’位或5’位的羥基、巰基或氨基鍵合的工序，其中，所述工序中使用的所述活化劑的量為所述工序中使用的核苷亞磷酰胺的量的10.0～15.0倍當(dāng)量。通過所述方法等，解決了上述課題。

技術(shù)研發(fā)人員：吉田敬,飯?zhí)镏窍?巖本正史,前田惠里,松並淳
受保護(hù)的技術(shù)使用者：日東電工株式會社
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/9/17