本申請(qǐng)涉及單克隆聚簇的方法。

背景技術(shù)：

1、由于非優(yōu)勢(shì)模板鏈與來(lái)自該簇的初級(jí)模板群體的信號(hào)的干擾，多克隆群集受到噪聲增加和信號(hào)降低的影響。所產(chǎn)生的信號(hào)降低和噪聲增加最終導(dǎo)致降低的堿基識(shí)別特性，即使在應(yīng)用純度濾波之后。產(chǎn)生更高比例的單克隆簇的能力受到典型接種方法的泊松性質(zhì)的阻礙。另外，非優(yōu)勢(shì)鏈在最終讀出中丟失，使得測(cè)序過(guò)程在讀出流通池上的可用dna時(shí)效率低下。如果以低密度進(jìn)行接種以提高被占據(jù)的單克隆簇的百分比，則總占據(jù)百分比降低，從而降低通量。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本文提供的實(shí)施例涉及用于通過(guò)將雙鏈dna(dsdna)接種到流通池上而擴(kuò)增靶核酸的方法和組合物。在一些實(shí)施例中，流通池包括蛋白質(zhì)，并且dsdna連接至與蛋白質(zhì)相互作用的配體。在一些實(shí)施例中，流通池包括固定在流通池上的多個(gè)草坪(lawn)引物。

2、本文的一些實(shí)施例提供了擴(kuò)增靶核酸的方法，所述方法包括將雙鏈dna(dsdna)接種到流通池上，所述流通池包括含有蛋白質(zhì)的第一部分和含有固定在流通池上的多個(gè)草坪引物的第二部分，其中所述dsdna包括靶核酸序列和互補(bǔ)核酸序列，并且其中所述dsdna與配體連接，所述配體引起配體和蛋白質(zhì)之間的相互作用；在配體與蛋白質(zhì)相互作用后，使dsdna變性以除去互補(bǔ)核酸序列；使用所述草坪引物擴(kuò)增所述靶核酸序列。

3、在一些實(shí)施例中，所述多種草坪引物在一端用正電荷加帽。在一些實(shí)施例中，正電荷導(dǎo)致dsdna向流通池的含有蛋白質(zhì)的第一部分?jǐn)U散。

4、在一些實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括在配體與蛋白質(zhì)之間的相互作用之后從草坪引物去除正電荷。

5、在一些實(shí)施例中，通過(guò)裂解除去正電荷。在一些實(shí)施例中，通過(guò)熔融去除正電荷。

6、在一些實(shí)施例中，所述蛋白質(zhì)是鏈霉親和素，所述配體是生物素。

7、在一些實(shí)施例中，所述草坪引物包括p5草坪引物。在一些實(shí)施例中，所述草坪引物包括p7草坪引物。在一些實(shí)施例中，所述草坪引物包括p5和p7草坪引物。

8、在一些實(shí)施例中，所述流通池在其表面上不包括任何孔。在一些實(shí)施例中，所述流通池在其表面上包括孔。在一些實(shí)施例中，所述孔包括大孔內(nèi)的小孔。

9、在一些實(shí)施例中，將dsdna接種到流通池上抑制了流通池上的其它的接種事件。

10、在一些實(shí)施例中，所述流通池的第一部分是圓形的。在一些實(shí)施例中，所述流通池的第一部分包括在80nm和100nm之間的直徑。在一些實(shí)施例中，所述流通池的第一部分是圓形墊。

11、本文的一些實(shí)施例提供了將雙鏈dna(dsdna)接種到流通池上的方法，所述方法包括將dsdna接種到流通池上，所述流通池上包括第一部分和第二部分，所述第一部分包括第一生物分子，所述第二部分包括固定在流通池上的多個(gè)草坪引物，其中所述dsdna包括靶核酸序列，并且其中所述dsdna與第二生物分子連接，導(dǎo)致所述第二生物分子和所述第一生物分子之間的相互作用。

12、在一些實(shí)施例中，所述第一生物分子和所述第二生物分子通過(guò)共價(jià)相互作用相互作用。在一些實(shí)施例中，所述第一生物分子和所述第二生物分子通過(guò)非共價(jià)相互作用相互作用。在一些實(shí)施例中，非共價(jià)相互作用包括蛋白質(zhì)-配體相互作用。在一些實(shí)施例中，蛋白質(zhì)-配體相互作用包括鏈霉親和素-生物素相互作用。

13、本文中的一些實(shí)施例提供了一種流通池，所述流通池包括表面，所述表面包括第一部分，所述第一部分包括墊，所述墊包括蛋白質(zhì)；和第二部分，所述第二部分包括p5草坪引物和p7草坪引物中的至少一種。

14、在一些實(shí)施例中，所述第二部分包括p5和p7草坪引物。

15、在一些實(shí)施例中，p5草坪引物和p7草坪引物中的至少一種用正電荷加帽。

16、在一些實(shí)施例中，所述表面包括圖案化表面。在一些實(shí)施例中，所述圖案化表面包括至少一個(gè)孔。在一些實(shí)施例中，所述至少一個(gè)孔包括包含在至少一個(gè)大孔內(nèi)的至少一個(gè)孔。

17、在一些實(shí)施例中，所述圖案化表面包括凝膠。在一些實(shí)施例中，所述凝膠包括聚(n-(5-疊氮乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)(pazam)。

18、本文的一些實(shí)施例提供了一種流通池，其包括涂覆有引物的表面，所述引物被正電荷加帽；和包含蛋白質(zhì)的墊，其中所述墊具有比用正電荷加帽的引物更高的對(duì)dsdna的結(jié)合能。

19、在一些實(shí)施例中，正電荷在流通池的表面處產(chǎn)生較低的能態(tài)。

20、在一些實(shí)施例中，所述蛋白質(zhì)包括鏈霉親和素。

21、在一些實(shí)施例中，正電荷是可裂解的，使得它可以從引物中除去。

22、應(yīng)理解，如本文中所描述的本公開(kāi)的方面中的每一者的任何相應(yīng)特征/示例可以任何適當(dāng)組合一起實(shí)施，并且來(lái)自這些方面中的任一者或多者的任何特征/示例可以與如本文中所描述的其他(多個(gè))方面的特征中的任一者以任何適當(dāng)組合一起實(shí)施，以實(shí)現(xiàn)如本文中所描述的益處。

1.一種擴(kuò)增靶核酸序列的方法，所述方法包括：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多種草坪引物的一端被正電荷加帽。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述正電荷導(dǎo)致dsdna向包含所述蛋白質(zhì)的流通池的第一部分?jǐn)U散。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，還包括在所述配體與所述蛋白質(zhì)相互作用后，從所述草坪引物除去所述正電荷。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中通過(guò)裂解除去正電荷。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中通過(guò)熔融除去正電荷。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)是鏈霉親和素，并且其中所述配體是生物素。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述草坪引物包括p5草坪引物。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述草坪引物包括p7草坪引物。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述草坪引物包括p5和p7草坪引物。

11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述流通池在其表面上不包括任何孔。

12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述流通池在其表面上包括孔。

13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述孔包括在大孔內(nèi)的小孔。

14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中將所述dsdna接種到所述流通池上抑制了流通池上的其它接種事件。

15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述流通池的所述第一部分是圓形的。

16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述流通池的所述第一部分包括在80nm和100nm之間的直徑。

17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述流通池的所述第一部分是圓形墊。

18.一種將雙鏈dna(dsdna)接種到流通池上的方法，所述方法包括：

19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述第一生物分子和所述第二生物分子通過(guò)共價(jià)相互作用而相互作用。

20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述第一生物分子和所述第二生物分子通過(guò)非共價(jià)相互作用而相互作用。

21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述非共價(jià)相互作用包括蛋白質(zhì)-配體相互作用。

22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)-配體相互作用包括鏈霉親和素-生物素相互作用。

23.一種流通池，所述流通池包括：

24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的流通池，其中所述第二部分包含p5和p7草坪引物兩者。

25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的流通池，其中p5草坪引物和p7草坪引物中的至少一個(gè)被正電荷加帽。

26.根據(jù)權(quán)利要求23所述的流通池，其中所述表面包括圖案化表面。

27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的流通池，其中所述圖案化表面包括至少一個(gè)孔。

28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的流通池，其中所述至少一個(gè)孔包括包含在至少一個(gè)大孔內(nèi)的至少一個(gè)小孔。

29.根據(jù)權(quán)利要求26所述的流通池，其中所述圖案化表面包括凝膠。

30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的流通池，其中所述凝膠包括聚(n-(5-疊氮乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)(pazam)。

31.一種流通池，所述流通池包括：

32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的流通池，其中所述正電荷在所述流通池的所述表面處產(chǎn)生較低的能態(tài)。

33.根據(jù)權(quán)利要求31所述的流通池，其中所述蛋白質(zhì)包括鏈霉親和素。

34.根據(jù)權(quán)利要求31所述的流通池，其中所述正電荷是可裂解的，使得它可以從所述引物中被去除。