本發(fā)明涉及嵌合aav衣殼、包含所述嵌合aav衣殼的病毒載體，以及使用所述載體諸如靶向神經(jīng)系統(tǒng)的方法。本發(fā)明進一步涉及對神經(jīng)細胞(例如，中樞和/或外周神經(jīng)系統(tǒng)的細胞)具有改善的感染性的嵌合aav衣殼、包含所述嵌合aav衣殼的病毒載體，以及使用所述載體以改善的感染性靶向神經(jīng)細胞的方法。

背景技術：

1、腺相關病毒(aav)是用于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)疾病的候選物，特別是aav血清型9具有cns親和力并有效地在cns中遞送基因。然而，在人類群體中，33.5％的患者具有預先存在的針對aav9的中和抗體(抗aav9)(boutin等2010hum?gene?ther.21(6):704-712)，這限制了aav9療法在臨床中的應用，因為預先存在的nab可阻止aav載體轉導并且通常導致所提出的基因療法方案失敗(erles等1999j?med?virol?59(3):406-411；li等2012genether.1993):288-94；louis?jeune等2013hum?gene?ther?methods24(2):59-67；murphy等2008mol?ther?16(1):138-145)。因此，需要尋找新的aav載體以有效地感染神經(jīng)元細胞。

2、本發(fā)明通過提供對神經(jīng)元細胞具有改善的感染性的經(jīng)修飾的嵌合aav衣殼來克服本領域中的缺點。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的一個方面包含第一血清型的嵌合腺相關病毒(aav)衣殼，其包含所述第一血清型的vp1衣殼蛋白、vp2衣殼蛋白和vp3衣殼蛋白，其中：a)所述vp1衣殼蛋白和/或所述vp2衣殼蛋白包含在氨基酸位置24、41、125、129、135、147、159、162、164、168、194、196、197、198、200、201、203、205、224、233和/或235處的一個或多個取代，并且b)所述vp3衣殼蛋白包含vp3可變區(qū)(vr)中的一個或多個氨基酸取代；其中編號對應于seq?id?no:16，并且其中與所述第一血清型的對應野生型aav衣殼的神經(jīng)向性相比，所述嵌合aav衣殼具有增強的神經(jīng)向性。

2、在一些實施方案中，vp3?vr中的一個或多個氨基酸取代可在vp3?vr-i、vr-ii、vr-iii、vr-iv、vr-v、vr-vi、vr-vii、vr-viii、hi環(huán)和/或vr-ix中。

3、在一些實施方案中，嵌合aav載體可與選自由以下組成的組的化合物共價連接、結合或將其衣殼化：dna分子(例如，cas9-質粒)、rna分子(例如，crispr?rna)、多肽、碳水化合物、脂質、小有機分子和它們的任何組合(例如，crispr?rnp)。

4、本發(fā)明的另一方面提供了aav顆粒，其包含：本發(fā)明的嵌合aav衣殼；和aav載體基因組；其中所述aav衣殼將所述aav載體基因組衣殼化。

5、在另一方面，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明的嵌合aav衣殼的核酸分子。

6、在另一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的核酸分子的載體。

7、在另一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的嵌合顆粒、核酸分子和/或載體的細胞(例如，體外細胞)。

8、還提供了藥物制劑，其包含在藥學上可接受的載劑中的本發(fā)明的aav顆粒、核酸分子和/或載體。

9、本發(fā)明的另一方面包含產(chǎn)生包含aav衣殼的重組aav顆粒的方法，所述方法包括：在可發(fā)生包含所述aav衣殼并將包含異源核酸分子的aav載體基因組衣殼化的所述重組aav顆粒的組裝的條件下，在體外向細胞提供/引入本發(fā)明的核酸分子、aav?rep編碼序列、所述aav載體基因組和用于生成生產(chǎn)性aav感染的輔助功能物(helper?function)。

10、還提供了通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的aav顆粒。

11、本發(fā)明的另一方面提供了將核酸分子遞送到神經(jīng)細胞(例如，包括外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細胞，例如，腦細胞，諸如神經(jīng)元、少突膠質細胞、神經(jīng)膠質細胞、小膠質細胞、星形膠質細胞，例如，脊髓，諸如頸、胸、腰、骶神經(jīng)元和/或背根神經(jīng)節(jié)(drg))的方法，所述方法包括使所述神經(jīng)細胞與本發(fā)明的aav顆粒、核酸分子、載體、細胞和/或藥物配制劑接觸。

12、本發(fā)明的另一方面提供了將核酸分子遞送到哺乳動物受試者的神經(jīng)細胞的方法，所述方法包括：施用有效量的本發(fā)明的aav顆粒、核酸分子、載體、細胞和/或藥物配制劑，由此將所述核酸分子遞送到所述哺乳動物受試者的神經(jīng)細胞。

13、本發(fā)明的另一方面提供了治療有需要的哺乳動物受試者的病癥(例如，cns病癥，例如，pns病癥)的方法，其中所述病癥可通過在所述受試者的神經(jīng)系統(tǒng)中表達編碼治療性產(chǎn)物的核酸分子來治療，所述方法包括在使編碼所述治療性產(chǎn)物的所述核酸分子在所述神經(jīng)系統(tǒng)中表達的條件下，向所述哺乳動物受試者施用治療有效量的本發(fā)明的aav顆粒、核酸、載體、細胞和/或藥物配制劑，由此治療所述病癥。

技術特征：

1.一種第一血清型的嵌合腺相關病毒(aav)衣殼，其包含所述第一血清型的vp1衣殼蛋白、vp2衣殼蛋白和vp3衣殼蛋白，其中：

2.根據(jù)權利要求1所述的嵌合aav衣殼，其中所述vp3?vr中的所述一個或多個氨基酸取代在vp3?vr-i、vr-ii、vr-iii、vr-iv、vr-v、vr-vi、vr-vii、vr-viii、hi環(huán)和/或vr-ix中。

3.根據(jù)權利要求1或2所述的嵌合aav衣殼，其中所述vp3?vr中的所述一個或多個氨基酸取代在vr-i中的氨基酸位置263、264、265、267和/或268處。

4.根據(jù)權利要求1-3中任一項所述的嵌合aav衣殼，其中所述vp3vr中的所述一個或多個氨基酸取代在vr-viii中的氨基酸位置584和/或598處。

5.根據(jù)權利要求1-4中任一項所述的嵌合aav衣殼，其中所述vp3vr中的所述一個或多個氨基酸取代在vr-ix中的氨基酸位置714處。

6.根據(jù)權利要求1-5中任一項所述的嵌合aav衣殼，其進一步包含所述vp3衣殼蛋白中在vr外部的一個或多個取代。

7.根據(jù)權利要求6所述的嵌合aav衣殼，其中所述vp3衣殼蛋白中在vr外部的所述一個或多個氨基酸取代包含在位置272、311、313、640、642、646和/或722處的氨基酸取代。

8.根據(jù)權利要求1-7中任一項所述的嵌合aav衣殼，其中與對應野生型aav衣殼的神經(jīng)向性相比，所述增強的神經(jīng)向性增強約5.0倍或更高。

9.根據(jù)權利要求1-8中任一項所述的嵌合aav衣殼，其與選自由以下組成的組的化合物共價連接、結合或將其衣殼化：dna分子(例如，cas9-質粒)、rna分子(例如，crispr?rna)、多肽、碳水化合物、脂質、小有機分子和它們的任何組合(例如，crispr?rnp)。

10.根據(jù)權利要求1-9中任一項所述的嵌合aav衣殼，其中所述第一aav血清型是aav1、aav2、aav3、aav4、aav6、aav7、aav8和/或aav9。

11.根據(jù)權利要求1-10中任一項所述的嵌合aav衣殼，其中所述第一aav血清型是aav6。

12.根據(jù)權利要求1-11中任一項所述的嵌合aav衣殼，其包含：

13.根據(jù)權利要求12所述的嵌合aav衣殼，

14.根據(jù)權利要求13所述的嵌合aav衣殼，

15.根據(jù)權利要求12-14中任一項所述的嵌合aav衣殼，其包含與seq?id?no:1(aavh43)的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列，基本上由其組成或由其組成。

16.根據(jù)權利要求1-11中任一項所述的嵌合aav衣殼，其包含：

17.根據(jù)權利要求16所述的嵌合aav衣殼，

18.根據(jù)權利要求17所述的嵌合aav衣殼，

19.根據(jù)權利要求16-18中任一項所述的嵌合aav衣殼，其包含與seq?id?no:6(aavh48)的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列，基本上由其組成或由其組成。

20.根據(jù)權利要求1-11中任一項所述的嵌合aav衣殼，其包含：

21.根據(jù)權利要求20所述的嵌合aav衣殼，

22.根據(jù)權利要求21所述的嵌合aav衣殼，

23.根據(jù)權利要求20-22中任一項所述的嵌合aav衣殼，其包含與seq?id?no:11(aavh67)的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列，基本上由其組成或由其組成。

24.一種aav顆粒，其包含：

25.根據(jù)權利要求24所述的aav顆粒，其中所述aav載體基因組包含異源核酸分子。

26.根據(jù)權利要求25所述的aav顆粒，其中所述異源核酸分子編碼crispr?rna、crisprrnp、反義rna、微rna或rnai。

27.根據(jù)權利要求25所述的aav顆粒，其中所述異源核酸分子編碼多肽。

28.根據(jù)權利要求25所述的aav顆粒，其中所述異源核酸分子編碼治療性多肽。

29.一種核酸分子，其編碼根據(jù)權利要求1-23中任一項所述的嵌合aav衣殼。

30.一種載體，其包含根據(jù)權利要求29所述的核酸分子。

31.根據(jù)權利要求30所述的載體，其中所述載體是質粒、噬菌體、病毒載體、細菌人工染色體或酵母人工染色體。

32.根據(jù)權利要求31所述的載體，其中所述病毒載體是aav載體、腺病毒載體、皰疹病毒載體、慢病毒載體、甲病毒載體或桿狀病毒載體(例如，aav顆粒、腺病毒顆粒、皰疹病毒顆粒、慢病毒顆粒、甲病毒顆粒、桿狀病毒顆粒等)。

33.根據(jù)權利要求32所述的aav載體，其中所述核酸分子進一步包含aav?rep編碼序列。

34.一種細胞(例如，體外細胞)，其包含根據(jù)權利要求1-23中任一項所述的嵌合aav衣殼、根據(jù)權利要求24-28中任一項所述的顆粒、根據(jù)權利要求29所述的核酸分子或根據(jù)權利要求30-33中任一項所述的載體。

35.根據(jù)權利要求34所述的細胞，其中所述核酸分子穩(wěn)定地摻入所述細胞的基因組中。

36.一種產(chǎn)生包含aav衣殼的重組aav顆粒的方法，所述方法包括：

37.一種aav顆粒，其通過根據(jù)權利要求36所述的方法產(chǎn)生。

38.一種藥物配制劑，其包含在藥學上可接受的載劑中的根據(jù)權利要求24-28或37中任一項所述的aav顆粒、根據(jù)權利要求29所述的核酸、根據(jù)權利要求30-33中任一項所述的載體和/或根據(jù)權利要求34或35所述的細胞。

39.一種將核酸分子遞送到神經(jīng)細胞(例如，包括外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細胞，例如，腦細胞，諸如神經(jīng)元、少突膠質細胞、神經(jīng)膠質細胞、小膠質細胞、星形膠質細胞，例如，脊髓，諸如頸、胸、腰、骶神經(jīng)元和/或背根神經(jīng)節(jié)(drg)神經(jīng)元)的方法，所述方法包括使所述神經(jīng)細胞與根據(jù)權利要求24-28或37中任一項所述的aav顆粒、根據(jù)權利要求29所述的核酸、根據(jù)權利要求30-33中任一項所述的載體、根據(jù)權利要求34或35所述的細胞和/或根據(jù)權利要求38所述的藥物配制劑接觸。

40.一種將核酸分子遞送到哺乳動物受試者的神經(jīng)細胞的方法，所述方法包括：

41.一種治療有需要的哺乳動物受試者的病癥(例如，cns病癥，例如，pns病癥)的方法，其中通過在所述受試者的神經(jīng)系統(tǒng)中表達編碼治療性產(chǎn)物的核酸分子能治療所述病癥，所述方法包括在使編碼所述治療性產(chǎn)物的所述核酸分子在所述神經(jīng)系統(tǒng)中表達的條件下，向所述哺乳動物受試者施用治療有效量的根據(jù)權利要求24-28或37中任一項所述的aav顆粒、根據(jù)權利要求29所述的核酸、根據(jù)權利要求30-33中任一項所述的載體、根據(jù)權利要求34或35所述的細胞和/或根據(jù)權利要求38所述的藥物配制劑，由此治療所述病癥。

42.根據(jù)權利要求41所述的方法，其中所述病癥是帕金森氏病、亨廷頓氏病、雷特綜合征、肌萎縮側索硬化(als)、多發(fā)性硬化(ms)、癲癇、阿爾茨海默氏病(gdf；腦啡肽酶)、巴滕病(蠟樣質脂褐質沉積癥神經(jīng)元蛋白[cln]1-10)、弗里德希氏共濟失調(frda、弗里共濟失調蛋白基因[fxn])、腦創(chuàng)傷、脊髓損傷(sci)、缺血性和缺氧性cns疾病、腦和脊髓腫瘤，或它們的任何組合。

43.根據(jù)權利要求40-42中任一項所述的方法，其中所述哺乳動物受試者是人受試者。

44.根據(jù)權利要求40-43中任一項所述的方法，其中將所述aav顆粒遞送或施用到所述神經(jīng)系統(tǒng)。

45.根據(jù)權利要求40-44中任一項所述的方法，其中將所述aav顆粒遞送或施用到所述受試者的灰質。

46.根據(jù)權利要求40-45中任一項所述的方法，其中將所述aav顆粒遞送或施用到脊髓(例如，頸、胸、腰和/或骶脊髓區(qū)域)。

47.根據(jù)權利要求40-46中任一項所述的方法，其中將所述aav顆粒通過鞘內(nèi)、大腦內(nèi)、實質內(nèi)、腦室內(nèi)、鼻內(nèi)、耳內(nèi)、眼內(nèi)或眼周遞送、靜脈內(nèi)遞送(iv)或它們的任何組合遞送或施用到所述受試者。

48.根據(jù)權利要求40-47中任一項所述的方法，其中所述哺乳動物受試者先前已經(jīng)接受了用血清型不是對應野生型第一aav血清型的血清型的aav顆粒進行的基因療法治療。

49.根據(jù)權利要求40-48中任一項所述的方法，其中所述aav顆粒的所述治療有效量是約1×1012個病毒基因組(vg)/kg至約1×1014個vg/kg。

50.根據(jù)權利要求49所述的方法，其中所述aav顆粒的所述治療有效量是約1×1012個vg/kg至約1×1013個vg/kg。

技術總結
本發(fā)明涉及修飾的嵌合AAV衣殼、包含所述嵌合AAV衣殼的病毒載體，以及使用所述載體諸如靶向神經(jīng)系統(tǒng)的方法。本發(fā)明進一步涉及對神經(jīng)細胞具有改善的感染性的修飾的嵌合AAV衣殼、包含所述嵌合AAV衣殼的病毒載體，以及使用所述載體以改善的感染性靶向神經(jīng)細胞的方法。

技術研發(fā)人員：肖斌,肖嘯,李娟
受保護的技術使用者：北卡羅來納大學查佩爾希爾分校
技術研發(fā)日：
技術公布日：2024/12/10