本發(fā)明屬于生物，具體地說，是關(guān)于一種產(chǎn)x-脯氨酰二肽基氨基肽酶(x-prolyl?dipeptidyl?aminopeptidase，pepx)的乳酸乳球菌及其所產(chǎn)的x-脯氨酰二肽基氨基肽酶。

背景技術(shù)：

1、乳糜瀉是由飲食中富含脯氨酸的麩質(zhì)而引發(fā)的小腸炎癥性疾病。麩質(zhì)中15％的氨基酸為脯氨酸，脯氨酸占據(jù)了數(shù)種麩質(zhì)免疫顯性表位的核心區(qū)。胃蛋白酶和胰酶無法水解含有脯氨酸的肽鍵，麩質(zhì)經(jīng)消化后產(chǎn)生了很多攜帶顯性抗原表位的肽段，被t細胞所識別，從而產(chǎn)生免疫反應(yīng)，形成乳糜瀉。小麥、黑麥或大麥的麩質(zhì)是導(dǎo)致乳糜泄的主要原因，全球大約1～3％的人口受此影響。包括乳糜泄在內(nèi)的麩質(zhì)敏感相關(guān)疾病全球發(fā)病率占總?cè)丝诘?～10％。傳統(tǒng)上認(rèn)為中國并不是乳糜瀉高發(fā)地區(qū)，隨著近年來中國人麩質(zhì)食品(如使用高筋面粉為原料的焙烤食品等)消費量逐年增長，以及檢測手段的改善，乳糜瀉和麩質(zhì)敏感在中國的發(fā)病率也不容更樂觀。迄今為止，治療乳糜瀉的最有效方法是完全避免食用麩質(zhì)。然而，堅持嚴(yán)格的無麩質(zhì)飲食，對個人來說非常有挑戰(zhàn)性。因此，在食品工業(yè)中用酶作為添加劑或加工助劑，來進行麩質(zhì)脫毒，或作為非飲食性口服治療方式，無疑成為無麩質(zhì)飲食的最有效替代方法。然而，面筋蛋白質(zhì)主要成分是麥膠蛋白和麥谷蛋白，都是不溶性蛋白。麥膠蛋白是醇溶性蛋白，麥谷蛋白溶于稀酸或稀堿，因而對蛋白酶的ph穩(wěn)定性等應(yīng)用特性具有特殊的要求。

2、x-脯氨酰二肽基氨基肽酶(x-prolyl-dipeptidyl?aminopeptidase，pepx，ec3.4.14.11)，屬于絲氨酸蛋白酶s15家族，能夠特異性識別pro-xaa位點的外肽酶，從肽的n末端釋放c末端為脯氨酸的二肽。pepx首次被人們所認(rèn)知源于對乳酸菌蛋白水解系統(tǒng)的研究：作為氨基酸營養(yǎng)缺陷型菌株，乳酸菌能夠在牛奶中生長意味著需要通過水酪蛋白來獲得細胞所必需的氨基酸，而酪蛋白是一種富含脯氨酸的蛋白質(zhì)，因此可能存在對脯氨酸具有特異性識別的蛋白酶。1985年，casey和meyer首次報道了乳酸菌中pepx的存在。2002年rigolet等人通過多重同晶置換法，在分辨率下對乳酸乳球菌來源的pepx的結(jié)構(gòu)進行了解析，獲得了第一例pepx晶體結(jié)構(gòu)(pdb?id＝1lns)。之后的20年里，陸續(xù)有多種來源的pepx被報道，如瑞士乳桿菌、嗜熱鏈球菌、格氏乳桿菌、玉米黑粉菌、舊金山乳桿菌、清酒乳桿菌等。

3、近年來現(xiàn)代酶學(xué)技術(shù)的發(fā)展突飛猛進，酶制劑與生物催化的應(yīng)用也越來越廣泛，食源性生物活性肽逐漸成為熱點話題，許多具有獨特活性的肽段序列被發(fā)掘，如抗氧化肽、降血糖肽、抗菌肽等。其中血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ace)抑制肽由于其結(jié)構(gòu)與降血壓的普利類藥物相似(c-端為脯氨酸)，并且安全無毒、無副作用，具有輔助治療高血壓的潛力。c-端為脯氨酸的活性肽對糖尿病藥物靶點二肽基肽酶(dpp-iv)的抑制活性也具有顯著的促進作用；近年來c-端為脯氨酸的活性肽還被發(fā)現(xiàn)具有激活脂肪細胞分化、抗炎癥、調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞的黏附等多種生理功能。然而，它們很難通過體內(nèi)的酶對蛋白質(zhì)進行消化而產(chǎn)生。因此，尋找到能夠特異性識別脯氨酸位點的蛋白酶就能高效制備這些具有特殊結(jié)構(gòu)的活性肽。

4、因此，如果能夠利用高效穩(wěn)定的pepx，對含有脯氨酸的面筋蛋白進行降解，實現(xiàn)麩質(zhì)脫毒，同時大量獲得具有c-端為脯氨酸的食源性活性肽，一舉兩得，具有重要的應(yīng)用前景。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本申請的發(fā)明人從乳酸菌菌種庫中篩選得到了一種乳酸乳球菌(lactococcuslactis)，其所產(chǎn)的x-脯氨酰二肽基氨基肽酶(pepx)具有高酶活。

2、因此，本發(fā)明的第一個方面，提供了一種產(chǎn)x-脯氨酰二肽基氨基肽酶的乳酸乳球菌(lactococcus?lactis)my-3，所述乳酸乳球菌(lactococcus?lactis)my-3的保藏號為cctcc?m?20231779。

3、本發(fā)明的第二個方面，提供了一種x-脯氨酰二肽基氨基肽酶，所述x-脯氨酰二肽基氨基肽酶來源于上述的乳酸乳球菌(lactococcus?lactis)my-3。

4、進一步的，所述x-脯氨酰二肽基氨基肽酶的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

5、根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，所述x-脯氨酰二肽基氨基肽酶的第396位的谷氨酸進行了飽和突變。

6、優(yōu)選的，所述突變子為e396i、e396h、e396s、e396y或e396l。

7、進一步優(yōu)選的，所述突變子為e396i。

8、根據(jù)另一個優(yōu)選實施例，所述的x-脯氨酰二肽基氨基肽酶還包括e396i活性中心周圍堿性氨基酸的突變，所述堿性氨基酸的突變?yōu)閗189d、k189e、k590d、k590e或k648d。

9、優(yōu)選的，所述堿性氨基酸的突變?yōu)閗648d。

10、本發(fā)明的第三個方面，提供了編碼上述的x-脯氨酰二肽基氨基肽酶的基因序列。

11、進一步的，所述基因序列如seq?id?no.2所示。

12、本發(fā)明的第四個方面，提供了上述的x-脯氨酰二肽基氨基肽酶的應(yīng)用，用于水解富含脯氨酸的蛋白質(zhì)生產(chǎn)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽。

13、本發(fā)明的第五個方面，提供了上述的x-脯氨酰二肽基氨基肽酶的另一個應(yīng)用，用于水解麩質(zhì)并生產(chǎn)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽。

14、本發(fā)明具有以下有益效果：

15、1、本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了具有產(chǎn)x-脯氨酰二肽基氨基肽酶(pepx)能力的乳酸乳球菌(lactococcus?lactis)，并且所產(chǎn)的pepx具有高酶活，應(yīng)用前景廣闊。

16、2、經(jīng)過酶分子改造，獲得了具有更高酶活的突變子，進一步拓展了其應(yīng)用前景。

17、3、本發(fā)明獲得的重組x-脯氨酰二肽基氨基肽酶pepxlcmy-3能夠水解富含脯氨酸的蛋白質(zhì)和麥醇溶蛋白，以生產(chǎn)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽，可進一步應(yīng)用于保健食品的開發(fā)。

技術(shù)特征：

1.一種產(chǎn)x-脯氨酰二肽基氨基肽酶的乳酸乳球菌(lactococcus?lactis)my-3，其特征在于，所述乳酸乳球菌(lactococcus?lactis)my-3的保藏號為cctcc?m20231779。

2.一種x-脯氨酰二肽基氨基肽酶，其特征在于，所述x-脯氨酰二肽基氨基肽酶來源于權(quán)利要求1所述的乳酸乳球菌(lactococcus?lactis)my-3。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的x-脯氨酰二肽基氨基肽酶，其特征在于，所述x-脯氨酰二肽基氨基肽酶的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的x-脯氨酰二肽基氨基肽酶，其特征在于，其第396位的谷氨酸進行了飽和突變。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的x-脯氨酰二肽基氨基肽酶，其特征在于，所述突變子為e396i、e396h、e396s、e396y或e396l。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的x-脯氨酰二肽基氨基肽酶，其特征在于，所述突變子為e396i。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的x-脯氨酰二肽基氨基肽酶，其特征在于，還包括e396i活性中心周圍堿性氨基酸的突變，所述堿性氨基酸的突變?yōu)閗189d、k189e、k590d、k590e或k648d。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的x-脯氨酰二肽基氨基肽酶，其特征在于，所述堿性氨基酸的突變?yōu)閗648d。

9.編碼權(quán)利要求2～8中任一項所述的x-脯氨酰二肽基氨基肽酶的基因序列。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的基因序列，其特征在于，所述基因序列如seq?id?no.2所示。

11.權(quán)利要求2～8中任一項所述的x-脯氨酰二肽基氨基肽酶的應(yīng)用，其特征在于，用于水解富含脯氨酸的蛋白質(zhì)生產(chǎn)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽。

12.權(quán)利要求2～8中任一項所述的x-脯氨酰二肽基氨基肽酶的應(yīng)用，其特征在于，用于水解麩質(zhì)并生產(chǎn)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種產(chǎn)X?脯氨酰二肽基氨基肽酶的乳酸乳球菌(Lactococcus?lactis)MY?3，其保藏號為CCTCC?M?20231779。本發(fā)明還公開了來源于上述的乳酸乳球菌(Lactococcus?lactis)MY?3的X?脯氨酰二肽基氨基肽酶、其突變體、以及它們的應(yīng)用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了具有產(chǎn)X?脯氨酰二肽基氨基肽酶(PepX)能力的乳酸乳球菌(Lactococcus?lactis)，并且所產(chǎn)的PepX具有高酶活，應(yīng)用前景廣闊；經(jīng)過酶分子改造，獲得了具有更高酶活的突變子；本發(fā)明獲得的重組X?脯氨酰二肽基氨基肽酶PepXLcMY?3能夠水解富含脯氨酸的蛋白質(zhì)和麥醇溶蛋白，以生產(chǎn)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽，可進一步應(yīng)用于保健食品的開發(fā)。

技術(shù)研發(fā)人員：謝靜莉,蘇沙沙,俞君杰
受保護的技術(shù)使用者：上海茗研科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/6/26