本發(fā)明屬于生物，尤其涉及工程菌構建，具體涉及一種7-氨基頭孢烷酸生產菌及其制備方法與應用。

背景技術：

1、頭孢菌素c(cpc)是由絲狀真菌頂頭孢霉(acremonium?chrysogenum)生成的一種β-內酰胺類抗生素。頭孢菌素c可通過影響細菌細胞壁肽聚糖的合成組裝，從而干擾細菌細胞壁的合成以發(fā)揮抗菌作用。由于其具有廣譜抗菌的能力及對人、畜相對安全的特性，頭孢類抗生素被廣泛地應用于細菌性疾病的治療，成為臨床上最重要的抗感染藥物。

2、7-氨基頭孢烷酸(7-aca)作為半合成頭孢類抗生素的關鍵中間體，占全球40％以上頭孢類抗生素市場。由于cpc存在抗菌譜窄、容易被青霉素酶降解的弊端，為解決這一問題，可通過化學法或生物法對cpc脫酰基進而轉化7-aca。其中化學法不僅需要苛刻的反應條件，而且面臨高污染和高能耗的問題，無法滿足生產高質量7-aca的需要。而生物酶法裂解頭孢菌素c生產7-aca的工藝，具有工藝簡單、高效、低成本、安全、無污染及產品質量穩(wěn)定等優(yōu)點，被公認為是一種綠色生產工藝，已為國內外多數(shù)公司所采用，在經濟和保護環(huán)境上具有很大的競爭力。

3、酶法裂解生產7-aca包括兩步酶法和一步酶法；其中兩步酶法是cpc在d-氨基酸氧化酶的作用下，產生一個含有酮基的中間體(7-(5-oxoadipoamido)cephalosporanicacid)，這個中間體不穩(wěn)定，很容易被同時產生的h2o2氧化脫羧，轉變成戊二酰基-7-氨基頭孢烷酸(glutaryl-7-aminocephalosporanic?acid，gl-7-aca)，然后在gl-7-aca頭孢菌素c?；D移酶的作用下脫去側鏈生成7-aca。一步酶法是指利用cpc?；D移酶(ca)裂解頭孢烯核與?；鶄孺溨g的酰胺鍵,將cpc直接轉化為7-aca。因此，利用頭孢菌素c頭孢菌素c?；D移酶直接酰化cpc獲得7-aca是更適合工業(yè)生產需求。

4、目前，7-aca的一步酶法生產工藝首先對頂頭孢霉發(fā)酵生成的cpc進行提純，然后加入cpc?；D移酶進行反應獲得7-aca。但是，該過程不僅需要提純cpc，而且需要cpc?；D移酶的表達,提純和載體固定等步驟，十分繁瑣。

5、綜上所述，目前有多種方式生成7-aca，但缺乏環(huán)境友好，程序簡化的從頭合成7-aca的方法。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的一個目的是提供一種高生產性7-aca重組頂頭孢霉菌株的制備方法。

2、本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種頂頭孢霉菌種內蛋白質高表達的啟動子、一種編碼頭孢菌素c?；D移酶的氨基酸序列及將克隆在高表達載體中的cpc?；D移酶基因轉化至cpc高生產性重組頂頭孢霉菌株。

3、本發(fā)明解決上述技術問題所采用的方案如下：

4、本發(fā)明提供一種7-氨基頭孢烷酸生產菌株的制備方法，其在頂頭孢霉菌(acremonium?chrysogenum)中引入7-氨基頭孢烷酸合成途徑相關基因，得到重組菌即為7-氨基頭孢烷酸生產菌株；優(yōu)選地，其初始菌為頂頭孢霉cgmcc?3.3795或高生產性cpc重組頂頭孢霉。

5、具體地，所述7-氨基頭孢烷酸合成途徑相關基因是頭孢菌素c?；D移酶的編碼基因，所述頭孢菌素c酰基轉移酶能水解cpc側鏈基。

6、優(yōu)選地，所述頭孢菌素c酰基轉移酶為seq?id?no：1或ncbi號為aaa25690.1、caa48785.1、aac34685.2、wp_092168096.1、wp_217659596.1或其突變體。

7、更優(yōu)選地，所述突變體是在seq?id?no：1所奈序列的基礎上存在下述突變之一：g141q/l185k/a205e、h596k/a600e、w443i/l505a、w443i?l505t、d485i/h496k、a571k、n240q、d350k、v327i、t321g/v327i、t321g、a121h、m173q、i?166l、f381q、h453n、l505a、r437d或a565g。

8、具體地，在所述頭孢菌素c酰基轉移酶的編碼基因引入頂頭孢霉菌中，以表達盒的表達載體的形式導入，包括啟動子和終止子。

9、更具體地，所述啟動子為頂頭孢霉菌的內源性gpda啟動子；優(yōu)選地，所述的啟動子序列為seq?id?no：2或seq?id?no：3或seq?id?no：4或seq?id?no：5或seq?id?no：6或其突變體。

10、進一步地，表達載體的載體骨架為質粒puc57。

11、在具體實施方式中，通過基因編輯或同源重組的方式所述7-氨基頭孢烷酸合成途徑相關基因。

12、本發(fā)明還提供所述的制備方法得到的7-氨基頭孢烷酸生產菌株。

13、本發(fā)明進一步提供一種制備7-氨基頭孢烷酸的方法，包括如下步驟：發(fā)酵所述的7-氨基頭孢烷酸生產菌株，得到7-氨基頭孢烷酸；任選地，還包括收集所述7-氨基頭孢烷酸的步驟。

14、通過本發(fā)明的制備方法所制備的重組頂頭孢霉菌株可實現(xiàn)7-aca的一步合成，且轉化效率具有非常高的特征。通過本發(fā)明制備的高生產性7-aca重組頂頭孢霉菌株的7-aca生產能力可以為1至4.3g/l，最為優(yōu)選的4.3g/l以上。7-aca的生產量由菌種活化培養(yǎng)條件，發(fā)酵培養(yǎng)基配方，發(fā)酵工藝等參數(shù)決定。

15、本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明合成的頭孢菌素c酰基轉移酶導入頂頭孢霉菌中得到可以一步發(fā)酵合成7-氨基頭孢烷酸的重組菌。其中頭孢菌素c?；D移酶xy408構建的重組菌wh07通過搖瓶發(fā)酵實驗能夠產生4.3g/l以上的7-氨基頭孢烷酸，實現(xiàn)工業(yè)發(fā)酵法合成7-氨基頭孢烷酸。

技術特征：

1.一種7-氨基頭孢烷酸生產菌株的制備方法，其特征在于，在頂頭孢霉菌(acremoniumchrysogenum)中引入7-氨基頭孢烷酸合成途徑相關基因，得到重組菌即為7-氨基頭孢烷酸生產菌株；優(yōu)選地，其初始菌為頂頭孢霉cgmcc?3.3795或高生產性cpc重組頂頭孢霉。

2.根據(jù)權利要求?1?所述的制備方法，其特征在于：所述7-氨基頭孢烷酸合成途徑相關基因是頭孢菌素c酰基轉移酶的編碼基因，所述頭孢菌素c酰基轉移酶能水解cpc側鏈基。

3.根據(jù)權利要求2所述制備方法，其特征在于：所述頭孢菌素c?；D移酶為seq?idno：1?seq?id?no：1或ncbi號為aaa25690.1、caa48785.1、aac34685.2、wp_092168096.1、wp_217659596.1或其突變體。

4.根據(jù)權利要求3所述制備方法，其特征在于：所述突變體是在seq?id?no：1所奈?序列的基礎上存在下述突變之一：g141q/l185k/a205e、h596k/a600e、w443i/l505a、w443i

5.根據(jù)權利要求2所述的制備方法，其特征在于：在所述頭孢菌素c酰基轉移酶的編碼基因引入頂頭孢霉菌中，以表達盒的表達載體的形式導入，包括啟動子和終止子。

6.根據(jù)權利要求5所述的制備方法，其特征在于：所述啟動子為頂頭孢霉菌的內源性gpda啟動子；優(yōu)選地，所述的啟動子序列為seq?id?no：2或seq?id?no：3或seq?id?no：4或seq?id?no：5或seq?id?no：6或其突變體。

7.根據(jù)權利要求5所述的制備方法，其特征在于：表達載體的載體骨架為質粒puc57。

8.根據(jù)權利要求1至7任一項所述的制備方法，其特征在于：通過基因編輯或同源重組的方式所述7-氨基頭孢烷酸合成途徑相關基因。

9.如權利要求1至8任一項所述的制備方法得到的7-氨基頭孢烷酸生產菌株。

10.一種制備7-氨基頭孢烷酸的方法，包括如下步驟：發(fā)酵如權利要求7所述的7-氨基頭孢烷酸生產菌株，得到7-氨基頭孢烷酸；任選地，還包括收集所述7-氨基頭孢烷酸的步驟。

技術總結
本發(fā)明公開一種7?氨基頭孢烷酸生產菌及其制備方法與應用。本發(fā)明提供一種制備7?氨基頭孢烷酸的方法，包括如下步驟：將不同來源啟動子與多種頭孢菌素C頭孢菌素C?；D移酶進行組合質粒構建，通過原生質體轉化法將頭孢菌素C頭孢菌素C?；D移酶基因整合至頂頭孢霉菌種基因組中得到重組菌，發(fā)酵重組菌，得到7?氨基頭孢烷酸產物。本發(fā)明以CPC高生產性頂頭孢霉菌種為出發(fā)菌種，利用基因工程、合成生物學等手段，在其中外源引入頭孢菌素C頭孢菌素C酰基轉移酶，可以實現(xiàn)由工程菌直接生產7?氨基頭孢烷酸。該方法步驟簡單，生產過程中無化工污染，具有巨大的工業(yè)化前景。

技術研發(fā)人員：孫周通,曲戈,吳昊
受保護的技術使用者：中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所
技術研發(fā)日：
技術公布日：2024/12/19