本發(fā)明屬于基因治療和car-t細胞治療藥物開發(fā)，特別涉及一種car-t慢病毒整合位點的檢測方法及其應用。

背景技術：

1、嵌合抗原受體t(chimeric?antigen?receptor?t，car-t)細胞療法因在血液腫瘤中的突出療效已成為腫瘤細胞免疫治療領域中新的研發(fā)熱點。car-t細胞療法是指體外通過基因工程技術，將特異性抗原嵌合受體car的編碼基因轉(zhuǎn)入t細胞，通過t細胞表達的car靶向識別腫瘤細胞表面的抗原，激活t細胞殺傷。慢病毒是目前將car編碼基因轉(zhuǎn)入t細胞過程中應用最普遍的表達載體之一，其具有轉(zhuǎn)導效率高、目的基因表達穩(wěn)定、持續(xù)時間長等特點。慢病毒整合到宿主細胞的染色體上可以長期穩(wěn)定表達，并且與其他逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如腺病毒)相比，慢病毒不但能感染分裂期細胞，而且還能感染非分裂期的細胞，基于以上優(yōu)點，慢病毒載體作為外源基因轉(zhuǎn)移載體已廣泛用于臨床基因治療。但是慢病毒載體介導的基因轉(zhuǎn)導可能存在一定的潛在風險：慢病毒在細胞基因組的整合可能引起原癌基因的激活、抑癌基因的失活、rna剪接、基因融合等，從而具有成瘤風險。我們需要對慢病毒載體介導的基因轉(zhuǎn)移的安全性進行評價，即對car-t細胞基因組中慢病毒載體整合位點進行檢測，評價慢病毒載體在t細胞中不會產(chǎn)生熱點位置的整合而造成二次腫瘤的風險。

2、目前，已經(jīng)有多種方法被研究用于檢測慢病毒整合位點，最早人們利用反向pcr法，該方法的問題是靈敏度和特異性不夠。隨著非限制性線性擴增介導的pcr(nonrestrictive?linear?amplification–mediatedpcr，nrlampcr)技術的出現(xiàn)，病毒插入位點的研究取得了重大進展。目前，多數(shù)病毒插入位點分析(vis)方法基于此技術。在復雜樣品的檢測中，nrlam-pcr被廣泛應用。然而，該方法需要考慮引物設計的難度并且容易引入偏差，因為這可能會對結果造成技術誤差的風險。

3、因此，鑒于上述方案于實際制作及實施使用上的缺失之處，而加以修正、改良，同時本著求好的精神及理念，并由專業(yè)的知識、經(jīng)驗的輔助，以及在多方巧思、試驗后，方創(chuàng)設出本發(fā)明，特再提供一種car-t慢病毒整合位點的檢測方法及其應用，用于解決上述的問題。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提出一種car-t慢病毒整合位點的檢測方法及其應用，解決了現(xiàn)有技術中的問題。

2、本發(fā)明的技術方案是這樣實現(xiàn)的：一種car-t慢病毒整合位點的檢測方法及其應用，包括如下步驟：

3、s1、提取dna；

4、s2、針對慢病毒載體5’ltr區(qū)，設計特異性引物ltri，進行線性pcr；

5、s3、使用鏈霉素磁珠生物素化步驟s2的pcr產(chǎn)物；

6、s4、將步驟s3的產(chǎn)物與單鏈linker進行連接；

7、s5、將步驟s4的產(chǎn)物作為模板，采用第一輪引物ltrii進行第一輪pcr；

8、s6、將步驟s5的產(chǎn)物作為模板，采用第二輪引物ltriii進行第二輪pcr；

9、s7、對步驟s6的pcr產(chǎn)物上機測序；

10、s8、對測序后的數(shù)據(jù)過濾并進行生物信息學分析，得出慢病毒載體整合位點基本信息，判斷整合位點插入位置是否在基因安全港范圍。

11、作為優(yōu)選的實施方式，所述步驟s2的特異性引物ltri，核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

12、作為優(yōu)選的實施方式，所述步驟s4的單鏈linker，核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

13、作為優(yōu)選的實施方式，所述步驟s5的第一輪引物ltrii，核苷酸序列如seq?idno.3所示；lci，核苷酸序列如seq?id?no.4所示。

14、作為優(yōu)選的實施方式，所述步驟s6的第二輪引物ltriii，核苷酸序列如seq?idno.5所示；lcii，核苷酸序列如seq?id?no.6所示。

15、作為優(yōu)選的實施方式，所述步驟s8中的數(shù)據(jù)過濾手段如下：

16、a.截去測序reads中的測序引物及接頭序列；

17、b.截去reads兩端質(zhì)量值低于20的堿基；

18、c.去除n堿基比例大于10％的reads；

19、d.去除剪切后長度小于75bp的reads。

20、作為優(yōu)選的實施方式，所述步驟s8中的生物信息學分析包括：

21、a.將過濾的數(shù)據(jù)與參考基因組比對，對比完成后通過bam文件進行排序；

22、b.對整合位點進行ref?gene數(shù)據(jù)庫的注釋，注釋內(nèi)容包括：斷點所在基因、基因功能區(qū)、對應基因的功能描述；

23、c.對整合位點進行分析，查看插入位點位置的基因在疾病或其它方面的功能性影響。

24、作為優(yōu)選的實施方式，所述判斷整合位點插入位置是否在基因安全港范圍包括：

25、a.距離任何基因的5’端≥50kb；

26、b.距離任何與癌癥相關基因≥300kb；

27、c.距離任何micro?rna≥300kb；

28、d.不位于轉(zhuǎn)錄元件區(qū)間；

29、e.不位于人類基因組的超保守區(qū)域：phylop?conservation?score≥2.0的區(qū)間

30、采用了上述技術方案后，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明的檢測方法可以對car-t細胞進行檢測，在回輸至患者體內(nèi)之前，明確car-t細胞基因組內(nèi)插入位點，對本批次生產(chǎn)的car-t細胞產(chǎn)品進行安全評估及分析。

31、本發(fā)明的檢測方法可以明確插入位點，快速識別整合位點的插入位置和基礎信息，判斷慢病毒載體介導的整合是否具有傾向，有無發(fā)生發(fā)生熱點整合，car-t細胞產(chǎn)品的安全性。

技術特征：

1.一種car-t慢病毒整合位點的檢測方法及其應用，其特征在于，包括如下步驟：

2.根據(jù)權利要求1所述的一種car-t慢病毒整合位點的檢測方法及其應用，其特征在于，所述步驟s2的特異性引物ltri，核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

3.根據(jù)權利要求1所述的一種car-t慢病毒整合位點的檢測方法及其應用，其特征在于，所述步驟s4的單鏈linker，核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

4.根據(jù)權利要求1所述的一種car-t慢病毒整合位點的檢測方法及其應用，其特征在于，所述步驟s5的第一輪引物ltrii，核苷酸序列如seq?id?no.3所示；lci，核苷酸序列如seq?id?no.4所示。

5.根據(jù)權利要求1所述的一種car-t慢病毒整合位點的檢測方法及其應用，其特征在于，所述步驟s6的第二輪引物ltriii，核苷酸序列如seq?id?no.5所示；lcii，核苷酸序列如seq?id?no.6所示。

6.根據(jù)權利要求1所述的一種car-t慢病毒整合位點的檢測方法及其應用，其特征在于，所述步驟s8中的數(shù)據(jù)過濾手段如下：

7.根據(jù)權利要求1所述的一種car-t慢病毒整合位點的檢測方法及其應用，其特征在于，所述步驟s8中的生物信息學分析包括：

8.根據(jù)權利要求7所述的一種car-t慢病毒整合位點的檢測方法及其應用，其特征在于，所述判斷整合位點插入位置是否在基因安全港范圍包括：

技術總結
本發(fā)明提出了一種CAR?T慢病毒整合位點的檢測方法及其應用，包括如下步驟：(1)提取DNA；(2)針對慢病毒載體5’LTR區(qū)，設計特異性引物LTRI，進行線性PCR；(3)使用鏈霉素磁珠生物素化步驟S2的PCR產(chǎn)物；(4)將步驟S3的產(chǎn)物與單鏈linker進行連接；(5)將步驟S4的產(chǎn)物作為模板，采用第一輪引物LTRII進行第一輪PCR；(6)將步驟S5的產(chǎn)物作為模板，采用第二輪引物LTRIII進行第二輪PCR；(7)對步驟S6的PCR產(chǎn)物上機測序；(8)對測序后的數(shù)據(jù)過濾并進行生物信息學分析，得出慢病毒載體整合位點基本信息，判斷整合位點插入位置是否在基因安全港范圍，借此，本發(fā)明具有的優(yōu)點為，本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)CAR?T細胞檢測，并進行安全評估及分析，保障產(chǎn)品安全性。

技術研發(fā)人員：徐美君
受保護的技術使用者：武漢科技大學
技術研發(fā)日：
技術公布日：2024/12/19