本發(fā)明屬于酶工程領(lǐng)域，具體涉及一種黑酵母菌尿酸氧化酶及其突變體和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、高尿酸血癥是一種常見的代謝性疾病，與心血管系統(tǒng)和代謝系統(tǒng)的多種疾病相關(guān)，如高血壓、冠狀動(dòng)脈疾病。目前針對(duì)高尿酸血癥的治療藥物如別嘌呤醇、非布司他、苯溴馬隆、丙磺舒等。盡管都有降解尿酸的效果，但長期服用會(huì)出現(xiàn)皮疹過敏、肝功能損害、腎結(jié)石等不良反應(yīng)。人體尿酸有1/3由腸道排泄，2/3由腎臟排泄。在進(jìn)化過程中，人類的尿酸氧化酶因基因突變失去了活性。這意味著在高嘌呤飲食情況下，人體尿酸代謝可能異常，導(dǎo)致尿酸積累，從而可能引發(fā)痛風(fēng)和高尿酸血癥。尿酸氧化酶作為可以直接催化降解尿酸的酶在治療高尿酸血癥方面有著巨大的潛力。然而，由于尿酸氧化酶的產(chǎn)量不足，純化工藝繁瑣導(dǎo)致成本費(fèi)用過高，因此在國內(nèi)還沒有被廣泛使用。所以，構(gòu)建一株高產(chǎn)尿酸氧化酶的基因工程菌株具有非常重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種黑酵母菌尿酸氧化酶及其突變體和應(yīng)用。

2、本發(fā)明是基于深度學(xué)習(xí)獲取尿酸氧化酶序列，從而首次驗(yàn)證了編碼尿酸氧化酶的基因具有尿酸氧化酶活性。更進(jìn)一步地通過半理性設(shè)計(jì)改造技術(shù)得到氨基酸突變點(diǎn)，獲得了具有較高活性的尿酸氧化酶突變體工程菌。應(yīng)用該菌株表達(dá)尿酸氧化酶達(dá)到降解尿酸的效果。

3、本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

4、一種黑酵母菌尿酸氧化酶horuox突變體，其氨基酸序列為seq?id?no.2經(jīng)如下任意一種突變而得：

5、(1)e183y，即第183位氨基酸由e突變?yōu)閥，其他同理；

6、(2)l287y，

7、(3)d283r。

8、一種上述突變體的編碼基因。

9、上述突變體相關(guān)的生物材料，為下述生物材料中的任意一種或多種組合：

10、(a)含有上述編碼基因的表達(dá)盒；

11、(b)含有上述編碼基因的重組表達(dá)載體；

12、(c)含有(a)中所述表達(dá)盒的重組表達(dá)載體；

13、(d)含有上述編碼基因的重組微生物；

14、(e)含有(a)中所述表達(dá)盒的重組微生物；

15、(f)含有(b)或(c)中所述重組表達(dá)載體的重組微生物。

16、進(jìn)一步的，(b)、(c)中所述重組表達(dá)載體的出發(fā)載體為pet系列的載體等；優(yōu)選為pet28a(+)載體。

17、進(jìn)一步的，(d)、(e)、(f)中所述重組微生物對(duì)應(yīng)的宿主微生物選自原核生物等；所述原核生物包括埃希氏菌屬(escherichia)等細(xì)菌。更具體而言，所述原核生物是大腸桿菌(escherichia?coli，e.coli)，具體可為大腸桿菌bl21(de3)。

18、上述突變體、編碼基因、突變體相關(guān)的生物材料在制備黑酵母菌尿酸氧化酶horuox突變體中的應(yīng)用。

19、進(jìn)一步的，上述突變體、編碼基因、突變體相關(guān)的生物材料、黑酵母菌尿酸氧化酶horuox、黑酵母菌尿酸氧化酶horuox相關(guān)的生物材料在制備降解尿酸的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

20、所述黑酵母菌尿酸氧化酶horuox相關(guān)的生物材料，為下述生物材料中的任意一種或多種組合：

21、1)含有編碼黑酵母菌尿酸氧化酶horuox的基因的表達(dá)盒；

22、2)含有編碼黑酵母菌尿酸氧化酶horuox的基因的重組表達(dá)載體；

23、3)含有1)中所述表達(dá)盒的重組表達(dá)載體；

24、4)含有編碼黑酵母菌尿酸氧化酶horuox的基因的重組微生物；

25、5)含有1)中所述表達(dá)盒的重組微生物；

26、6)含有2)或3)中所述重組表達(dá)載體的重組微生物。

27、進(jìn)一步的，2)、3)中所述重組表達(dá)載體的出發(fā)載體為pet系列的載體等；優(yōu)選為pet28a(+)載體。

28、進(jìn)一步的，4)、5)、6)中所述重組微生物對(duì)應(yīng)的宿主微生物選自原核生物等；所述原核生物包括埃希氏菌屬(escherichia)等細(xì)菌。更具體而言，所述原核生物是大腸桿菌(escherichia?coli，e.coli)，具體可為大腸桿菌bl21(de3)。

29、進(jìn)一步優(yōu)選的，(d)、(e)、(f)、4)、5)、6)中所述重組微生物還含有5-羥基異尿酸水解酶基因pucm，以實(shí)現(xiàn)horuox和pucm的雙酶級(jí)聯(lián)表達(dá)，實(shí)現(xiàn)從尿酸經(jīng)由5-羥基異尿酸到尿囊素的過程。

30、其中，黑酵母菌尿酸氧化酶horuox的氨基酸序列如seq?id?no.2所示，編碼黑酵母菌尿酸氧化酶horuox的基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

31、所述5-羥基異尿酸水解酶來源于cyberlindnera?jadinii；其編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no：3所示，其氨基酸序列如seq?id?no：4所示。

32、一種獲得上述突變體的方法，包括如下步驟：通過設(shè)計(jì)含有突變位點(diǎn)的引物對(duì)編碼氨基酸序列如seq?id?no.2所示的黑酵母菌尿酸氧化酶horuox的基因進(jìn)行定點(diǎn)突變后表達(dá)，得到黑酵母菌尿酸氧化酶horuox突變體。

33、進(jìn)一步的，設(shè)計(jì)含有突變位點(diǎn)的引物向編碼氨基酸序列如seq?id?no.2所示的黑酵母菌尿酸氧化酶horuox的基因中引入突變，經(jīng)測序正確后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌bl21(de3)中進(jìn)行表達(dá)，得到黑酵母菌尿酸氧化酶horuox突變體。

34、本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：

35、(1)本發(fā)明提供的黑酵母菌尿酸氧化酶horuox，是經(jīng)過深度學(xué)習(xí)大量計(jì)算酶活性結(jié)合系統(tǒng)進(jìn)化樹篩選得到，經(jīng)過大腸桿菌密碼子偏好性優(yōu)化改造，有利于其在大腸桿菌中表達(dá)。

36、(2)本發(fā)明利用原核表達(dá)系統(tǒng)，選用pet28a(+)載體構(gòu)建重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌bl21(de3)。經(jīng)低溫誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)，重組尿酸氧化酶以可溶性的方式表達(dá)。將編碼尿酸氧化酶的核苷酸序列通過分子對(duì)接、半理性設(shè)計(jì)改造、分子動(dòng)力學(xué)模擬等，得到突變體horum(e183y)、horum(d283r)、horum(l287y)，測得突變體的比酶活較野生型分別提高了2.02倍、1.35倍、1.73倍，具有較大的應(yīng)用潛力。

技術(shù)特征：

1.一種黑酵母菌尿酸氧化酶horuox突變體，其特征在于：所述突變體的氨基酸序列為seq?id?no.2經(jīng)如下任意一種突變而得：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黑酵母菌尿酸氧化酶horuox突變體，其特征在于：編碼seq?idno.2所示氨基酸序列的基因序列如seq?id?no.1所示。

3.編碼權(quán)利要求1或2所述的黑酵母菌尿酸氧化酶horuox突變體的基因。

4.權(quán)利要求1～2任一項(xiàng)所述的黑酵母菌尿酸氧化酶horuox突變體相關(guān)的生物材料，其特征在于：為下述生物材料中的任意一種或多種組合：

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生物材料，其特征在于：

6.權(quán)利要求1～2任一項(xiàng)所述的黑酵母菌尿酸氧化酶horuox突變體、權(quán)利要求3所述的基因或權(quán)利要求4～5任一項(xiàng)所述生物材料在制備黑酵母菌尿酸氧化酶horuox突變體中的應(yīng)用。

7.權(quán)利要求1～2任一項(xiàng)所述的黑酵母菌尿酸氧化酶horuox突變體、權(quán)利要求3所述的基因、權(quán)利要求4～5任一項(xiàng)所述生物材料、黑酵母菌尿酸氧化酶horuox或黑酵母菌尿酸氧化酶horuox相關(guān)的生物材料在制備降解尿酸的產(chǎn)品中的應(yīng)用，其特征在于：

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于：編碼黑酵母菌尿酸氧化酶horuox的基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

9.一種獲得權(quán)利要求1或2所述黑酵母菌尿酸氧化酶horuox突變體的方法，其特征在于：包括如下步驟：通過設(shè)計(jì)含有突變位點(diǎn)的引物對(duì)編碼氨基酸序列如seq?id?no.2所示的黑酵母菌尿酸氧化酶horuox的基因進(jìn)行定點(diǎn)突變后表達(dá)，得到權(quán)利要求1所述的黑酵母菌尿酸氧化酶horuox突變體。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于：設(shè)計(jì)含有突變位點(diǎn)的引物向編碼氨基酸序列如seq?id?no.2所示的黑酵母菌尿酸氧化酶horuox的基因中引入突變，經(jīng)測序正確后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌bl21(de3)中進(jìn)行表達(dá)，得到黑酵母菌尿酸氧化酶horuox突變體。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開一種黑酵母菌尿酸氧化酶及其突變體和應(yīng)用，屬于酶工程領(lǐng)域。本發(fā)明經(jīng)過深度學(xué)習(xí)大量計(jì)算酶活性結(jié)合系統(tǒng)進(jìn)化樹篩選得到黑酵母菌尿酸氧化酶HorUox，首次驗(yàn)證了目標(biāo)基因具有尿酸氧化酶活性，達(dá)到降解尿酸的效果。利用原核表達(dá)系統(tǒng)，選用pET28a(+)載體構(gòu)建重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)。經(jīng)低溫誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)，重組尿酸氧化酶以可溶性的方式表達(dá)。通過分子對(duì)接、半理性設(shè)計(jì)改造、分子動(dòng)力學(xué)模擬等，得到突變體HorUm(E183Y)、HorUm(D283R)、HorUm(L287Y)，測得突變體的比酶活較野生型分別提高了2.02倍、1.35倍、1.73倍，具有較大的應(yīng)用潛力。

技術(shù)研發(fā)人員：魏韜,傅麗冰,梁錦滿,孔令杰,高瑜彤,蔡偉誼,蘇振榮,劉婷婷,王斌
受保護(hù)的技術(shù)使用者：廣東少和生物科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/8/20