本發(fā)明涉及生物，更具體的說是涉及一種抗灰霉rpl1蛋白的抗體及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、灰霉菌(botrytis?cinerea)為灰霉病的病原，抗性強(qiáng)，侵染葡萄等農(nóng)作物后造成品質(zhì)下降，減產(chǎn)，甚至絕收。目前，針對(duì)灰霉主要的檢測(cè)方法，一種是病原學(xué)的檢測(cè)；另一種是核酸檢測(cè)。前一種方法的弊端在于，檢測(cè)出灰霉時(shí)，植株已經(jīng)被侵染，損失不可避免。后一種方法優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)精度高且快速，適用于土壤、種子、植株組織等樣品，然而該方法需要專用儀器設(shè)備進(jìn)行檢測(cè)，且操作者需要專業(yè)訓(xùn)練后方能操作。

2、因此，建立一種能針對(duì)灰霉菌核、分生孢子及菌絲體分布及傳播特點(diǎn)的快速而準(zhǔn)確檢測(cè)方法，能在灰霉病爆發(fā)前進(jìn)行檢測(cè)以提前預(yù)防控制，可防止灰霉大面積爆發(fā)造成損失，是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟需解決的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明提供了一種抗灰霉rpl1蛋白的抗體及應(yīng)用。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

3、一種檢測(cè)灰霉病原菌的抗體，以灰霉rpl1蛋白作為抗原免疫動(dòng)物所得。

4、灰霉rpl1蛋白參與蛋白生物合成，對(duì)于灰霉不可或缺，序列特異且保守，能有效表征灰霉。本發(fā)明利用rpl1蛋白作為抗原制備的抗體，利用該抗體結(jié)合彩色免疫微球標(biāo)記和免疫印跡等技術(shù)可特異地從土壤、種子、植株組織等樣品中檢測(cè)到灰霉，對(duì)于灰霉病的早期診斷具有極大優(yōu)勢(shì)。且該方法為血清學(xué)檢測(cè)方法，不需要昂貴的儀器設(shè)備，普通技術(shù)人員即可操作，具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏地特點(diǎn)。

5、作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述灰霉rpl1蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

6、本發(fā)明的另一目的是，提供上述檢測(cè)灰霉病原菌的抗體的制備方法，包括構(gòu)建或合成含有灰霉rpl1蛋白的重組質(zhì)粒，克隆表達(dá)灰霉rpl1蛋白，純化得灰霉rpl1蛋白，將純化后的灰霉rpl1蛋白作為抗原免疫動(dòng)物，所得免疫血清即為檢測(cè)灰霉病原菌的抗體。

7、作為優(yōu)選的技術(shù)方案，構(gòu)建或合成含有灰霉rpl1蛋白的重組質(zhì)粒中的質(zhì)粒為pet24a。

8、本發(fā)明的另一目的是，提供一種檢測(cè)灰霉病原菌的試劑盒，所述試劑盒包括上述檢測(cè)灰霉病原菌的抗體，或者包括上述制備方法制備的抗體。

9、作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述試劑盒為免疫印跡試劑盒，還包括硝酸纖維素印跡膜、hrp標(biāo)記的二抗，洗滌液pbs，以及ecl化學(xué)發(fā)光試劑。

10、作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述試劑盒為彩色免疫微球試劑盒，還包括硝酸纖維素印跡膜、洗滌液pbs，且rpl1抗體用彩色免疫微球標(biāo)記。

11、本發(fā)明的另一目的是，提供上述檢測(cè)灰霉病原菌的抗體或者上述制備方法制備的抗體或者上述試劑盒在制備檢測(cè)灰霉病原菌產(chǎn)品中的應(yīng)用。

12、本發(fā)明的另一目的是，提供一種灰霉病原菌的免疫檢測(cè)方法，包括以下步驟：

13、(1)將硝酸纖維素印跡膜隔著保護(hù)膜劃出1×1cm的方格，然后去掉保護(hù)膜，并吸取待檢測(cè)樣品溶液2μl點(diǎn)在方格中；置于濕盒中，提前墊有pbs緩沖液潤(rùn)濕過的濾紙，于37℃孵育2h；

14、(2)將孵育好的硝酸纖維素印跡膜轉(zhuǎn)移到無蛋白封閉液中進(jìn)行封閉，于37℃封閉2h，然后用稀釋為1×的pbst洗滌，放置在脫色搖床上洗3次，轉(zhuǎn)速為40rpm，每次洗滌5min；

15、(3)將孵育好的硝酸纖維素印跡膜分別轉(zhuǎn)移到提前用pbs稀釋成1萬倍的上述檢測(cè)灰霉病原菌的抗體中，于37℃孵育2h，然后用稀釋為1×的pbst洗滌，放置在脫色搖床上洗3次，轉(zhuǎn)速為40rpm，每次洗滌5min；

16、(4)將洗滌好的硝酸纖維素印跡膜取出并按稀釋度做好標(biāo)記，轉(zhuǎn)移到稀釋為5000倍的hrp標(biāo)記羊抗兔二抗中，于37℃孵育結(jié)合2h，然后用稀釋為1×的pbst洗滌，放置在脫色搖床上洗4次，轉(zhuǎn)速為40rpm，每次洗滌5min；

17、(5)用超靈敏ecl化學(xué)發(fā)光試劑顯色，讀取結(jié)果。

18、本發(fā)明的另一目的是，提供一種灰霉病原菌的免疫微球檢測(cè)方法，包括以下步驟：

19、(1)制備藍(lán)色免疫微球，取直徑1μm的nhs標(biāo)記的藍(lán)色微球10ml，按質(zhì)量比0.1‰加入上述檢測(cè)灰霉病原菌的抗體10μl進(jìn)行交聯(lián)，25℃下避光交聯(lián)10h，轉(zhuǎn)速為40rpm；交聯(lián)完畢加入2m?tris250μl至終濃度為50mm進(jìn)行封閉，25℃下避光封閉10h，轉(zhuǎn)速為40rpm；

20、(2)將硝酸纖維素印跡膜隔著保護(hù)膜劃出1×1cm的方格，然后去掉保護(hù)膜，并吸取待檢測(cè)樣品溶液2μl點(diǎn)在方格中；置于濕盒中，提前墊有pbs緩沖液潤(rùn)濕過的濾紙，于37℃孵育2h；

21、(3)將孵育好的硝酸纖維素印跡膜轉(zhuǎn)移到無蛋白封閉液中進(jìn)行封閉，于37℃封閉2h，然后用稀釋為1×的pbst洗滌，放置在脫色搖床上洗3次，轉(zhuǎn)速為40rpm，每次洗滌5min，洗滌過程中要防止膜粘到?jīng)]有緩沖液的壁上；

22、(4)將制備好的藍(lán)色免疫微球滴加在孵育好的硝酸纖維素印跡膜上，均勻覆蓋表面；于25℃孵育10min，然后用稀釋為1×的pbst洗滌，放置在脫色搖床上洗3次，轉(zhuǎn)速為40rpm，每次洗滌2min，洗滌后顯色讀取結(jié)果。

23、有益效果：本發(fā)明基于抗原與抗體特異性結(jié)合特點(diǎn)，通過免疫印跡和免疫微球技術(shù)對(duì)灰霉rpl1蛋白進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明克服了傳統(tǒng)檢測(cè)灰霉時(shí)間長(zhǎng)、要求高的弊端，將灰霉病的檢測(cè)時(shí)間大大提前，實(shí)現(xiàn)對(duì)灰霉早期、快速而準(zhǔn)確的檢測(cè)效果。

技術(shù)特征：

1.一種檢測(cè)灰霉病原菌的抗體，其特征在于，以灰霉rpl1蛋白作為抗原免疫動(dòng)物所得。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)灰霉病原菌的抗體，其特征在于，所述灰霉rpl1蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

3.如權(quán)利要求1或2所述檢測(cè)灰霉病原菌的抗體的制備方法，其特征在于，構(gòu)建或合成含有灰霉rpl1蛋白的重組質(zhì)粒，克隆表達(dá)灰霉rpl1蛋白，純化得灰霉rpl1蛋白，將純化后的灰霉rpl1蛋白作為抗原免疫動(dòng)物，所得免疫血清即為檢測(cè)灰霉病原菌的抗體。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)灰霉病原菌的抗體的制備方法，其特征在于，構(gòu)建或合成含有灰霉rpl1蛋白的重組質(zhì)粒中的質(zhì)粒為pet24a。

5.一種檢測(cè)灰霉病原菌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權(quán)利要求1或2所述檢測(cè)灰霉病原菌的抗體，或者包括權(quán)利要求3或4所述制備方法制備的抗體。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒為免疫印跡試劑盒，還包括硝酸纖維素印跡膜、hrp標(biāo)記的二抗，洗滌液pbs，以及ecl化學(xué)發(fā)光試劑。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒為彩色免疫微球試劑盒，還包括硝酸纖維素印跡膜、洗滌液pbs，且rpl1抗體用彩色免疫微球標(biāo)記。

8.如權(quán)利要求1或2所述檢測(cè)灰霉病原菌的抗體或者權(quán)利要求3或4所述制備方法制備的抗體或者權(quán)利要求5-7任一所述試劑盒在制備檢測(cè)灰霉病原菌產(chǎn)品中的應(yīng)用。

9.一種灰霉病原菌的免疫檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟：

10.一種灰霉病原菌的免疫微球檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種抗灰霉Rpl1蛋白的抗體及應(yīng)用，涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明檢測(cè)灰霉病原菌的抗體，是以灰霉Rpl1蛋白作為抗原免疫動(dòng)物所得，所述灰霉Rpl1蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。本發(fā)明基于抗原與抗體特異性結(jié)合特點(diǎn)，通過免疫印跡和免疫微球技術(shù)對(duì)灰霉Rpl1蛋白進(jìn)行檢測(cè)，克服了傳統(tǒng)檢測(cè)灰霉時(shí)間長(zhǎng)、要求高的弊端，將灰霉病的檢測(cè)時(shí)間大大提前，實(shí)現(xiàn)對(duì)灰霉早期、快速而準(zhǔn)確的檢測(cè)效果。

技術(shù)研發(fā)人員：李艷鋒
受保護(hù)的技術(shù)使用者：西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院蔬菜研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/9/9