本發(fā)明屬于基因檢測，具體涉及一種微單倍型的檢測分型方法。

背景技術(shù)：

1、連鎖信息對于疾病的判斷至關(guān)重要，例如，對于隱性遺傳病來說，假設(shè)一個基因有兩個不同位點發(fā)生了突變，如果這兩個突變位于同一條染色體上，即連鎖，那么這條染色體上的這個基因喪失功能，而另一條染色體上還有一個正常的拷貝，因此該細胞不具有突變的表型；如果這兩個突變位于不同的染色體上，也就是兩個等位基因都發(fā)生了突變，則會表現(xiàn)為致病的狀態(tài)。此外，連鎖信息還有助于判斷遺傳病突變基因來自父親還是來自母親。

2、通常將片段長度在200bp內(nèi)，擁有兩個及以上高度緊密連鎖snp位點的多態(tài)性基因座定義為微單倍型。微單倍型是一種可以應(yīng)用于法醫(yī)遺傳學(xué)的新型遺傳標記，具有多態(tài)性高、突變率低、無stutter產(chǎn)物、擴增片段短的特點。微單倍型可以有效檢出混合斑，并對混合斑貢獻者定量分析；對嚴重碎片化的dna成功分型，應(yīng)用于降解檢材；作為始祖信息位點將全球人群按照遺傳結(jié)構(gòu)進行有效劃分；提供比短串聯(lián)重復(fù)更多的信息量，幫助鑒定復(fù)雜親緣關(guān)系；還可以為腫瘤身源鑒定、細胞系鑒定、產(chǎn)前親子鑒定提供新的思路，因此，對微單倍型進行檢測分型，具有廣闊的應(yīng)用前景。

3、由于微單倍型和snp都屬于序列多態(tài)性遺傳標記，但微單倍型遺傳標記包含的多個snp難以轉(zhuǎn)換為長度多態(tài)性，因此法醫(yī)物證學(xué)領(lǐng)域常用的毛細管電泳法無法推廣應(yīng)用于微單倍型的檢測分型?；谠摽蒲须y點，眾多實驗團隊已開發(fā)出諸如一代測序、二代測序、核酸質(zhì)譜法等檢測手段，并逐漸得到應(yīng)用。但采用一代測序技術(shù)時，如遇2個及以上位點雜合時，則無法從基因組dna中確定單個snp等位基因之間的順反位置關(guān)系，進而影響分型判斷；雖然二代測序技術(shù)具備高通量、集成化等顯著優(yōu)勢，但較昂貴的檢測設(shè)備與檢測費用，不利于推廣使用；質(zhì)譜法分離速度和分辨率均遠超于以凝膠電泳為基礎(chǔ)的測序方法，同時，針對相同長度但序列不同的dna片段，質(zhì)譜法可以精準分辨堿基種類，因此核酸質(zhì)譜法常使用在微單倍型的snp位點檢測中，但該方法需采用較為昂貴的儀器設(shè)備，且無法檢測未知突變，加上該方法對檢測樣本及位點數(shù)的要求，一定程度上桎梏著核酸質(zhì)譜技術(shù)的應(yīng)用。

4、基于此，本發(fā)明開發(fā)了一種微單倍型的檢測分型方法。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種微單倍型的檢測分型方法。

2、技術(shù)方案

3、一種微單倍型的檢測分型方法，包括如下步驟：

4、(1)獲取待檢微單倍型樣本的檢測位點snp1和snp2，根據(jù)snp1和snp2位點信息設(shè)計f引物和r引物，以待檢微單倍型樣本的基因組dna為模板，進行pcr擴增，獲得擴增產(chǎn)物；

5、步驟(1)中，所述f引物根據(jù)snp1和snp2位點信息設(shè)計，所述f引物的5’端修飾有磷酸根，f引物從5’到3’端依次包括a’、u-f、p和as-p四個區(qū)，其中a’區(qū)至少含有5個堿基，該堿基序列與f引物的延伸產(chǎn)物中緊連snp2位點的5’側(cè)堿基序列是反向互補關(guān)系；u-f區(qū)是一段公用序列；p區(qū)是一段用于編碼snp1的位點信息的dna序列；as-p區(qū)則是按as-pcr原則設(shè)計的一段序列；

6、所述r引物是根據(jù)snp2位點信息設(shè)計，所述r引物從5’端到3’端依次包括b、fu-r和2r三個區(qū)，其中b區(qū)至少含有5個堿基，該堿基序列與f引物的延伸產(chǎn)物中緊連snp2位點的3’側(cè)堿基序列相同；fu-r區(qū)是一段用于編碼snp2的位點信息的dna序列；2r區(qū)是用于擴增snp1和snp2序列的常規(guī)引物序列；

7、(2)將擴增產(chǎn)物純化后，加熱變性，然后冰上復(fù)性，再加入dna連接酶進行連接反應(yīng)，得到連接產(chǎn)物；

8、(3)用核酸外切酶處理消化掉連接產(chǎn)物中未成環(huán)的dna，然后采用公用引物u-f和熒光標記的公用引物fu-r進行pcr擴增，得到熒光標記的pcr擴增產(chǎn)物；

9、所述公用引物u-f的序列與f引物中的u-f區(qū)序列相同，所述公用引物fu-r的序列與r引物中的fu-r區(qū)序列相同；

10、(4)設(shè)計dna芯片，所述dna芯片上設(shè)有能與編碼snp1信息的序列相結(jié)合的探針，將步驟(3)的pcr擴增產(chǎn)物與dna芯片雜交，然后用芯片掃描儀讀取芯片信息，根據(jù)讀取的數(shù)據(jù)，得到待檢微單倍型樣本的基因分型結(jié)果。

11、進一步，步驟(1)中，所述f引物的p區(qū)的序列種類由snp1多態(tài)性種類決定，根據(jù)snp1位點的多態(tài)性，p區(qū)包括p1,p2...pm，相對應(yīng)的f引物包括f1,f2...fm，m代表需要設(shè)計的引物條數(shù)；如兩個等位基因，則只需要設(shè)計f1和f2兩條f引物。

12、進一步，步驟(1)中，所述r引物包括r1,r2...rn，n代表需要設(shè)計的引物條數(shù)，其由snp2位點的多態(tài)性數(shù)目決定，如果是兩個等位基因，則只需要設(shè)計兩條引物。

13、進一步，步驟(3)中，所述核酸外切酶為核酸外切酶iii和核酸外切酶i的組合。

14、進一步，步驟(3)中，公用引物fu-r的條數(shù)根據(jù)snp2位點的多態(tài)性數(shù)目決定，如有多條公用引物fu-r，每條公用引物fu-r的5’末端采用不同熒光標記。

15、本發(fā)明方法可針對單個樣本多個微單倍型通過多重擴增技術(shù)進行分析。根據(jù)不同的微單倍型，每個微單倍型snp1的探針序列是不同的(用于芯片雜交時物理區(qū)分不同的微單倍型)，但是snp2的編碼序列優(yōu)選設(shè)計為相同，以便于用熒光標記的引物擴增，每個微單倍型的f引物和r引物設(shè)計原則相同。多個微單倍型的分析：由于每個微單倍型snp1編碼序列不同，那么芯片上的探針就可以結(jié)合相應(yīng)的微單倍型序列，檢測序列所帶的熒光分子就可以讀取不同微單倍型連鎖關(guān)系。

16、本發(fā)明的有益效果：

17、1)在pcr過程中，先通過as-pcr把一個snp多態(tài)性位點信息獲取，然后再通過連接酶，把同一條鏈上的另一個snp位點信息獲取，由于這兩個位點信息都可在pcr或連接過程由dna序列所編碼，最終環(huán)上的信息可通過擴增后與預(yù)設(shè)計的dna芯片解碼，具有良好的應(yīng)用潛力。

18、2)本發(fā)明通過對多個微單倍型進行編碼，可實現(xiàn)多位點單樣本并行檢測的目標，因此，在醫(yī)療方面，特別是法醫(yī)鑒定方面具有潛在的應(yīng)用前景。

技術(shù)特征：

1.一種微單倍型的檢測分型方法，其特征在于，包括如下步驟：

2.如權(quán)利要求1所述微單倍型的檢測分型方法，其特征在于，步驟(1)中，所述f引物的p區(qū)的序列種類由snp1多態(tài)性種類決定，根據(jù)snp1位點的多態(tài)性，p區(qū)包括p1,p2...pm，相對應(yīng)的f引物包括f1,f2...fm，m代表需要設(shè)計的引物條數(shù)。

3.如權(quán)利要求1所述微單倍型的檢測分型方法，其特征在于，步驟(1)中，所述r引物包括r1,r2...rn，n代表需要設(shè)計的引物條數(shù)，其由snp2位點的多態(tài)性數(shù)目決定。

4.如權(quán)利要求1所述微單倍型的檢測分型方法，其特征在于，步驟(3)中，所述核酸外切酶為核酸外切酶iii和核酸外切酶i的組合。

5.如權(quán)利要求1或2或3或4所述微單倍型的檢測分型方法，其特征在于，步驟(3)中，公用引物fu-r的條數(shù)根據(jù)snp2位點的多態(tài)性數(shù)目決定，如有多條公用引物fu-r，每條公用引物fu-r的5’末端采用不同熒光標記。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種微單倍型的檢測分型方法，獲取待檢樣本的檢測位點SNP1和SNP2后，根據(jù)位點信息設(shè)計F引物和R引物，進行PCR擴增，獲得擴增產(chǎn)物后，將其純化、加熱變性，再冰上復(fù)性，加入DNA連接酶進行連接，得到連接產(chǎn)物，消化掉連接產(chǎn)物中未成環(huán)的DNA歐，再采用公用引物U?F和熒光標記的公用引物fU?R進行PCR擴增，得到熒光標記的PCR擴增產(chǎn)物，將其與設(shè)有能與編碼SNP1信息的序列相結(jié)合的探針的DNA芯片雜交，得到基因分型結(jié)果。該方法可以實現(xiàn)微單倍型的檢測分型，與現(xiàn)有方法相比，該方法成本低，分型結(jié)果準確，并且可實現(xiàn)多位點單樣本并行檢測的目標，在醫(yī)療方面，特別是法醫(yī)鑒定方面具有潛在的應(yīng)用前景。

技術(shù)研發(fā)人員：李海英,王晨虹,蒯錦霞,李燕強,包海軍
受保護的技術(shù)使用者：徐州醫(yī)科大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/8/20