本發(fā)明涉及一種犬瘟熱病毒重組抗原及其在制備犬瘟疫苗中的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥。

背景技術(shù)：

1、犬瘟俗稱“狗瘟”，是由犬瘟熱病毒(canine?distempervirus，cdv)引起犬的一種高度接觸性、致死性傳染病。這種病死亡率很高，一般成犬可達(dá)50％以上，小犬感染后死亡率甚至可達(dá)80％以上。犬瘟熱多發(fā)于冬春和秋冬寒冷季節(jié)，有一定的周期性，常3年1次大流行，目前呈世界性分布。

2、目前使用的犬瘟疫苗大致分為滅活疫苗和弱毒疫苗。滅活疫苗通常免疫效價低維持時間短，不易產(chǎn)生局部抗體，抗原量比較大，成本較高。而弱毒疫苗有很大的潛在安全問題。重組疫苗是基于基因工程技術(shù)，選擇目標(biāo)病原體的特定抗原蛋白基因，將其插入到表達(dá)載體中，并將表達(dá)載體導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中，表達(dá)目標(biāo)抗原蛋白，通過對抗原蛋白的純化和加工等步驟獲得高純度的重組疫苗。由于其安全性高、生產(chǎn)工藝成熟、可定制等優(yōu)勢在預(yù)防傳染病中發(fā)揮重要作用，但抗原基因的設(shè)計限制了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用。另外，重組疫苗也可以以dna或mrna疫苗形式實現(xiàn)，即將帶有特定抗原蛋白基因的表達(dá)載體(dna或mrna)直接引入動物體內(nèi)，通過在動物體內(nèi)表達(dá)產(chǎn)生的蛋白，刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。因為dna或mrna疫苗不需要純化抗原蛋白，疫苗的運輸和保存條件也相對簡單，大大降低了疫苗的成本，并加快了疫苗開發(fā)的速度。

3、病原學(xué)中犬瘟熱病毒(cdv)屬于副粘病毒科，麻疹病毒屬。除了犬科動物(包括狗、狐貍、狼等)，犬瘟病毒還能夠感染大熊貓、象科、大貓(如獅虎豹)、鼬科(雪貂、水獺等)、靈長類(如恒河猴、日本猴)等20多科的動物。cdv為單一負(fù)鏈rna病毒，長度約16000個核苷酸，主要編碼六個結(jié)構(gòu)蛋白，分別為核衣殼蛋白(n)、融合蛋白(f)、血凝蛋白(h)、基質(zhì)膜蛋白(m)、大蛋白(l)和磷蛋白(p)。其中的f和h是包膜蛋白，在病毒結(jié)合到細(xì)胞表面受體并侵入細(xì)胞的過程中起著決定性的作用。目前多采用cdv?h蛋白作為重組抗原目標(biāo)，但cdv?h蛋白容易漂移，變異速度快，因此現(xiàn)在也有一些報道開始以cdv?f蛋白作為重組抗原的新目標(biāo)。但是，野生型的f蛋白表達(dá)量低，且眾所周知，cdv表面的融合前f蛋白構(gòu)象具有更豐富的中和抗體表位，因此在疫苗的開發(fā)過程中更希望獲得相對穩(wěn)定的融合前構(gòu)象的抗原蛋白，而野生型的f蛋白一部分是融合前的構(gòu)象，一部分是融合后的構(gòu)象，這顯然不利于抗原的應(yīng)用。因此提出本發(fā)明。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種表達(dá)量高、穩(wěn)定性好、免疫原性強(qiáng)的重組抗原，該重組抗原能夠有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體，由該方法制備疫苗產(chǎn)品時操作簡單，穩(wěn)定、高效且質(zhì)量可控。

2、本發(fā)明的第一個目的是提供一種蛋白，所述蛋白相對于seq?id?no.1所示的氨基酸序列具有以下突變：

3、將第78位亮氨酸突變?yōu)榘腚装彼幔⒌?4位纈氨酸突變?yōu)榘腚装彼?ds)；或

4、將第171位絲氨酸突變?yōu)楦彼?s306p)；或

5、將第78位亮氨酸突變?yōu)榘腚装彼?，將?4位纈氨酸突變?yōu)榘腚装彼?，并將?71位絲氨酸突變?yōu)楦彼?ds?s306p)。

6、本發(fā)明的第二個目的是提供一種重組蛋白(本發(fā)明應(yīng)用場景下為重組抗原)，所述重組蛋白含有上述蛋白、以及輔助原件。

7、進(jìn)一步地，所述輔助原件包括但不限于輔助表達(dá)的信號肽、rbs等，也可以為輔助多聚體形成的多聚體形成序列。

8、進(jìn)一步地，信號肽序列如seq?id?no.2所示；多聚體形成序列如seq?id?no.3所示。

9、本發(fā)明的第三個目的是提供編碼上述蛋白或重組蛋白的核酸。

10、本發(fā)明的第四個目的是提供攜帶上述核酸的表達(dá)載體。

11、進(jìn)一步地，所述表達(dá)載體可為質(zhì)粒、核酸載體(如mrna)等等。

12、本發(fā)明的第五個目的是提供含有上述蛋白或重組蛋白的重組細(xì)胞。

13、進(jìn)一步地，宿主細(xì)胞為細(xì)菌、真菌或疫苗生產(chǎn)細(xì)胞，如cho細(xì)胞、293t細(xì)胞、293f細(xì)胞等。

14、本發(fā)明的第六個目的在于提供上述蛋白、重組蛋白、核酸、重組質(zhì)?；蛑亟M細(xì)胞在制備預(yù)防或治療犬瘟的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

15、本發(fā)明的第七個目的在于提供一種抗犬瘟熱病毒抗體，以上述蛋白或重組蛋白為免疫原制備得到。

16、上述蛋白或重組蛋白可用于制備或篩選抗犬瘟熱病毒抗體，包括但不限于單克隆抗體、雙特異性抗體等。

17、本發(fā)明的第八個目的是提供一種預(yù)防或治療犬瘟的產(chǎn)品(如疫苗)，產(chǎn)品中含有上述蛋白、重組蛋白、核酸、重組質(zhì)?；蛑亟M細(xì)胞。最優(yōu)選地，疫苗中包括上述蛋白或重組蛋白，當(dāng)然，還可以包括藥學(xué)上可接受的輔料，如佐劑。

18、最優(yōu)選地，疫苗為重組融合前三聚體蛋白疫苗，以c端融合三聚體底座序列(促進(jìn)重組抗原單體三聚體化)的ds?s306p為重組抗原。

19、本發(fā)明的第九個目的是提供一種生產(chǎn)cdv?f蛋白的方法，將編碼所述蛋白或重組蛋白的基因序列導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，于適當(dāng)條件下培養(yǎng)使其表達(dá)cdv?f蛋白。當(dāng)然，除了表達(dá)必需的原件如啟動子、終止子等，為了提高表達(dá)量，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在表達(dá)框中添加促進(jìn)表達(dá)的原件。

20、本發(fā)明的有益效果：

21、本發(fā)明通過cdv?f蛋白序列比對，篩選出潛在突變位點，并對cdv?f蛋白做了氨基酸取代。實驗證明，特定位點的兩種穩(wěn)定取代(二硫鍵、空腔填充)不但極大提升了cdv?f蛋白的表達(dá)水平(相對于野生型最高提升了30倍)，而且表達(dá)的f蛋白被鎖定在其融合前的構(gòu)象，從而為利用cdv?f蛋白作為重組疫苗和篩選治療性單抗提供了堅實的基礎(chǔ)。

技術(shù)特征：

1.一種蛋白，其特征在于，所述蛋白相對于seq?id?no.1所示的氨基酸序列具有以下突變：

2.一種重組蛋白，其特征在于，含有權(quán)利要求1所述蛋白。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組蛋白，其特征在于，還含有輔助原件，所述輔助原件包括多聚體形成序列。

4.編碼權(quán)利要求1所述蛋白或權(quán)利要求2或3所述重組蛋白的核酸。

5.攜帶權(quán)利要求4所述核酸的表達(dá)載體。

6.含有權(quán)利要求1所述蛋白或權(quán)利要求2或3所述重組蛋白的重組細(xì)胞。

7.一種抗犬瘟熱病毒抗體，其特征在于，以權(quán)利要求1所述蛋白或權(quán)利要求2或3所述重組蛋白為免疫原制備得到。

8.一種預(yù)防或治療犬瘟的產(chǎn)品，其特征在于，權(quán)利要求1所述蛋白、權(quán)利要求2或3所述重組蛋白、權(quán)利要求4所述核酸、權(quán)利要求5所述表達(dá)載體、權(quán)利要求6所述重組細(xì)胞或權(quán)利要求7所述抗體。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述產(chǎn)品為疫苗；所述疫苗為重組三聚體蛋白疫苗。

10.一種生產(chǎn)cdv?f蛋白的方法，其特征在于，將編碼權(quán)利要求1所述蛋白或權(quán)利要求2所述重組蛋白的基因序列導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，于適當(dāng)條件下培養(yǎng)使其表達(dá)cdv?f蛋白。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種犬瘟熱病毒重組抗原及其在制備犬瘟疫苗中的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一系列CDV?F蛋白突變體，其作為重組抗原時，于生產(chǎn)細(xì)胞中進(jìn)行重組表達(dá)，解決了現(xiàn)有野生型CDV?F蛋白表達(dá)量低的問題，同時，本發(fā)明的CDV?F蛋白突變體的構(gòu)象相對于野生型更穩(wěn)定，F(xiàn)蛋白被鎖定在其融合前的構(gòu)象，基于融合前構(gòu)象比融合后構(gòu)象能引發(fā)更強(qiáng)的中和免疫反應(yīng)，本發(fā)明的CDV?F蛋白突變體可以作為一種更好的疫苗抗原，在犬瘟熱病毒及其抗體等相關(guān)研究中具有巨大潛力。

技術(shù)研發(fā)人員：張爽
受保護(hù)的技術(shù)使用者：蘇州醫(yī)康貝生物技術(shù)有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/10