本發(fā)明屬于分子生物學(xué)dna標(biāo)記技術(shù)與應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及一種用于狼尾草屬牧草遺傳多樣性分析的srap分子標(biāo)記引物及其在狼尾草屬牧草遺傳多樣性分析中的應(yīng)用以及狼尾草屬牧草遺傳多樣性分析的方法。

背景技術(shù)：

1、相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(sequence-related?amplified?polymorphism，srap)是一種新型的基于pcr的標(biāo)記系統(tǒng)，為顯性標(biāo)記，是由美國加州大學(xué)蔬菜系li與quiros博士于2001年在蕓薹屬作物開發(fā)出來。該標(biāo)記具有簡便、高效、產(chǎn)率高、高共顯性、重復(fù)性好、易測序、便于克隆目標(biāo)片段的特點。目前已成功地應(yīng)用于作物遺傳多樣性分析、遺傳圖譜的構(gòu)建、重要性狀的標(biāo)記以及相關(guān)基因的克隆等方面。

2、狼尾草屬牧草作為世界重要牧草資源之一，主要包括象草、狼尾草、以及各種種間雜交品種(雜交狼尾草和雜交象草)等，狼尾草屬牧草在世界各地廣泛種植，并且育成的新品種也日漸增多，從而使得品種間發(fā)生了多樣的遺傳分化。這種情況下，傳統(tǒng)的分類法已經(jīng)很難識別這些品種，近年來研究者們也開始利用分子標(biāo)記技術(shù)對狼尾草屬牧草進(jìn)行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析。但目前為止未見到srap方法對狼尾草屬牧草品種進(jìn)行遺傳多樣性分析的研究報道。

3、本研究以20個狼尾草屬牧草品種為對象，利用合成的srap分子標(biāo)記引物，進(jìn)行srap研究其遺傳多樣性。以供狼尾草屬牧草種質(zhì)資源保護(hù)利用和新品種(系)的選育提供分子水平的參考。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種能夠用于狼尾草屬牧草遺傳多樣性分析的srap分子標(biāo)記引物體系及其狼尾草屬牧草遺傳多樣性分析的方法。

2、本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)：

3、一種用于狼尾草屬牧草遺傳多樣性分析的srap分子標(biāo)記引物，它包括8對引物，8對引物分別為：

4、me1-em5，其核苷酸序列如seq?id?no.1和seq?id?no.25所示；

5、me2-em3，其核苷酸序列如seq?id?no.2和seq?id?no.23所示；

6、me3-em5，其核苷酸序列如seq?id?no.3和seq?id?no.25所示；

7、me4-em3，其核苷酸序列如seq?id?no.4和seq?id?no.23所示；

8、me5-em2，其核苷酸序列如seq?id?no.5和seq?id?no.22所示；

9、me6-em7，其核苷酸序列如seq?id?no.6和seq?id?no.27所示；

10、me7-em2，其核苷酸序列如seq?id?no.2和seq?id?no.22所示；

11、me8-em2，其核苷酸序列如seq?id?no.8和seq?id?no.22所示。

12、本發(fā)明合成了多條srap引物并隨機(jī)分別選出20條正向引物和20條反向引物(引物序列見表2)，并進(jìn)行優(yōu)化，兩兩組合成400對引物組合，隨機(jī)抽取4個提取的dna模板樣品進(jìn)行引物組合篩選，最后篩選出上述8對引物。

13、本發(fā)明提供一種利用所述的srap分子標(biāo)記引物進(jìn)行狼尾草屬牧草遺傳多樣性分析的方法，采用所述的srap分子標(biāo)記引物對待檢測的狼尾草屬牧草樣品dna進(jìn)行擴(kuò)增、檢測和srap。具體包括以下步驟：

14、(1)采用ctab法提取待檢測樣品的dna備用；

15、(2)利用權(quán)利要求1所述的srap分子標(biāo)記引物對步驟(1)中提取的dna樣品進(jìn)行擴(kuò)增，分別得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物；

16、(3)將所述步驟(2)得到的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行凝膠電泳、成像后，得到對應(yīng)的譜帶信息；

17、(4)根據(jù)所述步驟(3)得到的譜帶信息對樣品進(jìn)行聚類分析，生成聚類圖。

18、步驟(2)中所述的pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系具體為：2.5μl?10xpcr?buffer、0.5μldntps、0.5μl?taq酶、引物各1μl和2μl模板dna，ddh2o補(bǔ)充到總體積25μl；

19、所述的引物為權(quán)利要求1中的所述me1-em5、me2-em3、me3-em5、me4-em3、me5-em2、me6-em7、me7-em2、me8-em2中的任意一對。

20、所述pcr擴(kuò)增的程序為：pcr程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min、35℃退火1min、72℃延伸1min，5個循環(huán)；94℃變性1min、50℃退火1min、72℃延伸1min，35個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10min，4℃保存。擴(kuò)增反應(yīng)在美國伯樂pcr儀上進(jìn)行。

21、所述引物可合成采用熒光引物，所有擴(kuò)增產(chǎn)物用熒光檢測。熒光引物的合成以及熒光檢測屬于本領(lǐng)域常規(guī)的檢測方法，在此不作贅述。

22、步驟(4)的具體方法為：

23、由自動測序儀377掃描得到的樣品凝膠圖，用genescan?3.1軟件分析樣品凝膠圖，通過binthere軟件提取樣品的各片段大小的結(jié)果；excel轉(zhuǎn)換將表內(nèi)的數(shù)值不為0轉(zhuǎn)換為1(即電泳圖譜上同一位置有條帶出現(xiàn)的記為1，同一位置沒有條帶出現(xiàn)的記為0)，數(shù)值為0的不轉(zhuǎn)換，從而生成由“1”和“0”組成的原始矩陣；用ntsyspc-2.11f軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；對原始矩陣用simqual程序求dice相似系數(shù)矩陣，并獲得相似系數(shù)矩陣；用shan程序中的upgma方法進(jìn)行聚類分析，并通過tree?plot模塊生成聚類圖。

24、所述的srap分子標(biāo)記引物在狼尾草屬牧草遺傳多樣性分析中的應(yīng)用。

25、較之現(xiàn)有技術(shù)而言，本發(fā)明的優(yōu)點在于：本發(fā)明合成了多條srap引物并隨機(jī)分別選出20條正向引物和20條反向引物，并進(jìn)行優(yōu)化，兩兩組合成400對引物組合，隨機(jī)抽取4個提取的dna模板樣品進(jìn)行引物組合篩選，最后篩選出8對srap分子標(biāo)記引物。這8對srap分子標(biāo)記引物擴(kuò)增條帶多、多態(tài)性豐富、亮度大、重復(fù)性好，可用于狼尾草屬牧草品種的遺傳多樣性分析。這8對srap分子標(biāo)記引物對20個狼尾草屬品種的pcr擴(kuò)增，共得到1278個位點，其中多態(tài)性位點有1273個，占總數(shù)的99.6％。如引物組合me1-em5擴(kuò)增得到的多態(tài)性位點最多達(dá)216個，引物組合me3-em5擴(kuò)增到的多態(tài)性位點最少有131個。平均位點數(shù)為159.8個，平均多態(tài)性位點數(shù)為159.1個?？梢钥闯鲞x取的這8對srap引物組合在狼尾草屬牧草上多態(tài)性極其豐富，可以進(jìn)行遺傳多樣性分析。

技術(shù)特征：

1.一種用于狼尾草屬牧草遺傳多樣性分析的srap分子標(biāo)記引物，其特征在于：包括8對引物，8對引物分別為：

2.一種利用權(quán)利要求1所述的srap分子標(biāo)記引物進(jìn)行狼尾草屬牧草遺傳多樣性分析的方法，其特征在于：采用權(quán)利要求1所述的srap分子標(biāo)記引物對待檢測的狼尾草屬牧草樣品dna進(jìn)行擴(kuò)增、檢測和分析。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：它包括以下步驟：

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：步驟(2)中所述的pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系具體為：2.5μl?10xpcr?buffer、0.5μl?dntps、0.5μl?taq酶、引物各1μl和1μl模板dna，ddh2o補(bǔ)充到總體積25μl；

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于：所述pcr擴(kuò)增的程序為：pcr程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min、35℃退火1min、72℃延伸1min，5個循環(huán)；94℃變性1min、50℃退火1min、72℃延伸1min，35個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10min，4℃保存。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：步驟(4)的具體方法為：

7.如權(quán)利要求1所述的srap分子標(biāo)記引物在狼尾草屬牧草遺傳多樣性分析中的應(yīng)用。

8.一種分析狼尾草屬牧草遺傳多樣性的試劑盒，其特征在于：它包括權(quán)利要求1所述的用于狼尾草屬牧草遺傳多樣性分析的srap分子標(biāo)記引物。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一種用于狼尾草屬牧草遺傳多樣性分析的SRAP分子標(biāo)記引物及其在狼尾草屬牧草遺傳多樣性分析中的應(yīng)用以及狼尾草屬牧草遺傳多樣性分析的方法；所述SRAP分子標(biāo)記引物，它包括8對引物，8對引物分別為：ME1?EM5，ME2?EM3，ME3?EM5，ME4?EM3，ME5?EM2，ME6?EM7，ME7?EM2，ME8?EM2，本發(fā)明篩選出的這8對SRAP分子標(biāo)記引物擴(kuò)增條帶多、多態(tài)性豐富、亮度大、重復(fù)性好，可用于狼尾草屬牧草品種的遺傳多樣性分析。這8對SRAP分子標(biāo)記引物對20個狼尾草屬品種的PCR擴(kuò)增，共得到1278個位點，其中多態(tài)性位點有1273個，占總數(shù)的99.6％。如引物組合ME1?EM5擴(kuò)增得到的多態(tài)性位點最多達(dá)216個，引物組合ME3?EM5擴(kuò)增到的多態(tài)性位點最少有131個。平均位點數(shù)為159.8個，平均多態(tài)性位點數(shù)為159.1個?？梢钥闯鲞x取的這8對SRAP引物組合在狼尾草屬牧草上多態(tài)性極其豐富，可以進(jìn)行遺傳多樣性分析。

技術(shù)研發(fā)人員：張曉佩,李文楊,劉遠(yuǎn),高承芳
受保護(hù)的技術(shù)使用者：福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/10