本發(fā)明涉及微生物應(yīng)用，特別是涉及一株貝萊斯芽孢桿菌cb6和所產(chǎn)的抗菌蛋白及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、隨著多藥耐藥菌的不斷出現(xiàn)及廣泛傳播，特別是泛耐藥病原菌可轉(zhuǎn)移耐藥基因的發(fā)現(xiàn)及擴散。多重耐藥大腸桿菌b2(escherichia?coli,e.coli?b2)作為引起人和動物腸道感染或尿道等多種局部器官感染的主要病原菌，其對多種抗生素均產(chǎn)生耐藥性，如對多粘菌素和碳青霉烯類等藥物耐藥，屬于革蘭氏陰性菌中最常見的病原體之一。在大腸桿菌的系統(tǒng)發(fā)育類群中，e.coli?b2類群同時含有腸外致病性大腸桿菌(expc)和腸致病性大腸桿菌(epec)菌株。目前，e.coli?b2已成為危害人和動物健康的重要病原菌。隨著該菌對臨床常用抗生素的耐藥性不斷增強，已給人類和動物養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失，同時也給臨床抗感染治療帶來了巨大的挑戰(zhàn)。

2、芽孢桿菌(bacillus)是一類常見的細(xì)菌，在其生長過程中可以產(chǎn)生多種具有抗菌活性的物質(zhì)，如抗生素、細(xì)菌素以及抗菌蛋白等，可以對其他細(xì)菌產(chǎn)生殺滅或抑制作用，有助于芽孢桿菌在競爭中取得生長優(yōu)勢，并保護其生存環(huán)境免受其他細(xì)菌的侵害?？咕鞍资且活惔嬖谟诙喾N生物體內(nèi)的天然防御分子，對微生物(如細(xì)菌、真菌以及病毒等)具有抗菌活性良好、抗菌譜廣和安全穩(wěn)定的優(yōu)點，對人類疾病具有治療潛力，被認(rèn)為是研發(fā)新型抗菌藥物的重要資源。目前微生物代謝產(chǎn)生的抗菌蛋白，雖然可以對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌在內(nèi)的多種病原菌產(chǎn)生廣譜的抵抗作用，但針對當(dāng)前臨床中革蘭氏陰性病原菌危害嚴(yán)重，且高度耐藥性問題，尚未有針對革蘭氏陰性菌，尤其是耐多粘菌素類和耐碳青霉烯類藥物的超級耐藥菌的新型抗菌蛋白類藥物。

3、基于此，探索具有針對耐多粘菌素和耐碳青霉烯類藥物的大腸桿菌等耐藥型革蘭氏陰性菌的抗菌蛋白，對臨床抗感染治療以及豐富當(dāng)前抗菌藥庫等具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一株貝萊斯芽孢桿菌cb6和所產(chǎn)的抗菌蛋白及應(yīng)用，以解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明自行分離出一株對多重耐藥大腸桿菌等革蘭氏陰性菌具有較好拮抗作用的貝萊斯芽孢桿菌cb6，以該菌發(fā)酵制備的抗菌蛋白cb6-e對多種革蘭氏陰性菌顯示出良好的抗菌活性，且對多種動物具有較好的安全性，有望豐富當(dāng)前已有的抗菌藥物庫，為治療多藥耐藥革蘭氏陰性菌的感染提供新希望。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了如下方案：

3、本發(fā)明提供一株產(chǎn)細(xì)菌素的貝萊斯芽孢桿菌(bacillus?velezensis)cb6，其于2024年5月7日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為cgmccno.30515。

4、本發(fā)明還提供一種抑制革蘭氏陰性菌的抗菌蛋白cb6-e，所述抗菌蛋白cb6-e由所述的貝萊斯芽孢桿菌cb6發(fā)酵獲得，氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

5、本發(fā)明還提供一種所述的抗菌蛋白cb6-e的制備方法，包括以所述的貝萊斯芽孢桿菌cb6進行接菌發(fā)酵，分別以硫酸銨沉降、透析截留和層析純化對發(fā)酵產(chǎn)物進行提取和純化，獲得所述細(xì)菌素cb6-e的步驟。

6、進一步地，所述發(fā)酵的溫度為28℃，發(fā)酵時間為48h；發(fā)酵初始ph為7.5。

7、進一步地，所述發(fā)酵是對所述貝萊斯芽孢桿菌cb6進行揺菌發(fā)酵，轉(zhuǎn)速為180rpm。

8、進一步地，所述硫酸銨的飽和度為90％。

9、本發(fā)明還提供所述的貝萊斯芽孢桿菌cb6或所述的抗菌蛋白cb6-e在制備抑制革蘭氏陰性細(xì)菌的藥物中的應(yīng)用。

10、進一步地，所述革蘭氏陰性細(xì)菌為多重耐藥的革蘭氏陰性細(xì)菌。

11、進一步地，所述多重耐藥的革蘭氏陰性細(xì)菌為耐多粘菌素和耐碳青霉烯類藥物的大腸桿菌。

12、本發(fā)明還提供一種抑制革蘭氏陰性細(xì)菌的藥物，有效成分為所述的抗菌蛋白cb6-e。

13、本發(fā)明公開了以下技術(shù)效果：

14、本發(fā)明自行分離出一株對多重耐藥大腸桿菌等革蘭氏陰性菌具有較好拮抗作用的貝萊斯芽孢桿菌cb6，經(jīng)過“硫酸銨沉降—500da透析袋截留—葡聚糖瓊脂糖交聯(lián)凝膠層析柱純化—deae-sephdex離子柱進一步純化”得到了抗菌蛋白cb6-e，該抗菌蛋白cb6-e對多種革蘭氏陰性菌均具有廣譜抗菌活性，特別是對耐藥型e.coli?b2、沙門氏菌和銅綠假單胞菌的殺菌活性最強，mic為32μg/ml。

15、本發(fā)明獲得的抗菌蛋白cb6-e對多種革蘭氏陰性菌顯示出良好的抗菌活性，且對多種動物具有較好的安全性，對感染多重耐藥大腸桿菌的小鼠和大蠟螟均具有良好的治療效果，其中20mg/kg的抗菌蛋白cb6-e可使感染多藥耐藥大腸桿菌的大蠟螟幼蟲和小鼠存活率分別提高60％和80％，其具有成為新型抗革蘭氏陰性菌藥物的潛力。

16、本發(fā)明以一株對多粘菌素和碳青霉烯類藥物耐藥的大腸桿菌b2作為指示菌篩選新型抗革蘭氏陰性菌的廣譜抗菌藥物。大腸桿菌b2為多重耐藥(耐多粘菌素和耐碳青霉烯類藥物)標(biāo)準(zhǔn)菌株，較其它耐藥菌具有更強的耐藥性，以該菌株作為指示菌篩選出的貝萊斯芽孢桿菌cb6，其產(chǎn)生的抗菌蛋白針對耐藥性革蘭氏陰性細(xì)菌的抑菌作用更強，效果更好。

17、本發(fā)明中貝萊斯芽孢桿菌cb6發(fā)酵制備的抗菌蛋白cb6-e有望豐富當(dāng)前已有的抗菌藥物庫，為治療多藥耐藥革蘭氏陰性菌的感染提供新希望。

技術(shù)特征：

1.一株產(chǎn)細(xì)菌素的貝萊斯芽孢桿菌(bacillus?velezensis)cb6，其特征在于，其于2024年5月7日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為cgmccno.30515。

2.一種抑制革蘭氏陰性菌的抗菌蛋白cb6-e，其特征在于，所述抗菌蛋白cb6-e由權(quán)利要求1所述的貝萊斯芽孢桿菌cb6發(fā)酵獲得，氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

3.一種如權(quán)利要求2所述的抗菌蛋白cb6-e的制備方法，其特征在于，包括以權(quán)利要求1所述的貝萊斯芽孢桿菌cb6進行接菌發(fā)酵，分別以硫酸銨沉降、透析截留和層析純化對發(fā)酵產(chǎn)物進行提取和純化，獲得所述細(xì)菌素cb6-e的步驟。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述發(fā)酵的溫度為28℃，發(fā)酵時間為48h；發(fā)酵初始ph為7.5。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述發(fā)酵是對所述貝萊斯芽孢桿菌cb6進行揺菌發(fā)酵，轉(zhuǎn)速為180rpm。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述硫酸銨的飽和度為90％。

7.權(quán)利要求1所述的貝萊斯芽孢桿菌cb6或權(quán)利要求2所述的抗菌蛋白cb6-e在制備抑制革蘭氏陰性細(xì)菌的藥物中的應(yīng)用。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述革蘭氏陰性細(xì)菌為多重耐藥的革蘭氏陰性細(xì)菌。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述多重耐藥的革蘭氏陰性細(xì)菌為多重耐藥大腸桿菌。

10.一種抑制革蘭氏陰性細(xì)菌的藥物，其特征在于，有效成分為權(quán)利要求2所述的抗菌蛋白cb6-e。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一株貝萊斯芽孢桿菌CB6和所產(chǎn)的抗菌蛋白及應(yīng)用，屬于微生物應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域。所述貝萊斯芽孢桿菌CB6的保藏編號為CGMCC?NO.30515。該菌株對多重耐藥大腸桿菌等革蘭氏陰性菌具有較好拮抗作用，以該菌發(fā)酵制備的抗菌蛋白CB6?E對多種革蘭氏陰性菌顯示出良好的抗菌活性，且對多種動物具有較好的安全性，CB6?E對感染耐多粘菌素和耐碳青霉烯類藥物大腸桿菌的小鼠和大蠟螟具有良好的治療效果。本發(fā)明以貝萊斯芽孢桿菌CB6發(fā)酵制備的抗菌蛋白CB6?E有望豐富當(dāng)前已有的抗菌藥物庫，為治療多藥耐藥革蘭氏陰性菌的感染提供新希望。

技術(shù)研發(fā)人員：張海朋,王塔錦,馬紅霞,孔令聰,劉曉宇,官麗莉,賀承光,陳敬蕊
受保護的技術(shù)使用者：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/9/9