本發(fā)明涉及分子標(biāo)記領(lǐng)域，具體涉及一種與鸚鵡精子活力和受精率相關(guān)的mirna及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、精子活力是指精液中呈直線前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子所占的百分率，通常用十分制表示。由于只有具有前進(jìn)運(yùn)動(dòng)的精子才可能具有正常的生存能力和授精能力，所以精子活力是評(píng)價(jià)種公鸚鵡繁殖潛力的首要指標(biāo)。精子活力對(duì)瀕危鸚鵡物種繁衍保護(hù)和觀賞性鸚鵡遺傳選育具有重要影響。尤其是隨著精液稀釋、儲(chǔ)存技術(shù)的發(fā)展以及人工授精技術(shù)的普及，優(yōu)秀種公鸚鵡的配種公母比可以達(dá)到1:50。因此，種公鸚鵡精子活力的高低對(duì)種蛋受精率的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于母鸚鵡。調(diào)查研究顯示，鸚鵡普遍存在精子活力偏低的情況，一定程度上影響了鸚鵡的繁衍和育種進(jìn)展。因此，提高種公鸚鵡精子活力是瀕危鸚鵡物種保護(hù)和觀賞性鸚鵡選育的重要目標(biāo)。

2、精子活力性狀的常規(guī)表型選擇方法有以下缺點(diǎn)：

3、1、測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)：精子活力性狀測(cè)定前，需要對(duì)種公鸚鵡進(jìn)行2-3周的采精訓(xùn)練；且由于穩(wěn)定性原因，每只公鸚鵡需要至少連續(xù)測(cè)定4次以上，每次測(cè)定間隔2天，甚至需要在不同的周齡進(jìn)行多次測(cè)定；

4、2、測(cè)定結(jié)果受到主觀因素影響較大：精子活力需要工作人員通過(guò)專(zhuān)業(yè)的相差顯微鏡進(jìn)行測(cè)定，個(gè)人的主觀判斷和對(duì)技術(shù)掌握的嫻熟程度將會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生一定的影響，降低準(zhǔn)確性；

5、3、計(jì)算機(jī)輔助精液質(zhì)量分析系統(tǒng)可以比較客觀測(cè)定精子活力性狀，但是目前相關(guān)分析軟件主要針對(duì)人、牛和豬等哺乳動(dòng)物。由于鸚鵡精子形態(tài)與哺乳動(dòng)物差異較大，主流的分析軟件不適用鸚鵡。單獨(dú)開(kāi)發(fā)用于鸚鵡精子活力分析的精液質(zhì)量分析系統(tǒng)價(jià)格昂貴；

6、以上缺點(diǎn)導(dǎo)致在公鸚鵡繁殖力的選育上存在測(cè)量不準(zhǔn)確、人力和物力耗費(fèi)巨大等問(wèn)題，增加選育成本，降低選育進(jìn)展。

7、mirna是一類(lèi)長(zhǎng)度21～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈小rna分子，具有在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)作用。研究表明，mirna在睪丸生殖細(xì)胞中廣泛表達(dá)，對(duì)精子發(fā)生和精子活力有關(guān)重要的調(diào)控作用。mirna和其調(diào)控的靶基因mrna通常呈負(fù)相關(guān)，因此通過(guò)對(duì)精子活力不同的鸚鵡睪丸組織中mirna和mrna表達(dá)譜進(jìn)行高通量測(cè)序和聯(lián)合分析，可以準(zhǔn)確的鎖定與精子活力性狀相關(guān)的mirna及關(guān)鍵基因。相關(guān)mirna可作為分子標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)性狀的早期和準(zhǔn)確選擇，加快精子活力性狀的選育進(jìn)展。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明主要針對(duì)上述技術(shù)問(wèn)題，提供一種與鸚鵡精子活力或受精率相關(guān)的mirna，所述mirna為mun-mir-215-5p，其核苷酸序列為5’-augaccuaugaauugacagac-5’(seq?idno.1)。

2、另一方面，本發(fā)明提供mun-mir-215-5p在調(diào)控鸚鵡精子活力中的應(yīng)用。

3、進(jìn)一步地，所述調(diào)控鸚鵡精子活力是通過(guò)提高mun-mir-215-5p的表達(dá)了實(shí)現(xiàn)的。

4、另一方面，本發(fā)明提供檢測(cè)鸚鵡精子活力或受精率的引物組，其特征在于，所述引物組包含目的mirna的上游引物序列5’-acactccagctgggttctga?acgagact-3’(seq?idno.2)，下游引物5’-tggtgtcgtggagtcg-3’(seq?id?no.3)，頸環(huán)引物序列5’-ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgaggtctgtca-3’(seq?id?no.4)，內(nèi)參上游引物5’-ctcgcttcggcagcaca-3’(seq?id?no.5)，內(nèi)參下游引物為5’-aacgcttcacgaatttgcgt-3’(seq?id?no.6)。

5、另一方面，本發(fā)明提供檢測(cè)鸚鵡精子活力或受精率的引物組另一組引物，所述引物包括檢測(cè)icam1基因的上游引物序列為5’-ccttcctcaccgtgtactgg-3’(seq?id?no.7)，下游引物序列為5’-agcgtagggtaaggttcttgc-3’(seq?id?no.8)，內(nèi)參基因上游引物序列為5’-atgcagcagatccgcatgt-3’(seq?id?no.9)，下游引物序列為5’-tcatggtgttcttgcccatca-3(seq?id?no.10)’。

6、另一方面，本發(fā)明提供一種檢測(cè)鸚鵡精子活力或受精率的熒光定量pcr試劑盒,所述試劑盒包含檢mun-mir-215-5p的引物組。

7、優(yōu)選的，所述試劑盒還包括檢測(cè)icam1基因的引物組。

8、進(jìn)一步的，所述試劑盒還包括反轉(zhuǎn)錄試劑和熒光定量pcr反應(yīng)液。

9、另一方面，本發(fā)明提供一種選育高精子活力或高受精率親本鸚鵡的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟:

10、1)利用前述的引物組或試劑盒檢測(cè)鸚鵡睪丸組織中mun-mir-215-5p的表達(dá)水平；

11、2)根據(jù)mun-mir-215-5p的表達(dá)水平進(jìn)行篩選高精子活力或高受精率親本鸚鵡。

12、進(jìn)一步地，所述步驟1)還包括如下步驟：

13、a)采集待測(cè)鸚鵡睪丸組織，并提取rna；

14、b)進(jìn)行mirna反轉(zhuǎn)錄；

15、c)利用前述引物組或試劑盒檢測(cè)鸚鵡睪丸組織中mun-mir-215-5p的表達(dá)水平。

16、進(jìn)一步地，所述步驟1)還包括如下步驟：

17、d)篩選標(biāo)準(zhǔn)為保留mun-mir-215-5p表達(dá)水平由高到低為前30％的個(gè)體作為高精子活力或高受精率親本鸚鵡。

18、另一方面，本發(fā)明提供前述引物組或試劑盒在預(yù)測(cè)鸚鵡精子活力或受精率親高低中的應(yīng)用。另一方面，本發(fā)明提供前述引物組或試劑盒在遺傳標(biāo)記輔助育種中選育高精子活力或高受精率親本鸚鵡的應(yīng)用。

19、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用單一分子標(biāo)記就能夠簡(jiǎn)單有效對(duì)鸚鵡的精力活力進(jìn)行預(yù)測(cè)，該標(biāo)記在高低精子活力的樣本間差異表達(dá)量達(dá)到5.8倍，從而可將該分子標(biāo)記在用于鸚鵡精子活力性狀相關(guān)的輔助選擇育種，降低了選育成本，提高了選育進(jìn)展。

技術(shù)特征：

1.mun-mir-215-5p在調(diào)控鸚鵡精子活力中的應(yīng)用，其特征在于，所述mirna的核苷酸序列為augaccuaugaauugacagac，所述調(diào)控鸚鵡精子活力是通過(guò)提高mun-mir-215-5p的表達(dá)了實(shí)現(xiàn)的。

2.用于檢測(cè)鸚鵡精子活力或受精率的引物組，其特征在于，所述引物組包含目的mirna的上游引物序列5’-acactccagctgggttctgaacgagact-3’，下游引物5’-tggtgtcgtggagtcg-3’，頸環(huán)引物序列5’-ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgaggtctgtca-3’，內(nèi)參上游引物5’-ctcgcttcggcagcaca-3’，內(nèi)參下游引物為5’-aacgcttcacgaatttgcgt-3’。

3.用于檢測(cè)鸚鵡精子活力或受精率的引物組，其特征在于，所述引物組包含檢測(cè)icam1基因的上游引物序列5’-ccttcctcaccgtgtactgg-3’，下游引物序列5’-agcgtagggtaaggttcttgc-3’，內(nèi)參基因上游引物序列5’-atgcagcagatccgcatgt-3’，下游引物序列5’-tcatggtgttcttgcccatca-3’。

4.一種檢測(cè)鸚鵡精子活力或受精率的熒光定量pcr試劑盒,所述試劑盒包含檢權(quán)利要求2所述引物組。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括權(quán)利要求3所述的引物組。

6.根據(jù)權(quán)利要求4～5任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括反轉(zhuǎn)錄試劑和熒光定量pcr反應(yīng)液。

7.一種選育高精子活力或高受精率親本鸚鵡的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟:

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟1)還包括如下步驟：

9.權(quán)利要求2～3任一項(xiàng)所述的引物組或權(quán)利要求4～5任一項(xiàng)所述的試劑盒在預(yù)測(cè)鸚鵡精子活力或受精率親高低中的應(yīng)用。

10.權(quán)利要求2～3任一項(xiàng)所述的引物組或權(quán)利要求4～5任一項(xiàng)所述的試劑盒在遺傳標(biāo)記輔助育種中選育高精子活力或高受精率親本鸚鵡的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及分子標(biāo)記領(lǐng)域，具體提供一種與虎皮鸚鵡(Melopsittacus?undulatus)精子活力和受精率相關(guān)的miRNA及其應(yīng)用。本發(fā)明利用篩選到調(diào)控鸚鵡精子活力性狀相關(guān)的miRNA，所述miRNA可以作為與鸚鵡精子活力相關(guān)的分子標(biāo)記，在鸚鵡精子活力性狀的遺傳選育中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)研發(fā)人員：謝梅英,侯連杰,江炘垠,柯碧英,梁曉婷,王琳,徐諳為,胡瑾,李靜
受保護(hù)的技術(shù)使用者：廣東生態(tài)工程職業(yè)學(xué)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/9/9