本發(fā)明涉及生物材料，具體涉及一種基于微流控的大孔細(xì)胞培養(yǎng)微載體的制備方法。

背景技術(shù)：

1、隨著醫(yī)療、生物行業(yè)的發(fā)展，許多細(xì)胞諸如人源性干細(xì)胞、胰島β細(xì)胞等的大規(guī)模培養(yǎng)受到了人們廣泛的關(guān)注。三維細(xì)胞培養(yǎng)比起傳統(tǒng)的二維細(xì)胞培養(yǎng)能夠?yàn)榧?xì)胞提供更多的生長(zhǎng)空間，能夠模擬微環(huán)境給細(xì)胞提供氧氣、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等，提高了細(xì)胞的培養(yǎng)效率。在這樣的培養(yǎng)環(huán)境中，大孔微載體比實(shí)心微載體的比表面積大，能為細(xì)胞提供更多的生長(zhǎng)空間，且細(xì)胞在孔內(nèi)生長(zhǎng)，能減小剪切力對(duì)細(xì)胞的損傷。

2、大孔微載體的制備方法有在微流體裝置中利用甲基丙烯酰胺基明膠光固化后干燥形成尺寸均一、生物相容性好的微球(cn115804758a)；也有通過犧牲模板法，固化后得到多孔水凝膠微球結(jié)構(gòu)(cn113755425a)?，F(xiàn)有技術(shù)路線中單純依靠水凝膠干燥形成的大孔結(jié)構(gòu)存在一定的隨機(jī)性，而犧牲模板法大多依賴于界面能形成內(nèi)腔，在固化之前并不穩(wěn)定，且需要三相互相剪切工藝復(fù)雜。因此，亟需提供一種基于微流控的大孔細(xì)胞培養(yǎng)微載體的制備方法來解決現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明提供一種新的制備大孔微載體的方法，本方法提供一種簡(jiǎn)便的犧牲模板法，所制備的大孔微載體粒徑均勻、內(nèi)腔穩(wěn)定可調(diào)節(jié)。

2、本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：

3、一種基于微流控的大孔細(xì)胞培養(yǎng)微載體的制備方法，包括以下步驟：

4、步驟一，微流控液滴模板微球的制備：以主體材料及模板微球的混合液作為內(nèi)相，油相作為外相；通過調(diào)節(jié)內(nèi)、外相溶液的流速，形成油包水的液滴模板微球；

5、步驟二，主體材料的固化：將步驟一制備得到的液滴模板微球在紫外光下照射，聚合內(nèi)相溶液；或者是，將步驟一制備得到的液滴模板微球放入固化液中，獲得穩(wěn)定的大孔微載體產(chǎn)物；步驟三，模板微球的去除：將步驟二制備得到的產(chǎn)物干燥后，放入溶液中去除模板微球；或者是，將步驟二制備得到的產(chǎn)物放入溶液中去除模板微球后進(jìn)行干燥，得到所述的大孔細(xì)胞培養(yǎng)微載體。

6、本發(fā)明涉及的細(xì)胞培養(yǎng)大孔微載體包括主體材料層和微球內(nèi)腔：以微球作為犧牲模板，混入主體材料層，基于微流控技術(shù)制備粒徑均一的液滴，待主體材料固化后，去除犧牲模板，以制備粒徑均一、內(nèi)腔數(shù)量及大小可調(diào)節(jié)的大孔微載體。

7、本發(fā)明所述制備方法由三個(gè)步驟組成；

8、步驟一，微流控液滴模板微球的制備：以主體材料及模板微球的混合液作為內(nèi)相，油相作為外相；通過調(diào)節(jié)內(nèi)、外相溶液的流速，利用液體的剪切力形成油包水的液滴模板微球；具體的同時(shí)向裝置內(nèi)通入內(nèi)相溶液和外相溶液，調(diào)節(jié)溶液流速，使得外相溶液在內(nèi)相毛細(xì)管尖端產(chǎn)生剪切力，促使內(nèi)相溶液成為液滴微球，后液滴微球通過收集管離開裝置。

9、所述主體材料包括但不限于膠原、殼聚糖、海藻酸鹽、瓊脂糖、聚甲基丙烯酸羥乙酯、微晶纖維素、聚乙二醇二丙烯酸酯、甲基丙烯酰明膠、丙烯酰胺、n-異丙基丙烯酰胺中的一種或多種；所述模板微球包括但不限于聚苯乙烯微球、二氧化硅微球、三聚氰胺微球中的一種或多種；所述油相包括但不限于液體石蠟、硅油、礦物油、氟化油、棕櫚油中的一種或多種；

10、步驟二，主體材料的固化：將步驟一制備得到的液滴模板微球在紫外光下照射，聚合內(nèi)相溶液；或者是，將步驟一制備得到的液滴模板微球放入固化液中，獲得穩(wěn)定的大孔微載體架構(gòu)；內(nèi)相溶液聚合是主體材料聚合，模板微球的優(yōu)勢(shì)是穩(wěn)定，不參與聚合反應(yīng)。

11、所述固化液包括但不限于戊二醛、乙醇、鈣離子溶液、堿液、酸液中的一種或多種；所述鈣離子溶液為水溶液，包括但不限于氯化鈣、硝酸鈣、磷酸鈣、硫酸鈣中的一種或多種，堿液包括但不限于氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨水、碳酸鈉中的一種或多種；酸液包括但不限于甲酸、乙酸、鹽酸、硫酸、硝酸、磷酸中的一種或多種。

12、步驟三，模板微球的去除：將步驟二制備得到的產(chǎn)物干燥后，放入溶液中去除模板微球；或者是，將步驟二制備得到的產(chǎn)物放入溶液中去除模板微球后進(jìn)行干燥；

13、所述溶液包括但不限于甲苯、二氯甲烷、丙酮、n,n-二甲基甲酰胺、氫氟酸、乙酸、甲酸、鹽酸、磷酸、堿液中的一種或多種。

14、步驟一，微流控液滴模板微球的制備：以主體材料及模板微球的混合液作為內(nèi)相，油相作為外相；通過調(diào)節(jié)內(nèi)、外相溶液的流速，利用液體的剪切力形成油包水的液滴模板微球；

15、優(yōu)選的，主體材料的濃度為2wt％～5wt％，水溶液；

16、優(yōu)選的，模板微球的濃度為1mg/ml～10mg/ml；

17、優(yōu)選的，若模板微球?yàn)榫郾揭蚁┪⑶?，其粒徑?00nm～70um；

18、優(yōu)選的，若模板微球?yàn)槎趸栉⑶?，其粒徑?0nm～20um；

19、優(yōu)選的，若模板微球?yàn)槿矍璋肺⑶?，其粒徑?00nm～15um；

20、優(yōu)選的，內(nèi)相的流速為0.1ml/h～1ml/h；

21、優(yōu)選的，外相的流速為1.5ml/h～30ml/h；

22、步驟二，主體材料的固化：將步驟一制備得到的液滴模板微球在紫外光下照射，聚合內(nèi)相溶液；或者是，將步驟一制備得到的液滴模板微球放入固化液中，獲得穩(wěn)定的大孔微載體架構(gòu)；

23、優(yōu)選的，紫外光照射時(shí)間為20s～120s；

24、優(yōu)選的，固化時(shí)間為1min～5min；

25、步驟三，模板微球的去除：將步驟二制備得到的產(chǎn)物干燥后，放入溶液中去除模板微球；或者是，將步驟二制備得到的產(chǎn)物放入溶液中去除模板微球后進(jìn)行干燥；

26、優(yōu)選的，溶解模板微球的時(shí)間為30min～120min；

27、優(yōu)選的，溶解模板微球的溫度為20℃～40℃。

28、本發(fā)明第二個(gè)目的是所述的微載體在細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用。

29、本發(fā)明的有益效果在于：大孔微載體的內(nèi)腔尺寸分布廣，可從幾十納米到幾十微米，且孔徑和數(shù)量能夠通過模板微球的大小和濃度進(jìn)行調(diào)控；本發(fā)明延用犧牲模板法，以粒徑均一球形度好的單分散納/微米尺度的微球作為犧牲模板，僅需兩相微流控，即可獲得內(nèi)腔，并使得大孔結(jié)構(gòu)在整個(gè)工藝過程中穩(wěn)定，有利于進(jìn)一步控制內(nèi)腔的數(shù)量和大小，且內(nèi)腔的形貌不受流速等條件改變。本發(fā)明涉及到的大孔微載體制備方法簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)易、尺寸可控、可穩(wěn)定量產(chǎn)。

技術(shù)特征：

1.一種基于微流控的大孔細(xì)胞培養(yǎng)微載體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟一中，主體材料選自膠原、殼聚糖、海藻酸鹽、瓊脂糖、聚甲基丙烯酸羥乙酯、微晶纖維素、聚乙二醇二丙烯酸酯、甲基丙烯酰明膠、丙烯酰胺、n-異丙基丙烯酰胺中的一種或多種；所述模板微球選自聚苯乙烯微球、二氧化硅微球、三聚氰胺微球中的一種或多種；所述油相選自液體石蠟、硅油、氟化油、棕櫚油中的一種或多種。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟二中，固化液選自戊二醛、乙醇、鈣離子溶液、堿液、酸液中的一種或多種。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟三中，所述溶液選自甲苯、二氯甲烷、丙酮、n,n-二甲基甲酰胺、氫氟酸、乙酸、甲酸、鹽酸、磷酸、堿液中的一種或多種。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟一中主體材料的濃度為2wt％～5wt％，模板微球的濃度為1mg/ml～10mg/ml。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述模板微球?yàn)榫郾揭蚁┪⑶驎r(shí)，其粒徑為100nm～70μm，或所述模板微球?yàn)槎趸栉⑶驎r(shí)，其粒徑為50nm～20μm，或所述模板微球?yàn)槿矍璋肺⑶?，其粒徑?00nm～15μm。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟一中，內(nèi)相的流速為0.1ml/h～1ml/h；外相的流速為1.5ml/h～30ml/h。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟二中紫外光照射時(shí)間為20s～120s，固化時(shí)間為1min～5min。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟三中去除模板微球的時(shí)間為30min～120min，溶解模板微球的溫度為20℃～40℃。

10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的制備方法得到的微載體在細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一種基于微流控的大孔細(xì)胞培養(yǎng)微載體的制備方法，屬于生物材料技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及的細(xì)胞培養(yǎng)大孔微載體包括主體材料層和微球內(nèi)腔：以微球作為犧牲模板，混入主體材料層，基于微流控技術(shù)制備粒徑均一的液滴，待主體材料固化后，去除犧牲模板，以制備粒徑均一、內(nèi)腔數(shù)量及大小可調(diào)節(jié)的大孔微載體。

技術(shù)研發(fā)人員：陳思語,張文冬,曹飛婷
受保護(hù)的技術(shù)使用者：南京伯儀生物科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/10