本發(fā)明屬于植物分子育種，具體涉及水稻籽粒鎘含量相關(guān)基因yzcd1的snp分子標(biāo)記的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、近年來(lái)，全基因組關(guān)聯(lián)分析作為一種有效的基因定位工具，已經(jīng)成為當(dāng)前研究生物基因組的先進(jìn)方法之一。全基因組關(guān)聯(lián)分析不僅適用于單基因控制的性狀，還適用于復(fù)雜的數(shù)量性狀由多基因進(jìn)行控制的研究，并且在數(shù)量性狀上具有很大的優(yōu)勢(shì)。snp作為第三代分子標(biāo)記檢測(cè)體系，具有高密度、遺傳穩(wěn)定性高、操作簡(jiǎn)便、效率高、成本低等優(yōu)勢(shì)。對(duì)于抗病性相關(guān)的復(fù)雜的數(shù)量性狀，非常適合利用全基因組關(guān)聯(lián)分析的方法，對(duì)抗性相關(guān)的遺傳位點(diǎn)進(jìn)行初步定位。

2、重金屬污染具有復(fù)雜隱蔽性、危害持久性，尤其可能通過(guò)食物鏈的富集作用危及人類健康。其中鎘是對(duì)環(huán)境毒性最大的重金屬元素之一，對(duì)水稻等糧食作物的安全生產(chǎn)構(gòu)成嚴(yán)重威脅。稻米中鎘含量超標(biāo)會(huì)嚴(yán)重影響人體健康，長(zhǎng)期攝入高鎘稻米會(huì)誘發(fā)腎臟慢性中毒、骨質(zhì)疏松、脊柱變形等多種疾病。目前，可用于鎘低積累新品種選育的分子標(biāo)記較少，這些標(biāo)記的使用需要繁瑣的凝膠電泳檢測(cè)，自動(dòng)化程度低通量小，因此，急需發(fā)掘使用簡(jiǎn)單、自動(dòng)化程度高的snp位點(diǎn)，加快鎘低積累新品種的選育進(jìn)程。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供水稻籽粒鎘含量相關(guān)基因yzcd1的snp分子標(biāo)記的應(yīng)用。

2、本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：

3、本發(fā)明第一方面的目的，提供一種水稻籽粒鎘含量相關(guān)的snp分子標(biāo)記，所述snp分子標(biāo)記的基因位于水稻第7號(hào)染色體上seq?id?no.1的第2559位核苷酸，多態(tài)性為t或c。

4、本發(fā)明提供的如seq?id?no.1所示的dna分子，該dna分子作為檢測(cè)靶標(biāo)?？蓪z測(cè)所述snp位點(diǎn)多態(tài)性和基因型的物質(zhì)與其他物質(zhì)(如檢測(cè)其他與水稻籽粒鎘含量相關(guān)的分子標(biāo)記的單核苷酸多態(tài)性或基因型的物質(zhì))聯(lián)合在一起制備鑒定水稻籽粒鎘含量的產(chǎn)品。

5、本發(fā)明第二方面的目的，提供一種產(chǎn)品，包含上述的水稻籽粒鎘含量相關(guān)的snp分子標(biāo)記的物質(zhì)。

6、所述物質(zhì)可為通過(guò)下述至少一種方法確定所述snp位點(diǎn)的多態(tài)性或基因型所需的試劑和/或儀器：dna測(cè)序、限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性、單鏈構(gòu)象多態(tài)性、變性高效液相色譜和snp芯片。其中，snp芯片包括基于核酸雜交反應(yīng)的芯片、基于單堿基延伸反應(yīng)的芯片、基于等位基因特異性引物延伸反應(yīng)的芯片、基于“一步法”反應(yīng)的芯片、基于引物連接反應(yīng)的芯片、基于限制性內(nèi)切酶反應(yīng)的芯片、基于蛋白dna結(jié)合反應(yīng)的芯片，及基于熒光分子dna結(jié)合反應(yīng)的芯片。

7、作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述產(chǎn)品包含用于擴(kuò)增上述的與水稻籽粒鎘含量相關(guān)的snp分子標(biāo)記的引物組合物。

8、作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述引物組合物由引物a、引物b和引物c組成，

9、所述引物a的核苷酸序列如seq?id?no.2所示；

10、所述引物b的核苷酸序列如seq?id?no.3所示；

11、所述引物c的核苷酸序列如seq?id?no.4所示。

12、上述產(chǎn)品中，所述引物組合物可被標(biāo)記物標(biāo)記也可不被標(biāo)記物標(biāo)記。所述標(biāo)記物指可用于提供可檢測(cè)的效果且可以連接至核酸的任何原子或分子。標(biāo)記物包括但不限于染料；放射性標(biāo)記，諸如32p；結(jié)合部分，諸如生物素(biotin)；半抗原，諸如地高辛(dig)；發(fā)光、發(fā)磷光或發(fā)熒光部分；和單獨(dú)的熒光染料或與可以通過(guò)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fret)抑制或移動(dòng)發(fā)射光譜的部分組合的熒光染料。標(biāo)記可以提供可通過(guò)熒光、放射性、比色、重量測(cè)定、x射線衍射或吸收、磁性、酶活性等檢測(cè)的信號(hào)。標(biāo)記可以是帶電荷的部分(正電荷或負(fù)電荷)或可選地，可以是電荷中性的。標(biāo)記可以包括核酸或蛋白序列或由其組合，只要包含標(biāo)記的序列是可檢測(cè)的。在一些實(shí)施方案中，所述引物a的核苷酸序列如seq?id?no.2所示；所述引物b的核苷酸序列如seq?id?no.3所示；所述引物c的核苷酸序列如seq?id?no.4所示。核酸在沒(méi)有標(biāo)記的情況下直接檢測(cè)(例如，直接讀取序列)。如所述引物組合物可為由核苷酸序列是seq?id?no.5的第22-45位的單鏈dna、核苷酸序列是seq?id?no.6的第22-47位的單鏈dna和核苷酸序列是seq?id?no.4的單鏈dna組成的引物組合物。序列表中seq?idno.5由45個(gè)核苷酸組成，第1-21位核苷酸為fam序列(作為標(biāo)記物)，第22-45位核苷酸為特異序列；序列表中seq?id?no.6由47個(gè)核苷酸組成，第1-21位核苷酸為hex序列(作為標(biāo)記物)，第22-47位核苷酸為特異序列。

13、本發(fā)明第三方面的目的，提供一種試劑盒，包含權(quán)利要求3或4所示的引物組合物。

14、本發(fā)明第四方面的目的，提供上述的與水稻籽粒鎘含量相關(guān)的snp分子標(biāo)記、上述的產(chǎn)品、上述的試劑盒在(1)-(8)中任一種中的應(yīng)用：

15、(1)鑒定或輔助鑒定水稻籽粒鎘含量；

16、(2)篩選或選育水稻籽粒鎘含量低的水稻單株或株系或品系或品種；

17、(3)篩選或選育水稻籽粒鎘含量高的水稻單株或株系或品系或品種；

18、(4)水稻育種；

19、(5)制備鑒定或輔助鑒定水稻籽粒鎘含量的產(chǎn)品；

20、(6)制備篩選或選育籽粒鎘含量低的水稻單株或株系或品系或品種的產(chǎn)品；

21、(7)制備篩選或選育籽粒鎘含量高的水稻單株或株系或品系或品種的產(chǎn)品；

22、(8)制備水稻育種的產(chǎn)品。

23、本發(fā)明第五方面的目的，提供一種鑒定或輔助鑒定水稻籽粒鎘含量的方法，檢測(cè)待測(cè)水稻基因組中權(quán)利要求1所述的與水稻籽粒鎘含量相關(guān)的snp分子標(biāo)記的基因型，根據(jù)待測(cè)水稻的基因型鑒定或輔助鑒定水稻籽粒鎘含量：

24、所述snp的基因型為cc的待測(cè)水稻為或候選為水稻籽粒鎘含量低的水稻；

25、所述snp的基因型為tt的待測(cè)水稻為或候選為水稻籽粒鎘含量高的水稻。

26、作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述檢測(cè)待測(cè)水稻基因組中與水稻籽粒鎘含量相關(guān)的snp分子標(biāo)記的基因型的方法為：

27、(1)以待測(cè)水稻的基因組dna為模板，采用權(quán)利要求5中所述試劑盒中的引物組合物進(jìn)行kasp；

28、(2)待kasp檢測(cè)pcr反應(yīng)程序結(jié)束后，進(jìn)行熒光檢測(cè)，確定待測(cè)水稻的與水稻籽粒鎘含量相關(guān)的snp分子標(biāo)記的基因型。具體為：待kasp檢測(cè)pcr反應(yīng)程序結(jié)束后，將96孔板放置到omega熒光信號(hào)閱讀儀和araya上將熒光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)榭煞治龅臄?shù)值，然后用lgc公司提供的分析軟件krakentm進(jìn)行基因型分析。

29、作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述kasp的反應(yīng)體系為：模板溶液1.5μl、引物工作液0.0417μl、2×master?mix?0.75μl、無(wú)菌超純水0.75μl；其中，所述引物工作液為：引物a?12μl、引物b12μl、引物c?30μl、ddh2o?46μl，3條引物的濃度均為100mm；

30、kasp的反應(yīng)程序?yàn)椋?/p>

31、第一步：94℃預(yù)變性15min；

32、第二步：94℃20s、61℃60s，94℃20s、60.4℃60s，94℃20s、59.8℃60s，94℃20s、59.2℃60s，94℃20s、58.6℃60s，94℃20s、58℃60s，94℃20s、57.4℃60s，94℃20s、56.8℃60s，94℃20s、56.2℃60s，94℃20s、55.6℃60s；

33、第三步：94℃變性20s、55℃退火60s，5個(gè)循環(huán)；若分型不明顯，再增加5個(gè)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)展；第四步：94℃20s、退火57℃60s，26個(gè)循環(huán)。

34、本發(fā)明第六方面的目的，提供一種水稻育種方法，檢測(cè)水稻基因組中權(quán)利要求1所述snp的基因型，選擇所述snp的基因型為cc的水稻作為親本進(jìn)行育種，所述cc是所述snp位點(diǎn)為c的純合型，選育籽粒鎘含量低的水稻；選擇所述snp的基因型為tt的水稻作為親本進(jìn)行育種，所述tt是所述snp位點(diǎn)為t的純合型，選育籽粒鎘含量高的水稻。

35、本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

36、(1)本發(fā)明公開(kāi)了水稻籽粒鎘含量相關(guān)基因yzcd1的snp分子標(biāo)記，所述snp分子標(biāo)記的基因位于水稻第7號(hào)染色體上seq?id?no.1的第2559位核苷酸，其為t或c。實(shí)驗(yàn)證明，基因型為cc的水稻品種的籽粒鎘含量平均值為0.29mg/kg，基因型為tt的水稻品種的籽粒鎘含量平均值為0.60mg/kg，基因型cc的水稻品種的籽粒鎘含量顯著低于基因型tt的水稻品種的水稻籽粒鎘含量，說(shuō)明本發(fā)明的tagsnp-7501871是水稻籽粒鎘含量相關(guān)的snp分子標(biāo)記。

37、(2)本發(fā)明還提供了一種引物組合物，還提供了利用引物組合物鑒定或輔助鑒定水稻籽粒鎘含量的方法。本發(fā)明建立的方法可用于預(yù)測(cè)水稻籽粒鎘含量，可以對(duì)待篩選水稻進(jìn)行早期篩選，可用于水稻分子標(biāo)記輔助育種，在發(fā)掘籽粒鎘含量低的水稻種質(zhì)資源和選育籽粒鎘含量低的水稻品種的研究中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。