本發(fā)明屬于微生物降解領域。具體涉及一種路氏腸桿菌t977及其分離方法和在降解煙葉淀粉的應用。

背景技術：

1、淀粉是煙葉中重要的有機化合物，其含量過高會產(chǎn)生焦糊氣味以及多種有害成分，對煙草制品的感官質(zhì)量產(chǎn)生不良影響。相較于國外優(yōu)質(zhì)煙葉，中國煙葉淀粉含量普遍偏高。研究表明，一定范圍內(nèi)，煙葉感官質(zhì)量隨淀粉含量的下降而提升，因此利用適宜的方法降解煙葉淀粉對提升煙葉品質(zhì)具有重要意義。

2、大量研究表明，微生物法降解煙葉淀粉可顯著提升煙葉品質(zhì)。淀粉酶是催化水解淀粉糖苷鍵的酶類統(tǒng)稱，全稱為1，4-α-d-葡聚糖水解酶，可分為a-淀粉酶、β-淀粉酶以及γ-淀粉酶。淀粉酶能夠催化水解淀粉和糖原，生成葡萄糖、麥芽糖和具有α-1，6-糖苷鍵支鏈的糊精，在食品、醫(yī)藥、紡織和飼料等領域應用較為廣泛。

3、淀粉酶主要存在于動物、植物及微生物中，目前大多數(shù)以微生物來源淀粉酶應用最為廣泛,通過篩選煙葉中的淀粉酶高產(chǎn)菌株并進行發(fā)酵條件優(yōu)化，提高菌株酶活及煙葉淀粉降解率，對煙用微生物的工業(yè)應用及提升煙葉品質(zhì)具有一定指導意義。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種路氏腸桿菌t977及其分離方法，通過分離獲得的enterobacterludwigii?t977，該菌株具有顯著的淀粉降解能力，為煙葉淀粉降解提供更多高效菌株選擇。

2、本發(fā)明還提供一種路氏腸桿菌t977針對田間煙葉淀粉降解的處理方法，田間噴施處理能夠使淀粉的含量下降，總糖含量增加，為高淀粉含量煙葉的提質(zhì)提供了一種新的有效技術手段。本發(fā)明提供的路氏腸桿菌t977尤其用于降解云煙97煙葉淀粉，效果顯著。

3、本發(fā)明具體技術方案如下：

4、一種路氏腸桿菌t977，保藏編號：cctcc?m?20232627，所述路氏腸桿菌t977已經(jīng)于2023年12月22日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為湖北省武漢市武昌區(qū)八一路299號武漢大學，建議的分類命名為enterobacter?ludwigii(pantoea?agglomerans)。

5、路氏腸桿菌，拉丁文學名：enterobacter?ludwigii。

6、所述路氏腸桿菌t977菌株的16s?rdna的核苷酸序列如seq?id?no：1所示。

7、所述路氏腸桿菌t977的菌落呈現(xiàn)白色，半透明、邊緣整齊、中央與邊緣顏色一致，濕潤，凸起，易挑取菌落為乳白色，在顯微鏡下該菌株呈桿狀，有芽孢，適宜生長溫度為32℃～37℃，適宜ph范圍為ph?5～7。

8、本發(fā)明提供的一種路氏腸桿菌t977的分離方法，具體為：取云煙97葉片煙葉均勻部位，切取5×5mm的組織塊，將5g剪碎煙葉裝入250ml三角瓶中，加入已滅菌的100ml0.1％淀粉水溶液，擴大培養(yǎng)24h，取100μl菌液涂布接種于淀粉固體培養(yǎng)基上，放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后進行觀察，在長出的菌落上滴加盧戈氏碘液，挑取透明圈直徑較大的菌落，采用劃線法進行分離純化；分離純化后的菌株再次使用盧戈氏碘液確定其產(chǎn)淀粉酶活性，并測量菌株的淀粉透明圈直徑和菌落直徑，計算其比值；純化后的菌株采用15％無菌甘油管及平板保藏。純化后的菌落挑取接種于lb液體培養(yǎng)基中，于30℃進行振蕩培養(yǎng)擴繁。獲得的菌液與25％的甘油溶液混合，保持細菌菌液終濃度為18％～25％，并置于-80℃冰箱保存。

9、路氏腸桿菌enterobacter?ludwigii?t977通過16s?rdna鑒定引物pcr擴增測序，進行ncbi的blast比對，表明其與enterobacter?ludwigii?strain?en-119遺傳距離最近，僅為-0.00024，通過用鄰接法構建的進化樹顯示的結果，結合16s?rdna序列及細菌顯微形態(tài)，最終鑒定為路氏腸桿菌enterobacter?ludwigii?t977。

10、本發(fā)明提供的一種路氏腸桿菌t977在降解煙葉淀粉的應用，用于降解煙葉淀粉；尤其用于降解云煙97淀粉。

11、用于降解煙葉淀粉的方法為：將路氏腸桿菌t977進行發(fā)酵培養(yǎng)，取發(fā)酵后的菌液對田間旺長期煙葉進行噴施。

12、所述發(fā)酵培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基為：牛肉膏1.0g，乙酸銨0.25g，蛋白胨3.0g，氯化鈉5.0g，淀粉2.5g，自來水定容至1000ml，ph調(diào)至6。

13、所述發(fā)酵培養(yǎng)，路氏腸桿菌t977在培養(yǎng)基中添加質(zhì)量百分比為0.5％-1％，發(fā)酵條件為30℃-37℃，36-48h。

14、所述噴施，以菌液1×104cfu/ml～3×104cfu/ml濃度按照50l～60l量/畝進行噴施。

15、所述噴施，在采收前一個月開始噴，每隔10天噴施一次，烘烤采收前共噴施3次。

16、優(yōu)選的，將路氏腸桿菌t977制成菌劑，用于降解煙葉淀粉，具體方法為：

17、1)活化菌種：將菌株路氏腸桿菌t977至于na平板上，30℃培養(yǎng)18h-24h；

18、2)制備種子液：刮取步驟1)中菌體，接種于t977液體培養(yǎng)基，牛肉膏1.0g，乙酸銨0.25g，蛋白胨3.0g，氯化鈉5.0g，淀粉2.5g，自來水定容至1000ml，ph調(diào)至6，30℃，150rpm條件下?lián)u床過夜培養(yǎng)；

19、3)擴大培養(yǎng)：將步驟2)中種子液按1％比例接種至發(fā)酵培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基，30℃，150rpm條件下?lián)u床過夜培養(yǎng)至od600＝2.0；

20、4)制備菌劑：將步驟3)中發(fā)酵液采用無菌水進行稀釋至1×104cfu/ml，攪拌混勻，即為應用于降解煙葉淀粉的菌劑。

21、本發(fā)明通過淀粉平板法初篩能夠降解淀粉酶的路氏腸桿菌enterobacterludwigii?t977，其淀粉酶活高達23.5u/ml。本發(fā)明研究表示，采用路氏腸桿菌enterobacter?ludwigii?t977的發(fā)酵液，以1×104cfu/ml～3×104cfu/ml濃度按照50l～60l量/畝對田間生長云煙97旺長期煙葉進行噴施3次噴施后，其煙葉中的淀粉含量降低。

技術特征：

1.一種路氏腸桿菌t977，其特征在于，所述路氏腸桿菌t977的保藏編號：cctcc?m20232627。

2.根據(jù)權利要求1所述的路氏腸桿菌t977，其特征在于，所述路氏腸桿菌t977菌株的16s?rdna的核苷酸序列如seq?id?no：1所示。

3.一種權利要求1或2所述的路氏腸桿菌t977的分離方法，其特征在于，所述分離方法為：

4.一種權利要求1或2所述路氏腸桿菌t977在降解煙葉淀粉的應用，其特征在于，用于降解煙葉淀粉。

5.根據(jù)權利要求4所述的應用，其特征在于，路氏腸桿菌t977用于降解云煙97淀粉。

6.根據(jù)權利要求4或5所述的應用，其特征在于，用于降解煙葉淀粉的方法為：將路氏腸桿菌t977進行發(fā)酵培養(yǎng)，取發(fā)酵后的菌液對田間旺長期煙葉進行噴施。

7.根據(jù)權利要求6所述的應用，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基為：牛肉膏1.0g，乙酸銨0.25g，蛋白胨3.0g，氯化鈉5.0g，淀粉2.5g，自來水定容至1000ml，ph調(diào)至6。

8.根據(jù)權利要求6或7所述的應用，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)，路氏腸桿菌t977在培養(yǎng)基中添加質(zhì)量百分比為0.5％-1％，發(fā)酵條件為30℃-37℃，36-48h。

9.根據(jù)權利要求6所述的應用，其特征在于，所述噴施，以菌液1×104cfu/ml～3×104cfu/ml濃度按照50l～60l量/畝進行噴施。

10.根據(jù)權利要求6所述的應用，其特征在于，所述噴施，在采收前一個月開始噴，每隔10天噴施一次，烘烤采收前共噴施3次。

技術總結
本發(fā)明提供了一種路氏腸桿菌T977及其分離方法和在降解煙葉淀粉的應用，通過分離獲得的Enterobacter?ludwigii?T977，能夠降解煙葉淀粉，保藏編號：CCTCC?M?20232627，所述路氏腸桿菌T977已經(jīng)于2023年12月22日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，建議的分類命名為Enterobacter?ludwigii(Pantoea?agglomerans)。該菌株具有顯著的淀粉降解能力，對云煙97旺長期煙葉進行噴施后，其鮮煙葉和烤后煙葉中部葉和上部葉中的淀粉含量降低，操作簡便，效果顯著，為降解煙葉淀粉降解提供更多高效選擇。

技術研發(fā)人員：高琴,董祥洲,程廷明,趙利梅,朱啟法
受保護的技術使用者：安徽皖南煙葉有限責任公司
技術研發(fā)日：
技術公布日：2024/10/10